Name: Un modèle novateur In Vitro de Blast traumatisme crânien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez un modèle in vitro de lésion cérébrale traumatique par blast utilisant un tube de choc à air comprimé sur des coupes d'hippocampe de souris. Cette méthode permet un criblage rapide des agents neuroprotecteurs.

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Soutenu par : Centre Royal de médecine de la défense, Birmingham, Royaume-Uni, Royal British Legion Centre for Blast blessure études, Imperial College London, United Kingdom. Medical Research Council, London, United Kingdom (MC_PC_13064 ; MR/N027736/1). La sécurité gaz Trust, Londres, Royaume-Uni. Rita Campos-Pires a été le récipiendaire d’une bourse de formation doctorale de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Lisbonne, Portugal. Katie Harris a reçu une bourse de doctorat de la Westminster Medical School Research Trust, Londres, Royaume-Uni.
Ce modèle a été développé avec le soutien de la Royal British Legion Centre pour les études de blessure Blast (RBLCBIS) à l’Imperial College. Nous tenons à souligner l’appui financier de la Royal British Legion. Chercheurs intéressés de collaborations ou de plus amples renseignements peuvent communiquer avec les auteurs ou les RBLCBIS.
Nous remercions Dr Amarjit Samra, directeur de recherche du Centre Royal de défense médecine, Birmingham, Royaume-Uni, pour soutenir ce travail, Scott Armstrong, département de chirurgie et Cancer, Imperial College London, assistance avec des expériences préliminaires , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, département de génie biologique Imperial College London, William Proud, département de physique Imperial College de Londres, pour obtenir des conseils sur le tube de choc, Raquel Yustos, technicien, ministère de la recherche des Sciences de la vie, Imperial College London, responsable support technique, Paul Brown MBE, atelier et Steve Nelson, technicien d’atelier, département de physique de l’Imperial College de Londres, pour rendre le métal anneaux, Neal Powell du département de physique, Imperial College London, de œuvres d’art.

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Parmi tous les mécanismes des lésions associées à explosion TBI (mécanismes de blessure explosion primaire, secondaire et tertiaire), principal blessures blast sont unique à un traumatisme de l’explosion et c’est le moins compris des mécanismes associés à blast1,2 . Le nouveau protocole décrit ici a été développé pour étudier l’explosion primaire TBI en utilisant un tube de choc à composition non limitée pour exposer en vitro cultures tranche hippocampe de souris à une seule onde de choc à l’aide d’un protocole simple et rapid qui permet la création d’un reproductible blast primaire TBI avec un débit élevé.
La première en vitro explosion primaire TBI modèles appliqués ondes de pression hydrostatique à cellules26,27. Toutefois, la sortie de pression modèle pas la fonction de Friedlander comme la durée d’une impulsion de pression hydrostatique était beaucoup plus longue que blast aéroporté surpression vagues13. La caractéristique Friedlander fonction peut être facilement modélisée en laboratoire au moyen d’un choc tube1,8. Le tube de choc peut produire des ondes de choc qui simulent des explosions de terrain dégagé de réelles dans un environnement de laboratoire classiques, tout en permettant un contrôle précis des paramètres de l’onde, comme surpression maximale, la durée de l’onde positive et impulsion, en faisant varier la matériau et épaisseur et le pilote volume8,28,29.
Simple in vitro des modèles tels que les cultures de cellules manquent habituellement de l’hétérogénéité des types de cellules et la connectivité synaptique30. Récemment, l’effet de souffle sur cellule du cerveau in vitro « sphéroïdes » intégrant les différents types de cellules a été étudié31. Une enquête plus poussée de ces préparations intéressantes est justifiée ; Cependant, il n’est pas clair comment leur organisation cellulaire et la connectivité reflète le cerveau intact. CSST sont un bien établie in vitro modèle expérimental23,32, sont faciles à la culture et de leur tissu tridimensionnel cytoarchitecture, la différenciation cellulaire et la connectivité synaptique sont bien conservées et très semblable à celui en vivo33,34,35,36. OHSCs représentent un niveau intermédiaire de complexité entre culture cellulaire et une en vivo modèle23,32. OHSCs ont été démontrées à reproduire in vitro neurodégénératives pathologique cascades vus dans des modèles in vivo et ont été très utiles au contrôle des médicaments neuroprotecteurs potentiels et dans la compréhension de leurs mécanismes de action17,21,22,37,38. Enfin, la zone anatomique étudiée, l’hippocampe, est très pertinente dans les études translationnelles de TBI, car cette région est souvent endommagée dans TBI patients39,40,41. CSST ont servi à blast modèle TBI28,42,43,44, toutefois, notre modèle est relativement simple et peut être adaptée aux chocs-tubes existants soit horizontal ou vertical configurations sans adaptations complexes.
CSST peut être maintenue en culture pendant plusieurs jours, qui facilite l’étude des processus biologiques au fil du temps,34. Dans ce modèle, les lésions résultant de l’exposition de l’onde de choc a été mesurée par jour pendant trois jours, suite à l’exposition de souffle à l’aide de l’iodure de propidium, un marqueur bien établi des dommages cellulaires. L’iodure de Propidium est un colorant fortement polaire non toxique qui pénètre dans les cellules avec les membranes cellulaires compromis, où il se lie aux acides nucléiques et présente une fluorescence rouge vif caractéristique24,25,45. La fluorescence mesurée avec l’iodure de propidium a démontré avoir une bonne corrélation avec la numération lésé à l’aide de Nissl coloration46,47.
Étant donné que la blessure produite dans ce modèle était diffus (Figure 2), la fluorescence de la tranche entière a été mesurée lors de l’exécution de l’analyse, similaire aux travaux déjà publié dans autres cerveau lésions paradigmes21,22 , au lieu d’utiliser des régions spécifiques, comme l’a fait l’autre en vitro blast TBI modèles28,43,44,48. L’approche globale utilisée dans le modèle décrit dans cet article élimine également la variabilité qui est introduite lorsque décrivant régions d’intérêt définies et fournit une image plus complète de la lésion liée au souffle. Les surpressions pic onde de choc, 50 kPa et 55 kPa, produit significatif (p < 0,05 et p < 0,0001, respectivement) blessures par rapport aux tranches de sham (Figure 2B). Comme prévu, l’onde de choc avec la surpression maximale plus élevée, 55 kPa, a causé des lésions plus que la vague de 50 kPa. Un modèle in vitro avec cerveau isolé tissu exposé directement à une onde de choc, comment avec précision à l’échelle de l’organisme entier ou un être humain n’est pas simple. Néanmoins, nous avons utilisé de l’onde de choc s’est dans l’intervalle des surpressions pic observé sur le terrain, généralement 50 – 1 000 kPa8,49.
Afin de maintenir le CSST exposé à des niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone et température physiologique tout en s’assurant qu’ils sont exempts de contamination dans tout le protocole d’exposition onde de choc, les inserts de culture de tissu ont été scellées dans stérile sacs de polyéthylène suivant une technique aseptique, immergée dans un milieu expérimental chauffé à 37 ° C et fraîchement barboter avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, de même aux travaux déjà publiés28,43,44 ,48. Contrairement à ces modèles où les dispositifs complexes étaient utilisées pour conserver les sacs stériles pendant l’exposition de l’onde de choc, dans ce protocole, une méthode rapide et simple a été utilisée pour suspendre les inserts de culture cellulaire CSST en face de la sortie de tube de choc (Figure 1 a, C ). Le modèle décrit dans le présent document permet un traitement rapide et un débit élevé, tout en minimisant le risque d’hypothermie. Ces aspects sont particulièrement pertinents pour les études de neuroprotection étant donné que certaines interventions thérapeutiques peuvent avoir une fenêtre de temps très limité du potentiel d’application après le TBI. Ce protocole d’exposition nouvelle onde de choc permet de 6 à 9 vitroplants insère (généralement de 36 à 54 organotypique hippocampe tranches de tissus) pour être exposé à une onde de choc dans un court intervalle de temps (environ 1 h).
Les OHSCs besoin bonne asepsie tout au long. Il est important d’utiliser une hotte à flux laminaire aseptique tout au long de la mise en culture et lors du transfert vers les sacs stériles pour l’explosion. Afin de réaliser l’imagerie tranche dans des conditions aseptiques avec les couvercles des plaques 6 puits en place, les anneaux en métal sur mesure nous permet de soulever les inserts de culture cellulaire pour le plan focal du microscope. Une partie importante de notre protocole, c’est que nous incluons des tranches de sham indemne dans chaque expérience. Tranches de trompe-l'œil sont traités identiquement aux tranches de souffle à l’exception que le tube de choc n’est pas déclenché ; une autre étape importante est que toutes les tranches sont imagés 1 h avant l’accident ou traitement simulé, pour s’assurer que la santé de la population de tranches utilisées sont identiques (Figure 2 b).
En plus de la quantification des lésions des cellules dans les tranches au fil du temps, le tissu peut être fixé à la fin de l’expérience pour immunohistochemistry classiques50. Nous avons développé et évalué la méthode à l’aide de tranches d’hippocampe de souris. Cependant, notre technique pourrait être facilement adapté à utiliser d’autres tissus que l'on peut cultiver dans la culture, tels que la moelle épinière, rétine, pulmonaire ou tissu épithélial. Dans cet article et nos travaux antérieurs avec le modèle, nous avons ne étudié que l’effet de l’exposition à une seule émission. Toutefois, le modèle serait bien adapté pour étudier les effets d’explosions répétées de bas niveau sur le cerveau ou d’autres tissus. OHSCs peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs semaines voire des mois, ce qui permet des effets chroniques, être l’objet d’une enquête.
Modèles in vitro , étant plus simples que les modèles in vivo , ont un débit plus élevé, sont moins coûteux et expériences peuvent habituellement être complétées sur une échelle de temps plus court17. Toutefois, les résultats obtenus à l’aide des modèles in vitro doivent être validées dans des modèles animaux in vitro culture de tissus sont conservés dans un environnement artificiel et peuvent répondre à l’injure différemment de ce qu’ils le feraient en vivo17. Néanmoins, des modèles in vitro ont été extrêmement précieuses pour améliorer notre compréhension du cerveau cascades de blessures et en dépistage de médicaments neuroprotecteurs avant l’utilisation des plus complexes en vivo modèles17,22 , 51 , 52. malgré les nombreux avantages offerts par ce modèle, il est important de noter que les modèles in vitro n’ont pas la clé caractéristiques du TBI présent chez les animaux et en vivo modèles, tels que les effets sur le système vasculaire, augmenté intracrânienne pression, réponse immunitaire systémique et atteinte fonctionnelle comportementale, qui met en évidence la nécessité de valider les résultats dans des modèles in vitro chez l’animal entier. Néanmoins, en vitro modèles tels que le modèle décrit dans cet article sont extrêmement utiles outils scientifiques pertinents translationnelle.
En conclusion, cet ouvrage décrit une nouvelle méthode simple et directe, où les cultures de tissus hippocampiques souris organotypique sont exposés à étroitement contrôlés et reproductibles réelles pertinentes des ondes de choc à l’aide d’un tube de choc de laboratoire. Le préjudice global, qui a été quantifié à l’aide de l’iodure de propidium, un marqueur bien établi des dommages cellulaires, est très reproductible et est proportionnel à la surpression de la crête de l’onde de choc appliquée.

Lésion cérébrale traumatique de Blast (TBI) est un type complexe de lésions cérébrales résultant de l’explosion d’engins explosifs1,2. Blast TBI est devenue un important problème de santé au cours des 15 dernières années, avec les récents conflits militaires en Irak et en Afghanistan,2,3. Globalement, on estime qu’entre 4,4 % et de 22,8 % des soldats de retour d’Irak et d’Afghanistan ont souffert des TBI doux, une grande partie d'entre elles étant liées au souffle, avec un taux plus élevé rapporté de blast TBI dans les forces américaines contre les forces du Royaume-Uni4 ,,5.
L’utilisation d’engins explosifs a été responsable de la majeure partie du traumatisme lié à l’explosion, y compris blast TBI, endurée par les forces militaires6. La détonation d’une charge explosive se traduit par une très rapide — mais transitoire — augmentation de la pression, se produisant en millisecondes. L’onde de surpression résultant d’une explosion de champ libre de la vie réelle est modélisée par la fonction de Friedlander, avec une hausse soudaine de la surpression maximum suivie d’une décroissance exponentielle7,8. La gamme des forces extrêmes et leur évolution rapide vu lors d’une manifestation de l’explosion ne sont pas généralement expérimentés en traumatismes non-blast1,9. La surpression de pointe, c'est-à-dire la pression maximale de l’onde et la durée de l’onde positive sont soupçonnés d’être des contributeurs importants à une lésion cérébrale blast et ceux-ci dépendent de la charge explosive et la distance de la détonation de10, 11.
Le traumatisme que les résultats d’une explosion explosive est classé comme quatre composants discrets, désignés comme l’explosion primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des blessures10,12,13,14. Chacune de ces composantes est liée à des mécanismes spécifiques de blessure. Blast primaire préjudice est le résultat de l’action directe de l’onde de surpression sur les organes et tissus2,13. Résultats de blessure explosion secondaire de l’impact des fragments de projectiles, provoquant pénétrante et non pénétrantes plaies2,15. Blast tertiaire lésions se produisent lorsque le corps de la victime est déplacé contre le sol ou les objets environnants et est associé à l’accélération/décélération forces1,10,13. Blessure de blast quaternaire décrit un groupe hétérogène de blessures directement liées à l’explosion ne relevant ne pas de la première trois blessure mécanismes décrits12,13. Il inclut (mais n’est pas limité à) lésion thermique, inhalation de fumée, rayonnement, ondes électromagnétiques et des effets psychologiques négatifs13,15. La plupart TBI associée à explosion résulte directement des trois premiers mécanismes de blessures, tandis que les mécanismes du quaternaire des blessures de blast sont généralement associés aux lésions systémiques13. Les effets des forces d’accélération/décélération (p. ex., coup du lapin), émousser et pénétrant de traumatisme crânien ont été intensivement étudiés par rapport à d’autres types de TBI (p. ex., collisions de véhicules automobiles, chutes, blessures balistique). Toutefois, l’onde de surpression de choc primaire est unique à l’injure de l’explosion et ses effets sur les tissus cérébraux sont beaucoup moins bien compris16. Les mécanismes de blessure explosion primaire, associées à une onde de surpression, sont les premiers des forces mécaniques pour interagir avec le cerveau.
Nombreux modèles précliniques de TBI ont été développés durant les dernières décennies qui ont été très précieux pour comprendre les mécanismes TBI souffle de blessures et de physiopathologie et étudier de nouveaux traitements potentiels, qui seraient autrement impossibles à faire exclusivement dans les cliniques définissant le17,18,19. Bien qu’aucun modèle préclinique ne peut reproduire la complexité des traumatismes crâniens blast clinique, généralement différents modèles précliniques de TBI répliquent des aspects distincts de TBI humaine. L’action nuisible des forces associées à une explosion de souffle peut être étudiée isolément ou en combinaison dans les modèles TBI blast fois in vitro et in vivo . In vitro les modèles ont l’avantage de permettre un contrôle strict de l’environnement expérimental (tissu conditions physiologique et biomécanique de la blessure), qui réduit la variabilité biologique et améliore la reproductibilité, permettant l’étude des moléculaires spécifiques des cascades sans les variables confusionnelles présentes dans les animaux modèles20. Notre objectif était de développer un modèle in vitro afin d’étudier les effets d’explosion primaire sur le tissu cérébral. L’étude visait à élaborer un modèle avec une onde de choc supersonique avec un représentant de forme d’onde de Friedlander d’une explosion de champ libre tel que celui produit par un engin explosif improvisé (IED).

<table><tbody><tr><td>Geys solution saline équilibrée</td><td>Sigma UK</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma UK</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique/antimycosique</td><td>Sigma UK</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium Eagle</td><td>Sigma UK</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Hanks solution saline équilibrée</td><td>Sigma UK</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Sigma UK</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma UK</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Prolabo, Belgique</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma UK</td><td>S-0945</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture tissulaire</td><td>Millicell CM 30 mm faible hauteur Millipore</td><td>PICM ORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>NUNC, Danemark</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma UK</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Sacs stériles en polyéthylène - Twirl’em sacs d’échantillons stériles</td><td>Fisherbrand</td><td>01-002-30</td><td></td></tr><tr><td>Portex Avon Kwill Tube de remplissage 5" (127 mm)</td><td>Smiths Medical Supplies</td><td>E910</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>NIKON Eclipse 80i, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif de microscope</td><td>Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre de microscope</td><td>Nikon G-2B (émission passe-long)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Film isolant électrique Mylar, 304 mm x 200 mm x 0,023 mm</td><td>RS Components UK</td><td>785-0782</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression</td><td>Dytran Instruments Inc.</td><td>2300V1</td><td></td></tr><tr><td>Hachoir</td><td>à tissus Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, Royaume-Uni.</td>Broyeur <td></td><td>de tissus Mcllwain</td></tr><tr><td>Élastomère</td><td>de silicone Dow Corning, États-Unis</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de graphiques et de statistiques</td><td>GraphPad Software, États-Unis</td><td>Prism 7.0</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle novateur in vitro de blast traumatisme crânien

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatisme crânien est des principales causes de décès et d’invalidité chez les populations civiles et militaires. Blast traumatisme cérébral blessures résultats depuis l’explosion d’engins explosifs, cependant, les mécanismes qui sous-tendent les lésions cérébrales résultant de l’exposition de surpression de souffle ne sont pas entièrement comprises et sont considérés comme propres à ce type de lésion cérébrale. Les modèles précliniques sont des outils essentiels qui contribuent à mieux comprendre les lésions cérébrales induite par l’explosion. Un modèle TBI roman in vitro blast a été développé en utilisant un tube de choc à composition non limitée pour simuler des vagues de vie réelle explosion de plein champ modélisées par l’onde de Friedlander. Hippocampe organotypiques souris C57BL/6N ont été exposés à des ondes de choc unique et le développement des lésions a été caractérisé jusqu'à 72 h à l’aide d’un marqueur fluorescent bien établi des lésions cellulaires que seul, l’iodure de propidium pénètre les cellules avec compromis les membranes cellulaires. Fluorescence de l’iodure de Propidium a été significativement plus élevé dans les secteurs exposés à une onde de choc par rapport aux tranches d’imposture pendant toute la durée du protocole. Les lésions du cerveau sont très reproductible et proportionnelle à la surpression de la crête de l’onde de choc appliquée.

Le tube de choc utilisé dans cette méthode permet la génération des transitoires de surpression qui simulent des explosions réelles plein champ modélisées par la fonction de Friedlander7,8. Une onde de choc supersonique avec une vitesse de 440 m/s (Mach 1,3) ont été obtenus (Figure 2 a). Les données de forme d’onde signalées provient du capteur 2, placé radialement à la fin de la section entraînement du tube de choc.
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, hippocampe par organotypiques exposés à une seule onde de choc (Figure 2 a) développent lésion significative quantifiée à l’aide d’un colorant fluorescent hautement polaire qui seulement pénètre dans les cellules avec l’iodure de propidium compromis les membranes cellulaires24,25 (Figure 2 b, C).
Même dans des conditions optimales et conformément aux autre CSST publièrent modèles21,22, il y a un faible niveau de fluorescence de l’iodure de propidium fond due, en partie, aux dégâts mineurs causés par le tissu inhérente des manipulations ( comme les changements de médias pendant la période de culture ou de la suppression de l’incubateur pour l’imagerie). Cette explosion protocole TBI implique la manipulation substantielle qui inclut la submersion des tranches dans un milieu à l’intérieur des sacs stériles et un degré considérable de manipulation pendant le protocole d’exposition onde de choc (e.g., serrage les sachets stériles pour la cadre de porte). Toutefois, si toutes les mesures sont effectuées avec soin, cette manipulation supplémentaire n’a pas un impact sur la santé sous-jacente de la CSST comme les voyait aucune différence significative entre un groupe témoin de tranches conservés dans les plaques 6 puits en permanence (i.e., les inserts ne sont pas submergées ou manipulés) et du groupe fictif, qui comprenait des tranches qui ont été submergés dans des sacs stériles fixés au tube de choc (Figure 2 b).
Les deux ondes de choc choisis, à 50 kPa et surpression de pointe 55 kPa, produit significatif (p &lt; 0,05 et p &lt; 0,0001, respectivement) et reproductible blessures par rapport à l’imposture blessé tranches à tous les points de temps après l’exposition souffle protocole (Figure 2 b) sans causer de dégâts pour les inserts de culture cellulaire ou les sacs stériles. Afin de déterminer la sensibilité du modèle aux petites différences en crête-surpression, nous avons décidé de sélectionner des valeurs différentes de ~ 10 %. Ces résultats montrent aussi que, comme prévu, le dommage résultant de 55 kPa est supérieur à celui après une onde de choc de 50 kPa.
Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type de la moyenne. Signification a été évaluée à l’aide d’une 2 voies à mesures répétées analyse de la variance à l’aide de test post hoc de Holm-Sidak. Facteur 1 était groupe (contrôle, imposture, explosion) et facteur 2 était temps après la blessure (-1 h, 24h, 48 h et 72 h), où le facteur 1 est le facteur répété. L’ajustement de la valeur de p pour les comparaisons multiples a été utilisé. Les valeurs de P de moins de 0,05 ont été prises pour indiquer une différence significative entre les groupes. Les tests statistiques ont été réalisés à l’aide d’un progiciel de statistiques et de graphiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg"> Figure 1 : schéma de l’appareil de tube de choc avec le bâti de sac stérile. (A). le tube de choc est un tube en acier inoxydable longue 3,8 m, en trois sections de 1,22 m de long, reliées par des joints et brides, avec un diamètre intérieur de 59 mm. médaillon (B) montre l’assemblage culasse double. Un ou deux diaphragmes de Mylar peuvent être bridés à l’Assemblée avec joint fourni par joints toriques en caoutchouc. Cadre de porte sac stérile (C). Le corps du cadre se compose de deux plaques de métal avec un trou circulaire centré (59 mm de diamètre) qui s’aligne avec la sortie de tube de choc. Deux feuilles minces (4 mm) en élastomère de silicone sont montés entre les deux plaques de métal. Le but de ces fiches est de fournir une surface plane et non glissante pour fixer les sacs stériles. La distance entre le sac et la sortie du tube de choc est de 7 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg"> Figure 2 : shockwave typique et le préjudice qui en résulte organotypique hippocampal slice cultures. (A) exemple représentatif de l’onde de choc obtenue à l’aide de 23 µm d’épaisseur film polyester, 2.16 bar pression d’éclatement 55 10,1 kPa·ms impulsion, durée de la vague positive de 0,4 ms, surpression maximale kPa. Données de forme d’onde ont été extraites d’un capteur 2 monté radialement sur la bride distale du tube choc piloté par section. La vitesse de l’onde de choc a été de 440 m/s (Mach 1,3). (B) le développement des lésions est proportionnelle à l’intensité de l’onde de choc. Fois 50 kPa et 55 kPa pic surpression des ondes de choc causé un préjudice important développé dans tout le protocole de 72 h en comparaison avec le groupe fictif. Le dommage résultant d’une exposition de vague 55 kPa pic surpression était significativement plus élevé après 50 kPa à 48 h et tranches de 72 h. Sham ont été traités identiquement aux tranches de souffle mais tube à choc n’était pas déclenché. Tranches de contrôle ont été maintenues dans 6 assiettes bien dans un incubateur sans aucune manipulation. Barres représentent les valeurs moyennes et les barres d’erreur sont les écarts-types (n = 7, contrôles ; n = 48, sham ; n = 30, souffle 50 kPa ; n = 51, souffle 55 kPa ; n = nombre de tranches, des 6 expériences distinctes). * p &lt; 0,05, *p &lt; 0,0001 comparé avec l’imposture. # p &lt; 0,05, #p &lt; 0,01 par rapport à l’explosion 55 kPa. (C) représentant propidium iodure fluorescence images de tranches organotypique de sham (i), (ii) souffle 50 kPa et (iii) souffle 55 kPa groupes à 72 h après une blessure. La tranche de simulacre montre de faibles niveaux de fluorescence, c’est à dire., blessure et l’explosion des tranches exposées montrent des niveaux élevés de lésion diffuse, plus prononcé sur la tranche de surpression exposée de pointe 55 kPa (barre d’échelle = 500 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article décrit un nouveau modèle de traumatisme crânien de blast primaire. Un tube de choc conduit d’air comprimé est utilisé pour exposer en vitro cultures tranche hippocampe de souris à une seule onde de choc. Il s’agit d’un protocole simple et rapid, générant une lésion tissulaire de cerveau reproductible avec un débit élevé.

Un modèle novateur In Vitro de Blast traumatisme crânien

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions cérébrales traumatiques préjudiciables à l’explosion et peut être utilisée pour dépister les médicaments neuroprotecteurs avant l’utilisation de modèles Vivo plus complexes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un instrument de laboratoire pour exposer le tissu cérébral de masse in vitro à une onde de choc à l’aide d’un protocole de débit simple et élevé qui permet la création d’une lésion reproductible. Tout d’abord, insérez des anneaux stériles en acier inoxydable sur mesure dans les puits d’une plaque de six puits.Ajouter ensuite un milieu expérimental sans sérum préchauffé avec de l’iodure de propidium aux puits en veillant à ce que le niveau de milieu n’atteigne pas au-dessus de l’encoche de l’anneau. Transférer la plaque à l’incubateur pendant une heure pour s’assurer que le milieu est à 37 degrés Celsius avant que les inserts de culture tissulaire ne soient transférés. Après une heure, transférer les inserts de culture tissulaire avec des tranches organotypiques de leurs plats de croissance sur les anneaux dans l’assiette de six puits.Faites un point sur la jante d’insertion dans la position de trois heures avec un stylo marqueur permanent pour faciliter le retour des inserts à sa position d’origine, puis étiquetez chaque plaque de six puits avec un nom unique et la date et faire une carte des puits de chaque plaque, nommant chaque puits avec une lettre et chaque tranche dans le puits avec un nombre de sorte que chaque tranche a un identificateur unique. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour s’assurer que les tranches sont à 37 degrés Celsius immédiatement avant l’imagerie. Une heure après le transfert vers un milieu expérimental, évaluez la santé des tranches en imagerie rapide de chaque tranche individuellement et séquentiellement sous faible puissance.Utilisez un microscope à fluorescence muni d’un filtre d’excitation et d’émission approprié idéalement dans une pièce sombre ou une pièce à faible lumière. Gardez le couvercle sur la plaque lors de l’imagerie. Une certaine condensation peut s’accumuler à l’intérieur du couvercle.Si cela se produit, utilisez brièvement un sèche-cheveux sur le réglage bas à l’extérieur du couvercle. Assurez-vous que les conditions d’imagerie sont identiques à différents jours et entre les expériences. À la ligne de base, les tranches saines montrent très peu de taches fluorescentes.Les tranches qui présentent des zones de coloration rouge dense indiquent une viabilité compromise et devraient être exclues d’une analyse plus approfondie. À titre de comparaison, la fluorescence de la tranche blessée par explosion à 72 heures est indiquée ici. Immédiatement après l’imagerie, retirez un insert de culture tissulaire de la plaque de six puits et transférez soigneusement l’insert dans un sac stérile en polyéthylène contenant 20 millilitres de milieu expérimental préchauffé bouillonné avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.Retirez soigneusement les bulles d’air et scellez le sac stérile en tordant le dessus et en appliquant une pince en plastique. Assurez-vous que chaque sac stérile est correctement étiqueté avec la plaque et l’identification du puits. Après avoir transféré chaque insert de culture tissulaire dans un sac stérile individuel, placez les sacs et les six plaques de puits avec milieu expérimental dans l’incubateur de 37 degrés Celsius.Après une heure, emballez soigneusement les sacs stériles avec les inserts de culture tissulaire dans des boîtes en plastique à l’intérieur d’une boîte thermique réglementée remplie d’eau ionisée à 37 degrés Celsius. L’eau doit maintenir les tranches organotypiques à température physiologique tout au long du protocole d’exposition aux ondes de choc. Portez des bottes de protection à ornées d’acier, un manteau de laboratoire et des gants pendant la préparation du tube de choc et de l’exposition aux ondes de choc.Utilisez une tige de blanchissage pour boulonner le cadre stérile du porte-sac à la bride distale tube de choc assurant que le trou central est aligné avec la sortie du tube de choc. Le capteur un, un transducteur de pression, est situé dans la partie centrale de la section entraînée, et le capteur deux se trouve dans la bride distale du tube de choc. Connectez ces transducteurs de pression à un oscilloscope à travers une unité d’alimentation source actuelle et allumez l’oscilloscope.Assurez-vous que la valve solénoïde et le contrôle du débit du tube de choc sont fermés, puis ouvrez la ligne d’air comprimé externe et chargez la valve solénoïde à 2,5 barres. Ouvrez la soupape de sécurité du cylindre d’air comprimé et ouvrez lentement le régulateur de pression pour augmenter la pression à environ cinq barres. Ensuite, préparez des diaphragmes en coupant 23 feuilles de polyester épaisses de micron en carrés de 10 par 10 centimètres carrés.Préparez les poignées à partir de ruban autoclave et collez-les au haut et au bas de chaque diaphragme. Placez un diaphragme dans la brèche et assurez-vous qu’ils sont centrés. Ensuite, serrez le diaphragme à l’aide de quatre boulons et écrous M24.Façonnez-les séquentiellement d’une manière symétrique diagonale tout en veillant à ce que les diaphragmes soient exempts de rides. Serrez un sac stérile en position verticale sur le cadre du support en veillant à ce que la surface de la culture tissulaire insérée avec les tranches hippocampiques organotypiques soit orientée vers la sortie du tube de choc et que l’insert de culture tissulaire soit centré à l’intérieur du sac stérile. Pour la configuration du double diaphragme, la pression d’éclatement dépend du différentiel de pression de gaz entre le conducteur et la chambre de double brèche.Par conséquent, pour que les diaphragmes éclatent de manière contrôlée, la soupape de sécurité double brèche est ouverte manuellement une fois que les pressions de la cible sont atteintes. Mettez sur les défenseurs de l’oreille et les lunettes de sécurité si elle n’est pas déjà portée. Fermez la valve solénoïde.Allumez l’unité d’alimentation source actuelle pour obtenir les données d’onde de choc. Manipulez le bouton de commande d’écoulement sur le panneau de commande de tube de choc pour pressuriser lentement la section de volume de conducteur du tube de choc pour la configuration simple de diaphragme ou la section de volume de conducteur et la section double brèche du tube de choc pour la configuration double de diaphragme. Dès que le diaphragme se rompt, a rapidement fermé le flux d’air comprimé à l’aide du bouton d’écoulement et d’ouvrir la valve solénoïde.La combinaison idéale de paramètres d’onde de choc devrait être suffisante pour causer des lésions tissulaires, mais pas si élevé qu’il provoque l’insertion de la culture tissulaire ou la distorsion ou la rupture stérile sac. Après avoir exposé chaque tranche à une seule onde de tube de choc, retournez-la immédiatement à la boîte thermiquement réglée. Ensuite, prenez le sac stérile suivant de la boîte et serrez-le sur le cadre du support.Effectuez l’interrupteur en douceur et rapidement pour empêcher le refroidissement du milieu expérimental, car des températures inférieures à 37 peuvent nuire au développement des blessures. Une fois que tous les inserts de culture tissulaire ont été exposés à une onde de choc ou à un protocole factice, retournez les inserts de culture tissulaire à leurs puits dans la plaque originale de six puits et retournez à l’incubateur jusqu’à nouvel ensemble. Cette image est un exemple représentatif d’une onde de choc obtenue à l’aide d’un film polyester de 23 microns d’épaisseur avec une surpression de pic kilopascal de 55 kilopascales.La vitesse de l’onde de choc était de 440 mètres par seconde. Les ondes de choc de surpression de crête de 50 et 55 kilopascal ont causé des dommages significatifs qui se sont développés tout au long du protocole de 72 heures par rapport au groupe factice. La blessure résultant d’une exposition aux ondes de surpression de pointe de 55 kilopascales était significativement plus élevée qu’après 50 kilopascal à 48 heures et 72 heures, démontrant que le développement de la blessure est proportionnel à l’intensité de l’onde de choc.Cette image montre une tranche 72 heures après une explosion de 50 kilopascales. Un niveau élevé de blessures diffuses est visible. Les blessures sont plus prononcées après un pic de surpression de 55 kilopascal.Cette image de fluorescence d’iodure de propidium montre une tranche organotypique d’une expérience simulée. La tranche factice montre de faibles niveaux de fluorescence. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une technique aseptique partout pour éviter la contamination du tissu et pour manipuler les cultures de tissu rapidement mais très doucement pour éviter des dommages involontaires de cellules.Après cette procédure, d’autres méthodes comme la coloration par immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme quels sont les mécanismes de la mort cellulaire impliqués dans des lésions cérébrales traumatiques induites par l’explosion? Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la neuroprotection d’explorer le potentiel des médicaments pour prévenir la propagation de la mort cellulaire et des tissus cérébraux après l’exposition aux ondes de choc.

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Dans cette vidéo, un dispositif à tube de choc est utilisé pour générer une onde de choc en rompant un diaphragme en polymère par pressurisation contrôlée. L’onde de choc impacte les tranches de cerveau contenues dans un sac sécurisé, induisant des lésions traumatiques à la tranche de cerveau.

Induction d’une lésion traumatique dans une tranche de cerveau à l’aide d’un dispositif à tube de choc

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