Name: Subaigus Microhemorrhages cérébrales induites par l’Injection de lipopolysaccharides chez le rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Découvrez une méthode d'induction de microhémorragies cérébrales chez le rat Sprague-Dawley par injection de LPS. Ce protocole permet d'étudier la pathogenèse inflammatoire et la barrière hémato-encéphalique.

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Nous remercions le professeur Jian Feng Lei et ses collègues de l’Université de médecine de Capital pour un guidage de MRI. Nous remercions également Jing Zeng du département de neurologie, hôpital de Yichang populaire deuxième pour fournir un soutien technique.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) de l’hôpital général d’armée PLA et animalier.
1. les matériaux
<ol><li>Préparation de l’injection de la LPS<ol>
<li>Ajouter 25 mL d’eau distillée à 25 mg de poudre de LPS dérivé de Salmonella typhimurium , à une concentration finale de 1 mg/mL. Stocker l’injection dans un tube stérile à 4 ° C. ATTENTION : LPS est toxique.</li>
		<li>Préparer une solution EB 2 % dans une solution saline normale 0,9 % à garder une injection d’EB à concentration de travail.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. les animaux
<ol><li>Administrer les LPS à des rats Sprague-Dawley (SD) mâles, âgés de 10 semaines (poids moyen : 280 ± 20 g) par injection intrapéritonéale. ATTENTION : Si les rats sont achetés auprès d’une autre organisation, puis la phase d’adaptation ne doit pas être inférieur à 7 jours.</li>
</ol>3. Injections de LPS
<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale LPS tous les rats à une dose de 1 mg/kg et retourner les rats à la cage de leur maison. Remarque : L’anesthésie n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Six heures plus tard, injecter la même dose d’injection de LPS dans les rats.</li>
	<li>Seize heures plus tard injecter la même dose de LPS dans les rats. ATTENTION : Injection de rats SD avec LPS à une dose de 1 mg/kg peut entraîner un taux de mortalité de 5 %. Le taux de mortalité pourrait augmenter encore en rats plus jeunes ou plus âgés ou des rates gravides.</li>
	<li>Regagner leurs cages les rats après injection de LPS et fournir un accès à la nourriture et de boisson ad libitum . NOTE : Rats exposera une réponse inflammatoire systémique distincte, et il est donc essentiel que les cages restent propres tout au long de l’expérience. Rat devrait être fréquemment (2 x jour) surveillance des poids, aspect général et l’attitude après la première injection de LPS. Si les rats commencent à exposer une posture voûtée, la réticence à se déplacer, la perte de poids significative (> 20 %), porphyrine coloration qu’ils être humainement euthanasiés avant le jour 7 EB étude de point de terminaison.</li>
</ol>4. le prélèvement
<ol><li>Injection de EB<ol>
<li>Sept jours après la première injection, anesthésier le rat par voie intrapéritonéale selon votre protocole IACUC approuvé.</li>
		<li>Attendre 1 à 2 min jusqu'à ce que les rats ne montrent pas les réponses réflexes cornéens. Effectuer un 5 à 8 mm-perforation cardiaque profond sur chaque rat ; le point perforation devrait être de 5 mm sur la marge gauche du sternum à l’espace intercostaux 3e et 4e.</li>
		<li>Attendez jusqu'à ce que la récupération du sang est observée et ensuite injecter EB à une dose de 0,2 mL/100 g de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche. ATTENTION : Ponction cardiaque et l’EB injection doivent être effectuées avec soin. EB pourrait être injecté dans la cavité thoracique ou péricarde au lieu du ventricule cardiaque gauche.<ol>
<li>Sucer avec un tube vide et remplacer ce volume avec un tube EB avant l’injection pour aider à réduire le taux d’échec (e.g., injection à la cage thoracique par erreur).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Garder le rat dans une position couchée pendant 10 min. Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé pour détecter une fuite d’EB en imagerie de l’immunofluorescence, alors cette étape peut être omise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observation de brute<ol>
<li>Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacée 1 M saline du tampon phosphate (PBS) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.<ol>
<li>À l’aide d’un scalpel, faites une incision abdominale sur toute la longueur du diaphragme.</li>
			<li>Coupe à travers les côtes justes à gauche de la médiane de la cage thoracique.</li>
			<li>Ouvert vers le haut de la cavité thoracique. Utilisez des attaches pour exposer au cœur et à faciliter l’écoulement de sang et autres fluides.</li>
			<li>Tout en maintenant constamment le cœur avec une pince (cœur devrait encore être battu), directement insérer une aiguille dans la partie saillante du ventricule gauche à l’étendre à environ 5 mm. fixer l’aiguille à cette position de serrage près du point d’entrée. ATTENTION : Ne vont pas excessivement l’aiguille, car il peut percer la paroi intérieure et la circulation des solutions de compromis.</li>
			<li>Relâcher la valve pour permettre à la solution de PBS glacee débit (200 à 300 mL) à un rythme lent et régulier, à environ 20 mL/min à l’aide d’une pompe à perfusion. Si les animaux ont besoin de fixation au lieu de l’observation brute, puis utiliser la même dose de glacee 0,9 % solution saline.</li>
			<li>À l’aide de ciseaux pointus, faites une incision dans l’atrium, veiller à ce que la solution s’écoule en continu. Si le liquide ne s’écoule pas librement ou provenance des narines ou la bouche de l’animal, repositionner l’aiguille.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Écran pour CMHs par observation brute. Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé dans le calcul du nombre de CMHs par observation brute, alors cette étape peut être omise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixation<ol>
<li>Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacee 0,9 % solution saline (200 à 300 mL) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.</li>
		<li>Effectuer des perfusions cardiaques à l’aide de paraformaldéhyde glacée de 4 % pour la fixation.</li>
		<li>Décapiter le rat, d’isoler le cerveau et immergez le cerveau dans la solution de saccharose de 20 % pendant au moins 6 h.</li>
		<li>Changez la solution à 30 % de saccharose et de fixer un autre 6 h.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 10 sections de tissus de cerveau mm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.</li>
</ol>5. il a une coloration
Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de l’il.
<ol><li>Laver les lames dans l’eau distillée.</li>
	<li>Tache dans la solution de l’hématoxyline pendant 8 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.</li>
	<li>Différencier dans 1 % d’alcool acide pour 30 s. lavage à l’eau courante pendant 1 min.</li>
	<li>Détachant à 0,2 % d’eau ammoniaque (bleuissement) ou saturée au lithium carbonate solution pendant 30 s à 1 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.</li>
	<li>Rincer à l’alcool à 95 % (10 dips).</li>
	<li>Contre-colorant avec solution d’éosine pendant 30 s à 1 min.</li>
	<li>Déshydrater à travers de l’alcool à 95 %, deux changements d’alcool absolu, de 5 min chacun.</li>
	<li>Claire dans le xylène pendant 30 s.</li>
	<li>Montez à l’aide de la méthode9 de Liu.</li>
	<li>Analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence fond clair. NOTE : culots globulaires, libéré des vaisseaux sanguins, qui sont les constituants de CMHs, figurent en rouge-orangé il coloration sous.</li>
</ol>6. bleu de Prusse de Perl coloration
Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de Perls.
<ol><li>Les lames avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Une coloration en solution de réaction avec mélange de parties égales de ferrocyanure et acide chlorhydrique pendant 10 min.</li>
	<li>Déshydrater, effacer, monter et d’analyser les diapositives comme décrit aux points 5.7 – 5.10.</li>
</ol>7. EB double coloration
Remarque : Cette procédure suit étape 4.1.3.
<ol><li>Les lames avec du PBS trois fois de 5 min chacun.</li>
	<li>Incuber les lames avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver les lames avec une solution de PBS trois fois de 5 min chacun et monter les lames avec une solution de PBS-glycérol.</li>
	<li>Analyser les images sur un microscope à fluorescence. Les dépôts de EB sont indiquée par une fluorescence rouge ; les noyaux sont indiqués par fluorescence bleue.</li>
</ol>8. IRM-SWI
<ol><li>Effectuer MRI sur un aimant 7-T équipé d’un système de gradient activement blindé (diamètre intérieur de 16 cm).</li>
	<li>Sept jours après le traitement, anesthésier les rats par inhalation d’un masque de 1,5 à 2,0 % isoflurane, à l’aide d’un système d’anesthésie isoflurane.</li>
	<li>Pommade vétérinaire sur les yeux du rat pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.</li>
	<li>Gardez les rats en position couchée et effectuer un balayage de MRI-SWI.</li>
	<li>Obtenir des scans SWI pondérée à l’aide d’une séquence d’écho de spin rapide utilisant les paramètres suivants : écho temps (TE) 8 ms, répétition (TR) du temps 40 ms, flip angle = 12°, champ de vision (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice acquisition 384 × 384, afin d’acquérir 1 tranches de mm d’épaisseur.</li>
	<li>Identifier CMHs dans MRI-SWI selon Greenberg et al. 11, qui comprenait les critères suivants : (1) de diamètre ≤ 10 mm et taches d’intensité (2) circulaire, isolé et faible signal.</li>
	<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les rats en utilisant la méthode de dioxyde de carbone (un débit de 6 L/mn) ou 30 % du volume contenant de surdosage.</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Études de recherche sur CMHs ont augmenté au cours des dernières années. Toutefois, le mécanisme de CMHs reste peu clair, ce qui incite les chercheurs à établir des modèles animaux qui simulent cette condition particulière. Par exemple, Hoffmann et al. mis au point un modèle de souris CMHs induite par l’hypoxie qui montre que CMHs sont causées par l’hypoxie et la perturbation de l’autorégulation cérébrovasculaire12. Reuter et al. 5 a établi un modèle CMHs ...

Classiques microhemorrhages cérébrales (CMHs) Voir périvasculaires minuscules dépôts de produits de dégradation du sang comme l’hémosidérine de globules rouges dans le cerveau1. Selon l’étude de Scan de Rotterdam, CMHs figurait dans près de 17,8 % des personnes âgées de 60 à 69 ans et 38,3 % dans ceux de plus de 80 ans2. La prévalence de CMHs chez la personne âgée est relativement élevée, et une corrélation entre l’accumulation de CMHs et dysfonctionnement cognitif et neuropsychiatrique a été établi3,4. Plusieurs modèles animaux de CMHs ont récemment été rapportés, y compris les modèles de rongeurs induites par le type IV collagénase stéréotaxiques injection5, APP transgéniques6, exposition de β-N-methylamino-L-alanine,7et8de l’hypertension, avec CMHs induites par l’inflammation systémique comme l’un des choix plus reconnus. Fisher et al. 9 d’abord utilisé LPS dérivés de Salmonella typhimurium pour élaborer un modèle de souris CMHs aiguë. Par la suite, le même groupe a signalé l’élaboration d’un modèle de souris CMHs subaiguë en utilisant la même approche2.
LPS est considéré comme une stimulus inflammatoire normalisés par injection intrapéritonéale. Des études antérieures ont confirmé qu’injection LPS pourrait causer la neuro-inflammation telle que reflétée par les grandes quantités de cellules microgliales et activation des astrocytes dans les animaux modèles2,10. En outre, une corrélation positive entre l’activation de l’activation de la neuro-inflammation et le nombre de CMHs a été établie2,10. Se fondant sur ces études antérieures, nous a invités à élaborer un modèle de rat CMHs par injection intrapéritonéale de LPS.
Les progrès dans la détection technologies ont entraîné une augmentation du nombre de recherches sur CMHs. Le plus largement reconnu de méthodes de détection CMHs incluent la détection de globules rouges par l’hématoxyline et éosine (HE), coloration, détection de fer ferrique de bleu de Prusse coloration9, détection des Evans blue des dépôts par immunofluorescence (EB) imagerie et 7,0 Tesla imagerie par résonance magnétique-susceptibilité pondérée d’imagerie (MRI-SWI)10. La présente étude vise à développer une méthode de dépistage CMHs.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>pour l’induction de l’inflammation</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>pour la détection des fuites</td></tr><tr><td>EB Solution de teinture DAPI</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>milieu de comptage pour IF</td></tr><tr><td>Perl' s Coloration prussienne</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Kit pour coloration prussienne</td></tr><tr><td>Coloration HE</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>Kit pour coloration HE</td></tr> hydrate <tr>de<td>chloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>phosphate tampon salin (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>une sorte de solution tampon couramment utilisée dans l’expérience solution</td></tr><tr><td>saline</td> <td>à 0,9 %Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Chine</td><td></td><td>solution pour perfusion</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>un type de solution couramment utilisé pour la fixation Solution de</td></tr><tr><td>saccharose à 20 %</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>un type de solution couramment utilisé pour la fixation Solution de</td></tr><tr><td>saccharose à 30 %</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>un type de solution couramment utilisé pour la fixation</td></tr><tr><td>pommade vétérinaire</td><td>Solcoseryl eye gel, Bacel, Suisse</td><td></td><td>pour la protection des yeux de rat</td></tr></tbody></table>

subaigus microhemorrhages cérébrales induites par l’injection de lipopolysaccharides chez le rat

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Microhemorrhages cérébrales (CMHs) sont fréquentes chez les patients âgés et sont corrélées aux divers troubles neuropsychiatriques. L’étiologie de CMHs est complexe et neuro-inflammation est souvent observé comme une cooccurrence. Nous décrivons ici une subaiguë CMHs modèle de rat induit par l’injection du lipopolysaccharide (LPS), mais aussi une méthode de détection injection systémique LPS CMHs. est relativement simple, économique et rentable. Un avantage majeur de l’injection du LPS est sa stabilité pour induire une inflammation. CMHs provoquées par injection LPS pouvaient être décelées par l’observation brute, hématoxyline et éosine (HE) coloration, de Perl souillure Prusse, marquage double bleu Evans (EB) et une technologie d’imagerie (MRI-SWI) sensibilité à la résonance magnétique pondérée. Enfin, les autres méthodes d’élaboration de modèles animaux CMHs, y compris leurs avantages ou désavantages, sont également abordées dans ce rapport.

CMHs peuvent être détectées en utilisant diverses approches. Les méthodes plus reconnus sont les suivants : (1) brut d’observation et d’évaluation de surfaces CMHs (illustré à la Figure 1, panneau supérieur) ; (2) il a une coloration pour la détection des culots globulaires (illustré à la Figure 2 a, panneau supérieur) ou prussien coloration ferrique détection dérivé de la lyse des globules rouges (Figure 2 a...

Nous présentons un protocole pour induire et détecter CMHs provoquées par injection de LPS chez le rat Sprague-Dawley, qui peut être utilisé à l’avenir des recherches sur la pathogénie de CMHs.

Subaigus Microhemorrhages cérébrales induites par l’Injection de lipopolysaccharides chez le rat

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de micro-hémorragie cérébrale tels que l’étiologie, la distribution, et la détection de la micro-hémorragie cérébrale et ainsi de suite. Le principal avantage de cette technique est que les injections de LPS provoquent une inflammation. De plus, l’injection de LPS est assez simple, économique et rentable.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’induction cérébrale d’hémorragie, elle peut également être appliquée à d’autres désordres de cerveau tels que la dépression, la schizophrénie, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, et la maladie de prion. Administrer le LPS à une dose d’un milligramme par kilogramme de poids corporel aux rats sprague dawley mâles de 10 semaines par injection intrapénitale, puis retourner chaque rat dans la cage à la maison. Répétez l’injection de LPS après six heures et 16 heures.Veuillez noter que l’injection de LPS aux rats SD à une dose d’un milligramme par kilogramme peut entraîner une mortalité de 5 %. La mortalité pourrait encore augmenter chez les rats plus jeunes ou plus âgés ou les rats femelles enceintes. Retournez les rats dans leurs cages après l’injection de LPS, et fournissez à ad libitum l’accès à la nourriture et aux boissons.Sous anesthésie terminale, effectuer une ponction cardiaque profonde de cinq à huit millimètres sur chaque rat. Le point de perforation doit être de cinq millimètres à la marge gauche du sternum aux troisième et quatrième espaces intercostals. Maintenez l’aiguille en place et remplacez le tube vide par un tube contenant du bleu Evans.Attendez que la récupération sanguine soit observée, puis injectez evans bleu à une dose de 0,2 millilitres par 100 grammes de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche. Gardez le rat en position supine pendant 10 minutes si vous évaluez la fuite bleue d’Evans par la barrière du sang et de la cervelle par imagerie par immunofluorescence. Effectuer des perfusions cardiaques à l’aide de glace froide 200 à 300 millilitres de solution saline de 0,9% pour effacer la vascularisation cérébrale et le cerveau.Passez au paraformaldéhyde glacé à 4 % pour la fixation. Puis, après avoir isolé le cerveau, immerger dans 20% saccharose dans PBS pendant au moins six heures ou jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube. Changez la solution en saccharose à 30% et fixez-la pendant encore six heures.Enfin, préparez des sections de tissu cérébral de 10 millimètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Lavez les diapositives avec PBS trois fois pendant cinq minutes chacune, puis incuber les diapositives avec 4, 6'diamidino-2-phenylindole ou DAPI solution pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les glissières dans PBS comme avant, monter les diapositives avec la solution PBS-glycérol.Capturez des images au microscope à fluorescence. Le dépôt d’EB est indiqué par fluorescence rouge, les noyaux sont indiqués par fluorescence bleue. Commencez à colorer h&e en lavant les toboggans dans de l’eau distillée.Puis plonger dans la solution d’hématoxyline pendant huit minutes. Alternativement, pour la coloration bleue prussienne perl, tache dans la solution de réaction avec le mélange à parts égales de ferrocyanure et d’acide chlorhydrique pendant 10 minutes. Après coloration, laver l’eau courante du robinet pendant cinq minutes.Différencier en 1% d’alcool acide pendant 30 secondes. Après le lavage dans l’eau courante du robinet pendant une minute, colorer dans 0,2% d’eau ammoniac ou de solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 secondes à une minute. Ensuite, laver dans l’eau courante du robinet pendant cinq minutes.Contre-tache avec solution d’éosine pendant 30 secondes à une minute. Déshydrater à 90% d’alcool, puis 95% d’alcool, et l’alcool absolu pendant 0,5 à deux minutes chacun. Après déshydratation, clair dans le xylène pendant 30 secondes.Après montage, analysez la coloration H&E à l’aide d’un microscope à fluorescence brillant. Les globules rouges libérés par les vaisseaux sanguins, qui sont des composants des CMH, apparaissent en rouge-orange sous la coloration H&E. Les CMH de surface peuvent être détectés par observation brute comme indiqué par les flèches rouges.La coloration bleue Evans révèle une fluorescence rouge visible où des molécules bleues Evans ont fui d’une barrière céphalo-céphalo-encéphalique blessée. La coloration H&E montre des globules rouges trouvés à l’extérieur des capillaires, et la coloration prussienne révèle des points d’ions ferriques dérivés de la lyse des globules rouges. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la dose de LPS pour induire la micro-hémorragie cérébrale est plus grande que celle utilisée dans la maladie de Parkinson ou le modèle de schizophrénie.Par conséquent, l’environnement des animaux doit être maintenu propre pour réduire le taux de mortalité. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie électronique, la formation image de résonance magnétique, et la formation image immunofluorescente pourraient être exécutées pour déterminer les dommages à la structure externe de la barrière hémato-encéphalique dans la micro-hémorragie cérébrale, la distribution des micro-hémorragies cérébrales dans le parenchyme de cerveau in vivo, aussi bien que l’activation de cellules gliale.

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Détection de microhémorragies cérébrales dans un modèle de rat

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Modélisation encéphalopathie de prématurité Utilisation prénatale hypoxie ischémie avec un lipopolysaccharide intra-amniotique chez le rat

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Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Découvrez une méthode d'induction de microhémorragies cérébrales chez le rat Sprague-Dawley par injection de LPS. Ce protocole permet d'étudier la pathogenèse inflammatoire et la barrière hémato-encéphalique.

Subaigus Microhemorrhages cérébrales induites par l’Injection de lipopolysaccharides chez le rat

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