Name: Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez l'isolation des cellules T CD4+ et l'analyse des sous-ensembles cTfh par cytométrie en flux à six couleurs à partir de sang périphérique humain. Cette méthode rapide permet l'évaluation des biomarqueurs de progression de maladie.

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Le travail a été soutenu par une subvention de leucémie UK ETB et MJA.

Des échantillons de sang ont été prélevés des sujets normaux (NS) (n = 12) ainsi que des patients atteints de lymphome (MZL) de la zone marginale (n = 7) et d’autres types de cellules B lymphome non hodgkinien-(BNHL) (FL 6 patients, 2 patients de lymphome lymphoplasmocytique et 1 bas grade B-cellule lymphome non-hodgkinien non précisés patient). Les patients ont été recrutés dans les cliniques d’hématologie à Leicester Royal Infirmary, après avoir donné a informé, le consentement écrit, avec l’approbation éthique mis en place pour toutes les études. Approbation éthique a été obtenue par le Leicestershire, Northamptonshire et Rutland recherche éthique comité 1 référence 06/Q2501/122 pour les échantillons de patients et de l’autorité HRA (Health Research Authority) NRES Comité East Midlands-Derby, référence 14/EM/1176 pour sujets normaux.
1. isolement des CD4+ lymphocytes du sang périphérique ensemble
<ol><li>Prendre du sang périphérique (2 à 15 mL) en K les2tubes EDTA par ponction veineuse standard et processus dès que possible pour maintenir la viabilité maximale. Remarque : Utiliser l’équipement de protection individuelle standard de laboratoire (manteau, gants, lunettes) et réaliser les travaux dans une enceinte de sécurité biologique II de classe.</li>
	<li>Apporter le sang et tous les réactifs nécessaires (CD4+ enrichissement cocktail, 2 % fœtale bovine sérique/tamponné phosphate salin (FBS/PBS), média gradient de densité et congélation moyen si la cryoconservation des cellules) à température ambiante.</li>
	<li>Mélanger le sang avec un cocktail disponible dans le commerce des anticorps pour l’enrichissement des CD4 humain+ des cellules T. Utilisez 50 µL de réactif pour chaque 1 mL de sang. Utiliser un tube en polypropylène conique de 50 mL pour 5 à 15 mL de sang. Remarque : Si à l’aide de 2 à 4 mL de sang, effectuez cette étape dans un tube en polypropylène conique 14 mL.</li>
	<li>Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Diluer le mélange avec un volume égal de 2 % FBS/PBS</li>
	<li>
Couche de ce mélange dilué sur le dessus de la média de gradient de densité lentement pour éviter de déranger l’interface et de procéder à une centrifugation immédiatement pour éviter la diffusion du sang dans le milieu de gradient de densité.
	<ol>
<li>Pour 2 à 3 mL de sang, utiliser 3 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond conique 14 mL, mais 4 ml de sang, utiliser 4 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique 14 mL et de 5 à 15 mL de sang , utiliser 15 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger le mélange de couches pendant 20 min à 1 200 g avec le frein au large à 20 ° C. Remarque : Une température inférieure à l’environnement peut entraîner la contamination par les globules rouges et des granulocytes. Une vitesse inférieure provoquera le CD4+ échec du processus d’isolement. Laissant la pause engagée diminuera le rendement cellulaire. Utiliser une centrifugeuse de paillasse albums avec rotors qui peuvent être fermés pour éviter les aérosols.</li>
	<li>Supprimer le CD4 enrichi+ couche de cellules à partir de l’interface à l’aide d’une pipette Pasteur. Remarque : La couche de cellules enrichi ressemblera à une norme « couche leuco-plaquettaire » des cellules nuageux blancs, mais comme seulement CD4+ les cellules sont présentes, ce sera naturellement plus petites et plus difficiles à voir.</li>
	<li>Ajouter 2 % FBS/PBS pour le CD4 des cellules jusqu'à un volume total de 10 mL et puis laver deux fois avec 2 %+ FBS/PBS par centrifugation pendant 10 min à 400 x g lors de chaque lavage.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 2 % FBS/PBS et comte les cellules colorent avec un colorant vital (le bleu trypan) pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité.</li>
	<li>Étape facultative : remettre en suspension de 5 x 105 à 1 x 106 cellules de congélation moyen (10 % diméthylsulfoxyde dans FBS) en aliquotes de 1 mL. Remarque : Niveaux de certains marqueurs de surface peuvent être modifiés par cryo-préservation et du dégel. Il est donc très important que tous les échantillons sont systématiquement traités. Afin de minimiser les différences dans les variables de l’analyses, les échantillons ont été cryoconservés et par lot pour analyse dans la présente étude.</li>
</ol>2. cytométrie en flux
<ol><li>Décongeler le CD4 cryoconservés+ cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C et lavage une fois dans préchauffé moyen (RPMI 1640 + L-glutamine, additionné de 10 % de SVF et 1 x pénicilline-streptomycine).</li>
	<li>Ajouter les cellules dans 9 mL de milieu, centrifuger pendant 5 min à 400 x g et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS (50 µL) afin que chaque condition à tester utilise entre 5 x 10,5 et 1 x 106 cellules.</li>
	<li>Mélanger les cellules avec du tampon de coloration (50 µL). Remarque : Tampon de tache brillante empêche divers artefacts de coloration qui peuvent interférer avec l’analyse des données, lorsque deux ou plusieurs taches de BV ou BUV sont utilisés en même temps en raison des propriétés chimiques intrinsèques de ces colorants. Dans des conditions simples ou non colorées, les 50 µL de tampon de tache brillante peut être substituée à 50 µL de 1 % BSA/PBS.</li>
	<li>Ajouter les anticorps aux cellules (selon le « volume utilisé » colonne dans le tableau 1) et incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois chez 1 % BSA/PBS par centrifugation pendant 3 min à 600 x g lors de chaque lavage.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 1 % BSA/PBS (400 µL) et transférez dans un tube d’acquisition de cytométrie de flux.</li>
	<li>Vortex les cellules doucement avant d’acquérir des données sur un cytomètre en flux :</li>
</ol>3. régulateur de mise en place et les contrôles de la cytométrie en flux
<ol><li>En utilisant un échantillon non coloré, définissez photodiode tensions afin que les lymphocytes se distingues des débris évident et les cellules mortes (événements avec zone de diffusion (SSC) côté haut et faible dispersion vers l’avant (FSC))16. À l’aide de simples échantillons colorés, régler photomultiplicateur (PMT) tensions afin que la fluorescence positive peut discerner de fluorescence de fond tout en s’assurant que tous les événements relèvent de l’échelle détectable. Remarque : Une amélioration consisterait à tracer CV contre les surtensions du PMT pour chaque PMT à l’aide de perles faiblement fluorescents pour trouver la tension minimale pour optimiser la résolution (la méthode « Peak 2 »19).</li>
	<li>Compte de chevauchement spectrale en générant une matrice de compensation à l’aide de simples taches avec des perles de capture. Ajouter les perles de l’indemnisation disponible dans le commerce (60 µL) et billes de contrôle négatif (60 µL) à 1 % BSA/PBS (100 µL) et vortex. Remarque : Les perles de capture utilisés doivent correspondre à l’espèce hôte et IgG isotype de l’anticorps utilisé. La matrice de la compensation devrait être recalculée si le numéro de lot de n’importe quel tandem colorants changements, car ils peuvent afficher une variabilité considérable dans leurs spectres d’émission entre les lots.</li>
	<li>Ajouter un seul anticorps (20 µL) et vortex.</li>
	<li>Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 200 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 1%BSA/PBS (500 µL) et vortex.</li>
	<li>Acquérir l’échantillon avec un cytomètre en flux à l’aide du générateur de matrice de rémunération désigné dans le logiciel d’acquisition selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Utiliser les contrôles FMO pour guider le placement des portes pour fluorescence marqueur positif tenir compte des déversements de colorant, qui est la principale source de fluorescence de fond dans les expériences à l’aide de ≥ 4 couleurs16. Suivez la coloration de surface cellulaire générale du protocole tel que décrit à l’étape 3, mais pour chaque condition, omettre l' un des fluorophores de l’étape de coloration (où CD45RA est omis, également omettre la tache de vivre/morts). 100 000 lymphocytes pour chaque condition de l’acquisition.</li>
	<li>Définir la positivité porte à ≤0. 5 % des cellules. Voir la Figure 2 pour obtenir un exemple illustré des contrôles de la FMO.</li>
</ol>4. analyse des données
<ol><li>Employer le logiciel d’acquisition du cytomètre définir un seuil de 5 000 unités sur le paramètre FSC d’exclure les débris de très petite taille.</li>
	<li>Utiliser une grille d’arrêt en vue d’acquérir 10 000 cellules cTfh (CD4+ CD45RA– CXCR5+). Remarque : L’utilisateur individuel peut recueillir plus de 10 000 cellules. Ce nombre était un compromis entre la collecte suffisamment de cellules pour fournir des résultats significatifs et le temps nécessaire à la collection.</li>
	<li>À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de SSC-zone de dot, dessinez une ellipse ou polygone porte pour sélectionner la population de lymphocytes, tout en excluant les débris et ouvertement la mort des cellules (événements avec un SSC-région haute et basse FSC-zone).</li>
	<li>À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de FSC-largeur dot, dessiner un polygone gate pour sélectionner des cellules individuelles tout en excluant les doublets (les doublets ont une superficie accrue mais largeur semblable aux cellules individuelles).</li>
	<li>À l’aide d’une superficie de FSC / marqueur CD45RA et viabilité point intrigue, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner direct, CD45RA– (cellules avec une fluorescence faible pour ce marqueur).</li>
	<li>À l’aide d’une superficie de FSC / CD4 point intrigue, dessiner une porte rectangulaire pour sélectionner CD4+ (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).</li>
	<li>En utilisant un CD4 / CXCR5 point tracé, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner CXCR5+ (c.-à-d. cTfh) des cellules (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).</li>
	<li>À l’aide d’un CXCR3 / CCR6 terrain de dot, placez une quadruple gate à subdiviser les cellules cTfh cTfh1, 2 et 17 (cellules qui sont hautes et basses pour chaque marqueur). Remarque : Les cellules avec le phénotype CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ sont mal caractérisé. Nous appelons ces cellules cTfh1/1718 parce que les cellules T helper classique (CD4+ CXCR5–) qui sont en transition entre l’expression voir la Th17 et Th1 de CXCR3 et CCR6 et ont été décrits comme cTfh1/1719.</li>
	<li>À l’aide d’un histogramme de PD-1, utilisez l’outil de la gamme pour subdiviser les cellules cTfh (ou si l'on préfère, les cTfh1 individuels, sous-ensembles 2, 17 ou 1/17) en PD-1-/ + ou le Salut des populations. Remarque : La distinction entre PD-1+ et PD-1Salut n’est pas bien définie dans la littérature. Le seuil a été fixé comme la même intensité de PD-1, nécessaire pour la détection des vÃ © ritable Tfh dans des suspensions de lymphocyte humain amygdale utilisant l’écoulement cytometry avec le même panneau d’anticorps. Alternativement, un marqueur d’ICOS peut être ajouté du panel d’anticorps, comme seules PD1Salut cellules sont ICOS+.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole représente un moyen simple et efficace pour analyser les cellules du sang périphérique cTfh, permettant la détection de tous les sous-ensembles pertinentes identifiées jusqu'à présent dans la littérature. Des échantillons de sang peuvent procurer facilement et efficacement comme partie du standards cliniques ambulatoires et des échantillons de la série peut être collecté en parallèle avec les données cliniques. À son tour, cela permet des études prospectives évaluant cTfh sous-ensembles comme biomarqueurs po...

T-folliculaires cellules auxiliaires (Tfh) sont un CD4+ sous-ensemble de cellules T qui était initialement définie dans les tissus lymphoïdes1. Ces cellules expriment PD-1 et des récepteurs de surface CXCR5, sécrètent IL-21 et IL-4 et show nucléaire expression de BCL-62,3, le facteur de transcription. Comme leur nom l’indique, ils sont trouvent dans les centres germinatifs et sont essentielles pour haute affinité anticorps production1.
Les réponses de Dysregulated Tfh ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie, notamment une maladie auto-immune, où ils favorisent l’expansion des cellules de lymphocytes B4. Ils jouent également un rôle dans le microenvironnement tumoral de solide5,6 et cancers lymphoïdes7. À l’inverse, des anomalies génétiques, des protéines de surface indispensables pour Tfh fonctionnent comme résultat de costimulator (ICOS) T-cell inductible de syndromes d’immunodéficience humaine8. CD4+ CXCR5+ cellules dans le sang périphérique humain sont appelés lymphocytes auxiliaires T-folliculaire (cTfh) en circulation et sont censées être le compartiment de la mémoire des cellules Tfh en tissus9. Le but de la méthode décrite ici est l’analyse des sous-ensembles de cTfh suite CD4+ cellule d’isolement à partir d’échantillons de sang périphérique.
Plusieurs sous-ensembles cTfh ont été définis et l’efficacité avec laquelle ils fournissent aide de B-cellule diffère d’un sous-ensemble à un autre9,10,11,12. Les proportions relatives de ces sous-ensembles sont modifiées dans un certain nombre de maladies, la plupart en évidence une maladie auto-immune dans laquelle il est presque toujours une augmentation relative la plus fonctionnelle PD-1+ / Salut ou cTfh2 ou cTfh17 des sous-ensembles en comparaison avec le moins Functional PD-1– et/ou de sous-ensembles de cTfh112. L’ampleur de ces changements souvent associé avec des paramètres cliniques, y compris les titres de l’activité et les auto-anticorps maladie, indiquant un rôle potentiel de distribution sous-ensemble cTfh comme biomarqueur pronostique dans la maladie, qui pourrait refléter l’activité de Tfh dans les tissus lymphoïdes9,12,13,14. En outre, prélever des échantillons de sang des participants est rapide, sécuritaire et acceptable et donc permet série suivi pour l’analyse de la progression de la maladie ou la réponse au traitement.
L’utilisation de CD4 isolé+ T-cellules sur des suspensions de cellules mononucléées (PBMNC) traditionnels circulants permet à plus haut débit écoulement cytometry des expériences en réduisant le temps nécessaire pour acquérir un nombre substantiel de cellules cTfh pour analyse. C’est particulièrement utile lorsque le tri des cellules provenant de sous-ensembles cTfh rare qui utilise les flux activé la cellule triant (FACS). Pour l’efficacité de l’aide, ces suspensions peuvent être cryogénisées pour activer le « dosage » d’échantillons pour être utilisé dans l’expérience de cytométrie de flux. Sur les tests, les CD4+ pureté n’a pas été réduite par cryoconservation.
Alors que les différents marqueurs différents laboratoires utilisés pour classer les cellules cTfh dans les premiers stades de leur découverte, la méthode présentée ici utilise un schéma unifié de deux groupes de marqueurs de surface cellulaire tel que proposé par Schmidt et al.12, 15 pour permettre l’identification simultanée des cTfh et leurs sous-ensembles reconnus neuf dans un seul écoulement cytometry expérimenter.
Comme seuls marqueurs de surface de cellules sont utilisées, les cellules ne nécessitent pas de fixation ou la perméabilisation et peuvent ainsi rester en vifs pour des études fonctionnelles en aval. Cela pourrait être facilité par la cellule de tri à l’aide de FACS avec le même panneau d’anticorps. Ce panneau pourrait être élargi afin d’inclure d’autres marqueurs, permettant à des restrictions du cytomètre en flux utilisé.
L’analyse d’expériences de cytométrie en flux multi-color peut être difficile en raison de la nature intrinsèquement subjective de blocage sur des parcelles de dot 2-dimensionnel, surtout lorsque populations cellulaires n’ont pas une distribution bimodale clair en fluorescence de marqueur, comme c’est le Etui pour cTfh cellules et de leurs sous-ensembles. Pour cette raison, il est impératif de mettre en place des contrôles efficaces pour réduire les artefacts pour permettre la meilleure résolution des populations et pour définir le déclenchement des stratégies en toute confiance. Ainsi, les anticorps panneau conception et la mise en place de contrôles de base pour un écoulement cytometry experiment, c'est-à-dire, à l’aide de la compensation et FMO contrôles sont décrites à l’étape 3.4.2 et 3.4.3,respectively.
Toutes les cellules cTfh sont définis comme CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Le niveau d’expression du marqueur d’activation Tfh caractéristique PD-1 peut décider pour identifier les sous-ensembles de PD-1-, PD-1+ ou cellulesSalut cTfh PD-1. Puis, en utilisant une combinaison des récepteurs de chimiokine CXCR3 et CCR6, qui sont exprimés de façon traditionnelle Th1, 2 ou 17 cellules, cTfh peuvent être caractérisées comme cTfh1, 2 ou 17-like par un profil de CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- et CXCR3– CCR6+, respectivement.
Le panneau des anticorps utilisé par notre laboratoire est affiché dans le tableau 1. L’utilisateur peut avoir à adapter leur sélection de fluorophore pour tenir compte pour le laser et la configuration de filtrage de la lumière disponible sur leur cytomètre de flux local.
Les considérations suivantes influent sur le choix des fluorophores. Utilisez des fluorophores lumineux lorsque c’est possible. En particulier, utilisez les plus brillants fluorophores disponibles sur les marqueurs plus sombre (moins fortement exprimés). Gradateurs marqueurs incluent PD-1, CXCR3 et CCR6 et dans une moindre mesure, CXCR5. Nous avons fait spécifiquement utiliser le nouveau BB, BV et BUV fluorophores qui offrent une luminosité et ainsi permettre une résolution plus facile des populations distinctes des cellules.
Étend la sélection de fluorophore sur les spectres d’émission autant que possibles réduire au minimum le chevauchement spectrale et donc le niveau de compensation nécessaire. Un outil gratuit et en ligne qui peut être utilisé pour aider à concevoir un panneau de cytométrie de flux peut être trouvé ici : http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Pour économiser l’espace sur le spectre d’émission, nous avons utilisé un « canal de décharge » en utilisant un colorant de la viabilité d’une longueur d’onde d’émission qui chevauche celui de APC-H7 (conjugué à CD45RA) afin de permettre la détection et exclusion des deux morts et/ou CD45RA+ en utilisant un détecteur unique.
Ici, un protocole est présenté pour l’isolation du sang périphérique CD4+ T-cellules et leur analyse ultérieure par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des différents et récemment décrite sous-ensembles en circulation.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Cocktail d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Souris anti-humaine CD183&nbsp ; Clone 1C6/CXCR3</td><td>BD Horizon</td><td>565223</td><td></td></tr><tr><td>BV711 Souris anti-humaine CD196 (CCR6)&nbsp ; Clone 11A9</td><td>BD Horizon</td><td>563923</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&nbsp ; Cloner&nbsp ; RF8B2</td><td>BD Horizon 562747</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BB515 Souris anti-humaine CD4&nbsp ; Cloner &nbsp ; RPA-T4</td><td>BD Horizon</td><td>564419</td><td></td></tr><tr><td>PE souris anti-humaine CD279&nbsp ; Clone MIH4</td><td>BD Pharmingen</td><td>557946</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Souris anti-humaine CD45RA Clone&nbsp ; HI100</td><td>BD Pharmingen</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes rouge lointain fixable, pour excitation 633 ou 635 nm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34973</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration brillant</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris Ig, &kappa ;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD CompBead</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 6.1.3</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td>Logiciel d’acquisition de cytomètre en flux</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>Treestar Inc.</td><td></td><td>Cytométrie en flux Logiciel d’analyse de données</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CXCR3</td><td>BD Horizon&nbsp ;</td><td></td><td></td>565223</tr><tr><td>Anticorps anti-CCR6</td><td>BD Horizon&nbsp ;</td><td></td><td></td>563923</tr><tr><td>Anticorps anti-CXCR5</td><td>BD Horizon&nbsp ;</td><td></td><td></td>562747</tr><tr><td>Anticorps anti-CD4</td><td>BD Horizon&nbsp ;</td><td></td><td></td>564419</tr><tr><td>Anticorps anti--1</td><td>BD Pharmingen&nbsp ;</td><td></td><td></td>557946</tr><tr><td>Anticorps anti-CD45RA</td><td>BD Pharmingen&nbsp ;</td><td></td><td></td>560674</tr><tr><td>marqueur de viabilité</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td>N° L34973</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cd4+ t-cellules et analyse de circulation folliculaire t helper (ctfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color flow cytometry

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrante activité folliculaire T des cellules d’assistance (Tfh) est détectable dans les maladies auto-immunes et leur présence est associée à des résultats cliniques lorsque le microenvironnement de ganglion lymphatique en cellules B lymphome non hodgkinien-est analysé. Sous-ensembles de circulation les cellules folliculaires-T helper (cTfh), le compartiment mémoire circulant de Tfh cellules dans le sang, sont également perturbées dans la maladie et représentent donc les potentiels nouveaux biomarqueurs prédictifs. Test basé sur sang périphérique est avantageuse car elle est relativement non invasive et permet la surveillance série simple. Cet article décrit une méthode pour isoler les CD4+ T-cellules de sang humain et une analyse plus approfondie par cytométrie en flux-énumérer les cellules cTfh et les proportions de leurs divers sous-ensembles (cTfhPD-1-/ + / hi, cTfh1, 2, 17 et cTfh1/17). Le niveau de ces sous-ensembles a ensuite été comparé entre les sujets normaux et de patients atteints de lymphome. Nous avons trouvé que la méthode était assez robuste pour obtenir des résultats fiables de matériel patient systématiquement recueilli. La technique nous décrivons pour l’analyse peut être facilement adaptée à la cellule de tri et d’applications en aval comme la RT-PCR.

CD4 élevé+ pureté a été réalisée en utilisant le CD4+ protocole d’isolement, qui était fiable dans l’ensemble de tous les échantillons de sang testé par nos soins (signifie : 96,6 %, SD : 2.38, n = 31) (Figure 3).
Identification du cTfh (CD4+ CXCR5+ cellules) chez un sujet normal représentatif est présenté (Figure 4A</...

Ici, un protocole pour l’isolement et la caractérisation des CD4+ T-cellule sous-ensembles de sang périphérique humain est décrite. Purifiée CD4+ T-cellules sont analysés par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des sous-ensembles de cellule auxiliaire T-folliculaire.

Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Cette méthode peut aider à démontrer les différences entre les sous-ensembles circulants de cellules d’aide t-folliculaire dans les états sains et maladie. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, que les échantillons peuvent être traités par lots et que les cellules restent vivantes pour une analyse fonctionnelle en aval. Cette technique facilite l’évaluation des sous-ensembles circulants d’aide t-folliculaire en tant que biomarqueurs pour la progression de la maladie car ils sont corrélés avec des marqueurs de sévérité clinique. Aider à la démonstration de cette procédure sera Dr.Lucia Pi

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Cette vidéo présente un protocole pour l’isolement par marquage magnétique d’une population à faible concentration de cellules T CD4+Vδ1+γδ à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). En utilisant une combinaison d’anticorps anti-Vδ1 conjugués à la FITC, de microbilles magnétiques anti-FITC et de billes superparamagnétiques enrobées d’anticorps anti-CD4, les lymphocytes T CD4+Vδ1+ peuvent être purifiés avec succès de la population PBMC.

Isolement sélectif de lymphocytes T CD4+ Vδ1+ γδ à partir de cellules mononucléées de sang périphérique humain

Cette vidéo présente une technique basée sur la cytométrie en flux utilisant deux fluorochromes pour identifier les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes T γδ, les lymphocytes B, les cellules tueuses naturelles (NK) et les monocytes dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). Lors de l’incubation des cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre les marqueurs de surface, les sous-ensembles cellulaires sont identifiés à l’aide d’une stratégie optimale...

Un test de cytométrie en flux pour identifier des sous-ensembles de cellules immunitaires dans des cellules mononucléées du sang périphérique

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

De nombreux systèmes expérimentaux ont été utilisés pour comprendre les mécanismes qui régulent la croissance et la fonction des lymphocytes T dans une réponse immunitaire. Ici, une approche génétique en utilisant la transduction rétrovirale est décrite, qui est économique, efficace du temps, et surtout, très instructif pour identifier les voies de régulation.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Cet article décrit la cytométrie spectrale, une nouvelle approche en cytométrie de flux qui utilise les formes des spectres d'émission pour distinguer fluorochromes. Un algorithme remplace compensations et peut traiter auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Cette nouvelle approche permet l'analyse correcte des cellules isolées à partir d'organes solides.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.

Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux

Présenté ici est un protocole pour mesurer la prolifération des cellules CD4T en réponse à des protéines antigéniques ou des peptides en utilisant la dilution des colorants. Cet analyse est particulièrement sensible aux rares lymphocytes T spécifiques à l'antigène et peut être modifié pour faciliter le clonage des cellules spécifiques à l'antigène.

Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Le présent protocole décrit un flux de travail expérimental qui permet l’analyse ex vivo de la stimulation des lymphocytes T humains dans un système de co-culture allogénique avec des cellules tumorales prétraitées.

Analyse de l’activité des lymphocytes T humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées

Isolement des lymphocytes utilisant le MAC Miltenyi kit est un moyen fiable pour purifier les cellules de l'ensemble des homogénats de tissu lymphoïde. Les cellules purifiées en utilisant le système Miltenyi sont typiquement ≥ 96% pur. Ici, on justifie les mesures prises pour isoler les cellules CD4 + T, l'une des nombreuses trousses offertes par Miltenyi.

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Découvrez l'isolation des cellules T CD4+ et l'analyse des sous-ensembles cTfh par cytométrie en flux à six couleurs à partir de sang périphérique humain. Cette méthode rapide permet l'évaluation des biomarqueurs de progression de maladie.

Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des CD4⁺ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

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