Haut débit mesure de Dictyostelium discoideum macropinocytose par cytométrie en flux

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du dictyostélium et de la macropinocytose, par exemple si un gène, une protéine ou une voie moléculaire particulière est impliqué dans la macropinocytose. Le principal avantage de cette technique est que de nombreuses variables telles que le temps, les mutations génétiques, les concentrations d’inhibiteurs et les compositions des milieux peuvent être testées en parallèle, ce qui donne des résultats d’une résolution unicellulaire. Pour commencer cette procédure, obtenez des cellules cultivées sur une gélose SM avec des bactéries comme indiqué dans le protocole de texte.

Récoltez les cellules du front d’alimentation dans 25 millilitres de tampon KK2 dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Vortex le tube pour dissocier les cellules et centrifuger à 300 G pendant trois minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 50 millilitres de tampon KK2 frais.

Répétez ce lavage trois fois en centrifugant, en éliminant le surnageant et en le remettant en suspension dans 50 millilitres de tampon KK2 pour chaque lavage. Après cela, utilisez un hémocytomètre ou un autre appareil de comptage cellulaire pour déterminer la densité cellulaire. Diluez les cellules dans un milieu HL5 contenant des antibiotiques à une concentration de 100 000 cellules par millilitre.

Pipeter 50 microlitres de la solution cellulaire diluée dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits, en utilisant trois puits pour chaque condition. Incuber à 22 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, diluez le TRITC-dextran à un milligramme par millilitre dans le milieu utilisé.

Ajoutez 50 microlitres dans chaque puits pour une concentration finale de TRITC-dextran de 0,5 milligramme par millilitre dans chaque puits. Incuber à 22 degrés Celsius pendant une heure. Pour commencer à préparer les cellules pour la cytométrie en flux, ajoutez 50 microlitres de milieu contenant du dextran aux commandes de mise à jour de zéro minute.

Ensuite, décantez le milieu de la plaque et séchez-le sur un mouchoir en papier. Lavez la plaque en la plongeant dans un tampon KK2 glacé, puis décantez le tampon de la plaque. Ajouter 100 microlitres d’une solution contenant de l’azoture de sodium glacé de cinq millimolaires dissous dans du KK2MC dans chaque puits.

Mesurez la mise à jour du liquide par cytométrie en flux comme indiqué dans le protocole textuel. Préparez une plaque de culture tissulaire fraîche à fond plat de 96 puits, comme décrit précédemment, avec trois puits pour chaque souche et condition. Pour une évolution temporelle typique, prévoyez de mesurer l’absorption de liquide à zéro, 30, 60, 90, 120 et 180 minutes.

Ajoutez 50 microlitres de milieu marqué au dextran dans les puits de points temporels de 180 minutes. 60 minutes plus tard, ajoutez du milieu marqué au dextor dans les puits de points temporels de 120 minutes. Continuez à ajouter le milieu de manière séquentielle pour toute l’assiette.

À zéro minute, ajoutez 50 microlitres de milieu contenant du dextran dans les puits de contrôle de zéro minute. Ensuite, décantez immédiatement le support. Lavez la plaque en la plongeant dans un tampon KK2 glacé, puis décantez le tampon de la plaque.

Analysez la plaque à l’aide de la cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole textuel. Préparez une plaque de culture tissulaire fraîche à fond plat de 96 puits, comme décrit précédemment, avec trois puits pour chaque souche et condition. Préparez un milieu contenant du dextran à une concentration d’un milligramme par millilitre.

Utilisez ce milieu pour diluer le composé d’intérêt à une concentration qui est le double de la concentration finale maximale souhaitée. Préparez ensuite un deuxième tube avec un milieu contenant du dextran dans la même proportion de véhicule. Mélangez les deux solutions par vortex.

Utilisez ces solutions pour créer une série de dilutions du composé d’intérêt dans 200 microlitres de milieu contenant du dextran par échantillon. Mélangez chaque échantillon par vortex. Ajoutez 50 microlitres de ce milieu à chaque échantillon.

Au bout d’une heure, décantez le milieu de la plaque. Lavez la plaque en la plongeant dans un tampon KK2 glacé, puis décantez le tampon de la plaque. Analysez la plaque à l’aide de la cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole textuel.

Les données représentatives de la cytométrie en flux montrent que lorsque le cytomètre n’est pas bloqué et que les profils de diffusion vers l’avant et latérale des cellules sont correctement réglés, les cellules peuvent être facilement distinguées. Lorsque l’on recherche des différences entre les mutants, il est probable qu’il y aura l’un des trois phénotypes. Les mutants pourraient avoir une absorption de liquide normale, ils pourraient avoir un défaut partiel ou l’absorption de liquide pourrait être complètement abolie.

L’absorption médiane moyenne de liquide est utilisée pour calculer le volume de liquide internalisé. Dans un cours temporel d’absorption de fluide, la fluorescence internalisée augmente pendant 60 à 90 minutes. Après quoi, le dextran commence à être exocytosé et un plateau est atteint.

L’absorption médiane moyenne de liquide est également utilisée lors de la comparaison des données avec un contrôle, par exemple lors du traitement de cellules avec des inhibiteurs efficaces contre la macropinocytose. Dans les cellules traitées, on constate que le dextran intériorisé en une heure diminue et tombe presque à zéro à des concentrations d’inhibiteurs plus élevées. Tous les inhibiteurs ne sont pas complètement efficaces, comme le nocodazole, qui n’inhibe que jusqu’à 50 % de l’absorption de liquide par macropinocytose.

Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la microscopie, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si l’absorption de liquide peut être différente dans une condition particulière, par exemple si les cellules à macropinocytose réduite produisent moins de macropinosomes ou plus petits.