Name: Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez la détection rapide du virus Zika par RT-LAMP dans l'urine, le sérum humain et les moustiques Aedes aegypti. Cette méthode isotherme sans extraction d'ARN offre un diagnostic fiable en 30 minutes.

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Ce travail a été soutenu par la contribution philanthropique familiale Maureen et Ronald Hirsch et champ Institut des Neurosciences, Sainte Marie de Michigan. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. Nous remercions également Mme Bernadette Zwaans et Elijah Ward pour leur examen critique du manuscrit.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de la santé de Beaumont. Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes.
ATTENTION : Tous les matériels potentiellement infectieux doivent être manipulés selon les normes de niveau de biosécurité 2 y compris l’utilisation des équipements de protection individuelle. Des procédures qui peuvent produire des aérosols doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique. En outre, les travaux avec les moustiques vivants doivent être effectués dans la communité arthropode niveau de confinement 1-3. Compte tenu de l’association de l’infection à ZIKV avec les anomalies congénitales, femmes enceintes, essaient de concevoir, ou les partenaires de ces femmes devraient considérablement minimiser leur exposition en laboratoire à ZIKV. Transport des échantillons ZIKV est classée catégorie B Substances biologiques conformément au ministère des transports matières dangereuses aux États-Unis (49 CFR, partie 171-180) et par conséquent d’expédition des échantillons devrait adhérer à ceux lignes directrices. Importation dans les échantillons biologiques aux États-Unis de ZIKV nécessite un centres pour Disease Control and Prevention (CDC) permis d’importation. Importation de n’importe quel arthropodes qui pourrait être utilisé comme un vecteur de transmission de ZIKV, même si elles ne sont pas infectés, exige un permis de l’United States Department of Agriculture (USDA). Cette information est à jour au moment de la publication. Recommandations à jour peuvent être trouvées à https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
Remarque : Les réactions de RT-lampe sont sujettes à des taux plus élevés de fausses réactions positives, donc les précautions doivent être prises dans la planification expérimentale. Tous les set-up et l’exécution des réactions RT-lampe doivent utiliser des pipettes désignés et bouts filtrants. Idéalement, il faudrait un flux de travail latéral. Si possible, l’analyse et imagerie (Section 5) devraient avoir lieu dans une salle séparée et fermée pour éviter la contamination. Ouverture des tubes à essai contenant des produits RT-lampe doit être maintenue à un minimum.
1. préparation d’amorce RT-lampe
<ol><li>Reconstituer chaque amorce RT-lampe lyophilisée dans l’eau de qualité moléculaire à une concentration finale de 100 µM (tableau 1). Vortex brièvement la solution d’apprêt pour assurer une solution homogène et tourner brièvement vers le bas de la solution à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de dessus de table pour recueillir toutes les solution d’apprêt.</li>
	<li>Préparer un 10 x RT-lampe Primer Mix des amorces FIP, BIP, F3, B3, LF et LB en utilisant les volumes dans le tableau 2. Vortex brièvement la solution d’apprêt pour assurer une solution homogène et brièvement tourner vers le bas de la solution à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de table afin d’éviter toute perte. Remarque : L’abécédaire de RT-lampe pour Ae. aegypti actine (AEDAE) ne contient-elle pas une amorce LB (amorces de boucle ne sont pas toujours nécessaires pour les réactions de RT-lampe). Dans ce cas, remplacer le volume d’amorce LB avec l’eau de qualité moléculaire.</li>
	<li>Stocker les amorces à-20 ° C entre les utilisations et éviter les cycles libres-décongélation.</li>
</ol>2. préparation de l’échantillon
<ol><li>
Pour les échantillons d’urine humaine : Utiliser les urines fraîches, congelée urine ou urine en agent de conservation. Pour des échantillons frais ou congelés : immédiatement tourner vers le bas de l’échantillon après la collecte pendant 10 min à 700 get utiliser le surnageant pour analyse ou congeler à-80 ° C pour une utilisation future. Décongeler les échantillons congelés sur la glace avant utilisation.</li>
	<li>
Pour les échantillons de sérum humain : Utilisez soit des échantillons de sérum frais ou congelés.</li>
	<li>
Pour ZIKV infectés de lignées cellulaires: utiliser milieux conditionnés ou lysats cellulaires. NOTE : Acellulaire conditionné des médias de l’Ae. albopictus C6/36 cellules 8 jours après l’infection peut servir de témoins positifs pour les réactions de ZIKV RT-lampe.</li>
	<li>
Pour les moustiques Ae. aegypti : utiliser deux carcasses de moustique entières fraîches ou congelées. Décongelez les moustiques congelés sur la glace. Préparer un lysat de moustique brut en plaçant un moustique individuel dans 100 µL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et homogénéiser en écrasant le moustique 10 fois avec une pointe de pipette P10 (Figure 1). Brièvement, centrifuger le brut lysat pour granuler les débris. Utilisez le surnageant pour analyse de RT-lampe en aval. Remarque : Les témoins positifs peuvent être générés dans un laboratoire en infectant les moustiques femelles à l’aide de microinjection intrathoracique avec environ 103 génomes de virus dans un volume de 200 nL et récolte le moustique 5 jours après l’infection.</li>
</ol>3. préparer le mélange réactionnel RT-lampe
<ol><li>Préparer une réaction de mix master RT-feu sur la glace pour chaque amorce à utiliser à l’aide de guide du volume dans le tableau 3. Remarque : L’utilisation de thermolabile uracile DNA Glycosylase (UDG) aide à prévenir les faux positifs.</li>
	<li>Vortex brièvement pour s’assurer que tous les échantillons sont bien mélangés, puis tournez en bas brièvement pour prévenir la perte de volume.</li>
</ol>4. RT-lampe test
<ol><li>
Pipette 23,0 µL du mélange maître RT-lampe par réaction dans un tube PCR de 200 µL. Ajouter 2.0 µL de l’échantillon (urine, sérum ou surnageant lysate brut moustique comme décrit à l’étape 2). Ceci amènera le volume total à 25,0 µL par réaction de RT-lampe. Pour le contrôle négatif, utiliser de l’eau moléculaire de catégorie. Inclure un contrôle positif. Remarque : Une PCR standard ou virus les stocks de surnageant de lignées cellulaires infectées peut être utilisé comme témoin positif.<ol>
<li>Facultatif : Inclure une réaction de contrôle de spécificité d’un arbovirus connexes tels que les virus de la dengue (DENV). Préparation des échantillons comme indiqué à l’étape 2, selon le type d’échantillon. Ajouter 2.0 µL du contrôle spécificité à 23,0 µL du mélange maître RT-lampe dans un tube PCR de 200 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire chauffer les échantillons à 61 ° C pendant 30 min à l’aide d’un bloc chauffant, bain-marie ou thermocycleur.</li>
	<li>Chaleur désactiver la polymérase par chauffage à 80 ° C pendant 10 min.</li>
</ol>5. RT-lampe analyse
Remarque : Effectuer une analyse de RT-lampe dans un espace séparé et clos.
<ol><li>
Après l’incubation, accéder à des réactions de RT-lampe visuellement en recherchant la présence d’un changement de couleur.
	<ol>
<li>Diluer la fluorescence des acides nucléiques colorant 01:10 dans un tampon TAE (40 mM Tris, d’acide acétique 20 mM, EDTA 1 mM). ATTENTION : Toute tache acide nucléique se lie aux acides nucléiques et est par conséquent une substance cancérigène. Portez des gants lorsque vous manipulez.</li>
		<li>À 12 µL de la réaction de RT-lampe, ajouter 2 µL de dilution de colorant fluorescent des acides nucléiques. Remarque : Des réactions négatives seront orange en couleur et des réactions positives seront de couleur jaune/vert.</li>
		<li>En option : Prendre des photos des réactions RT-lampe sur un fond blanc à l’aide d’une caméra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les échantillons sous 302 nm UV lumière pour confirmer la présence de produits RT-lampe par fluorescence. Prendre la photo du résultat à l’aide d’une caméra. Remarque : Les réactions positives RT-lampe aura une sortie fluorescente. ATTENTION : Porter des UV protection oculaire googles ou face bouclier lorsque vous travaillez avec la lumière UV.</li>
	<li>
En option : Confirmer la présence de produits RT-lampe en effectuant l’électrophorèse sur gel sur les échantillons.
	<ol>
<li>Versez un gel d’agarose de 2 % dans un tampon x TAE 1 avec une tache acide nucléique pour la visualisation. ATTENTION : Toute tache acide nucléique se lie aux acides nucléiques et est par conséquent une substance cancérigène. Portez des gants lorsque vous manipulez.</li>
		<li>Ajouter 5 µL d’une échelle d’ADN dans la première voie pour comparer les poids moléculaires.</li>
		<li>Pour chaque réaction de RT-lampe, mélanger 13 µL du mélange réactionnel RT-lampe avec 2 µL d’ADN colorant de chargement. Charger le mélange 15 µL contenant l’ADN colorant de chargement.</li>
		<li>Exécutez le gel à 90 V pendant 90 min ou jusqu'à ce que les bandes sont séparées et l’image à 302 nm UV. Remarque : Les réactions positives RT-lampe aura un motif approfondi. Des réactions négatives de RT-lampe ne doivent contenir aucune bande.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Elimination des déchets
<ol><li>Débarrassez-vous des réactions RT-lampe dans un sac scellé double. Ne pas stériliser car cela peut pulvériser les produits de RT-lampe, conduisant à des réactions faussement positives à l’avenir.</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
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<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
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<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

LEL et MBC ont la propriété intellectuelle sur les méthodes de diagnostic pour le virus Zika. Les autres auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes.

Le dosage de ZIKV RT-lampe décrit dans cette étude des œuvres à l’aide de fois l’homme et les moustiques échantillons6. La limite de détection était environ 1 génome équivalent6, qui devrait être suffisant puisque la charge virale typique d’un patient ZIKV infecté symptomatique est 103 à 106 UFP/mL7. En outre, cette méthode peut détecter des ZIKV dans les échantillons sans premier isolement RNA et sans amplification d...

En 2015, Zika virus (ZIKV) attiré l’attention mondiale éminente comme une maladie infectieuse des préoccupations parce que l’infection pendant la grossesse était liée à la fausse couche, de mortinatalité, de graves neurologiques congénitales incluant une microcéphalie, ainsi qu’autres congénitale 1de malformations congénitales. Dans de rares cas, ZIKV a été associée avec le syndrome de Guillain-Barré. ZIKV est principalement transmis par les moustiques du genre Aedes ; Toutefois, il peut également se propager par contact sexuel1. Étant donné que l’infection avec ZIKV est asymptomatique chez la plupart des gens ou présente avec grippe-comme des symptômes bénins qui se chevauchent avec les symptômes de l’infection à d’autres arborviruses1, il y avait un besoin d’amélioration des méthodes de détection rapide et rentable de ZIKV pour dépister les personnes ainsi que les populations de moustiques locaux.
La transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) est une méthode fiable pour la détection de ZIKV ; Cependant, cette technique nécessite de coûteux équipements spécialisés, un personnel formé et isolement d’ARN de l’échantillon d’intérêt. L’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) est un procédé d’amplification d’acide nucléique one-step basé sur la technologie PCR qui exige seulement une température d’incubation en raison de l’utilisation d’une ADN polymérase thermophile avec fil Propriétés de déplacement. Cela contourne la nécessité d’un thermocycleur et diminue la longueur du temps nécessaire pour effectuer le test. Avantages supplémentaires de RT-lampe incluent sa grande spécificité et la sensibilité, la robustesse à un éventail de niveaux de pH et températures et résistance aux nombreux PCR inhibiteurs2. Il a un coût relativement faible et les réactifs sont stables à température ambiante. Compte tenu de ces caractéristiques, RT-lampe peut être déployé dans un laboratoire ou sur le terrain. À ce titre, les réactions de lampe ont été développées pour détecter un éventail d’agents pathogènes et d’autres types d’infection3,4,5. L’objectif du protocole RT-lampe décrit dans le présent document est de détecter les ZIKV sans isolement d’ARN dans les échantillons de sérum et l’urine humaines ainsi que dans un seul moustique infecté dans les 30 minutes par l’intermédiaire de RT-lampe. Cette méthode peut être utilisée pour remplacer qRT-PCR car c’est un outil de diagnostic sensible et rapid qui fonctionne rapidement et dans des cadres à l’extérieur du laboratoire.

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’amplification isotherme&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx Transcriptase inverse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>Antarctique Thermolabile UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0440S</td><td>Ensemble de désoxynucléotides N0446S</td></tr><tr><td>100 mM de solution dCTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>Kit de désoxynucléotides N0446S</td></tr><tr><td>100 mM de solution dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>Kit de désoxynucléotides N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>Kit de désoxynucléotides N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dUTP Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Acide nucléique Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Échelle de faible masse d’ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>Zika Postive Control</td><td>Robert Koch Institute, Allemagne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Gel Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>10816015</tr><tr><td>Amorces</td><td>intégrées DNA Technologies</td><td>Eau sans</td> oligonucléases <td></td>personnalisée</tr><tr><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td>Conservateur<td>d’urine</td></tr><tr><td></td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR Standard</td><td>Robert Koch Institute</td><td>N/A</td><td>Vero E6 cellules surnageantes</td></tr><tr><td>DENV2 New Guinea C Control</td><td>Connecticut Expérience agricole Borne</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

essais de transcription-boucle-négociée l’amplification isotherme (rt-lampe) pour virus zika et gènes domestiques dans l’urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infection par le virus Zika (ZIKV) peut être asymptomatique chez l’adulte, cependant, infection pendant la grossesse peut entraîner une fausse couche et de graves malformations neurologiques. Ce protocole vise à détecter rapidement les ZIKV dans des échantillons humains et de moustiques. L’étalon-or actuel pour la détection de ZIKV est la transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) ; l’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) peut permettre un test plus efficace et à moindre coût sans besoin de matériel coûteux. Dans cette étude, RT-lampe est utilisée pour la détection de ZIKV dans divers échantillons biologiques dans les 30 minutes, sans premier isoler l’ARN de l’échantillon. Cette technique est démontrée en utilisant ZIKV infectés par le sérum et l’urine de patients et infecté des échantillons de moustiques. L’acide ribonucléique ribosomique 18 s et l’actine sont utilisés comme témoins dans des échantillons humains et moustique, respectivement.

Réactions de RT-lampe peuvent être analysées à l’aide de trois méthodes différentes. Tout d’abord, avec l’ajout d’un colorant fluorescent des acides nucléiques, des réactions positives sera jaune/vert en couleur où les réactions négatives apparaîtra orange en couleur à le œil nu. En second lieu, l’ajout du colorant fluorescent des acides nucléiques à réaction RT-lampe provoque un signal fluorescent lorsque les échantillons sont excités par la lumière UV. Réactions négatives n’aura pas un ...

Ce protocole fournit une méthode efficace et peu coûteux pour détecter le virus Zika ou contrôler des cibles dans des échantillons d’urine et le sérum humains ou chez les moustiques par amplification isotherme boucle-négociée de transcription inverse (RT-lampe). Cette méthode ne nécessite pas d’ARN et peut se faire dans les 30 minutes.

Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Cette méthode permet de déterminer rapidement si les échantillons contiennent le virus Zika. Ceci est utile pour les femmes enceintes, les couples qui essaient de concevoir, ou la surveillance des populations locales de moustiques qui sont à risque d’infection à Zika. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, facile, ne nécessite pas d’équipement coûteux, et peut être fait sans une étape d’isolement arn.Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de l’infection de Zika, parce que l’infection pendant la grossesse est liée à la fausse couche, à la mortinaissance, et à d’autres malformations congénitales congénitales et neurologiques graves. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du Virus Zika, elle peut également être appliquée à d’autres maladies infectieuses telles que la dengue, le chikungunya ou le virus du Nil occidental en utilisant des amorces spécifiques au virus. Pour commencer, reconstituer chaque amorce RT-LAMP dans l’eau de qualité moléculaire à une concentration finale de 100 micromolaires.Vortex brièvement la solution d’amorce pour s’assurer que la solution est homogène. Centrifugeuse pendant environ cinq secondes à vitesse maximale pour recueillir la solution d’amorce. Préparez ensuite un mélange d’amorce RT-LAMP 10x tel qu’il est décrit dans le tableau deux du protocole de la technologie.Vortex brièvement pour assurer l’homogénéité. Et centrifugeuse brièvement à vitesse maximale pour éviter toute perte. Rangez les amorces à moins 20 degrés Celsius, entre les utilisations, en évitant tout cycle gel-dégel.Pour les échantillons d’urine humaine, utiliser de l’urine fraîche, de l’urine congelée ou de l’urine dans un agent de conservation. Décongeler les échantillons congelés sur la glace avant utilisation. Les échantillons de sérum humain devraient être frais ou congelés, tandis que les lignées cellulaires infectées par zikv devraient contenir des supports conditionnés ou des lysates cellulaires.Enfin, pour les moustiques Aedes aegypti, utilisez des carcasses entières, fraîches ou congelées. Décongeler les carcasses de moustiques congelés sur la glace. Placez un moustique individuel dans 100 microlitres de PBS.À l’aide d’une pointe de pipette P10 écraser le moustique 10 fois, et l’homogénéiser pour créer un lysate de moustique brut. Centrifugez brièvement le lysate brut pour granuler les débris et utilisez le supernatant pour l’analyse rt-LAMP en aval. Pour commencer, préparez une réaction de mélange maître RT-LAMP sur la glace pour chaque amorce à utiliser, comme le décrit le tableau trois dans le protocole de la technologie.Vortex chaque échantillon pour s’assurer qu’il est bien mélangé. Puis tournez-les brièvement vers le bas pour éviter la perte de volume. Pour chaque réaction, pipette 23,0 microlitres du mélange maître RT-LAMP dans un tube PCR de 200 microlitres.Ensuite, ajoutez deux microlitres d’échantillon pour porter le volume total à 25,0 microlitres. Utilisez de l’eau de qualité moléculaire pour le contrôle négatif, et assurez-vous d’inclure un contrôle positif. En option, inclure une réaction de contrôle de spécificité d’un arbovirus connexe tel que le virus de la dengue, tel que décrit dans le protocole de la technologie.À l’aide d’un bloc thermique, d’un bain d’eau ou d’un thermocycleur, chauffer les échantillons à 61 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, augmenter la chaleur à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour chauffer désactiver la polymése. Effectuez l’analyse RT-LAMP dans un espace clos séparé.Diluer le colorant à l’acide nucléique fluorescent un à dix dans le tampon TAE. Ajouter deux micorlitres de la solution fluorescente de colorant d’acide nucléique à 12 micorlitres de la réaction de RT-LAMP. Évaluez visuellement les réactions rt-LAMP en recherchant la présence d’un changement de couleur.Utilisez en option un appareil photo pour prendre des photos des réactions RT-LAMP sur un fond blanc. Ensuite, placez les échantillons sous une lumière UV de 302 nanomètres pour confirmer la présence de produits RT-LAMP par fluorescence. Utilisez un appareil photo pour prendre une photo du résultat.Pour commencer à effectuer l’électrophoresis verser 2% gel agarose dans 1x TAE tampon avec une tache d’acide nucléique pour la visualisation. Ajouter cinq microlitres d’une échelle d’ADN dans la première voie pour comparer les poids moléculaires. Pour chaque réaction RT-LAMP, mélanger 13 microlitres de mélange de réaction RT-LAMP avec deux microlitres de colorant de chargement de l’ADN.Chargez ce mélange de 15 microlitres. Faire fonctionner le gel à 90 volts pendant 90 minutes ou jusqu’à ce que les bandes soient séparées. Une image avec la lumière UV de 302 nanomètres.Une fois terminé, éliminer les réactions RT-LAMP dans des sacs doublement scellés. Dans cette étude, trois méthodes différentes sont utilisées pour analyser les réactions RT-LAMP. Lors de l’utilisation de colorants nucléiques fluorescents colorants positifs deviennent jaune-vert en couleur, tandis que les réactions négatives apparaissent orange.Ce colorant entraîne également un signal fluorescent lorsque les échantillons sont excités par la lumière UV. Enfin, les réactions RT-LAMP peuvent être à court d’un gel agarose. Les réactions positives de RT-LAMP auront un modèle de baguage, tandis que les réactions négatives n’auront pas de bandes d’ADN.Ces méthodes sont utilisées pour démontrer la spécificité de la réaction ZIKV RT-LAMP. Seul le contrôle moléculaire ZIKV a une réaction POSITIVE RT-LAMP. En outre, tandis que ZIKV est détecté dans l’urine et le sérum d’un patient présentant l’infection connue de ZIKV, il n’est pas vu dans le patient asymptomatique de contrôle sans infection de ZIKV.Les échantillons sont ensuite testés pour l’ARN humain 18S. Seuls les échantillons prélevés sur des patients sont considérés comme positifs pour 18S rRNA. Les échantillons de moustiques peuvent être testés de la même façon pour zikv ou le contrôle de qualité RT-LAMP AEDAE.Seul le contrôle moléculaire positif pour ZIKV et le moustique infecté par ZIKV sont considérés comme positifs pour ZIKV. Toutefois, tous les moustiques sont positifs pour l’AEDAE par RT-LAMP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée en moins de 30 minutes si elle est exécutée correctement.Il est important de se rappeler que les réactions RT-LAMP sont sujettes à de fausses réactions positives. Les étapes de prévention incluent l’utilisation d’une glycosylase thermolabile d’ADN d’uracil dans les réactions, utilisant un flux latéral de travail, effectuant l’analyse dans un espace séparé, et réduisant des tubes d’amplification de poteau de temps sont ouverts. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme QPCR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le nombre de copies que le virus, ou d’autres cibles, sont présentes dans l’échantillon.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser RT-LAMP pour détecter le virus Zika et cibler les contrôles dans l’urine humaine et le sérum, ainsi que les moustiques. N’oubliez pas que le travail avec le virus Zika et la tache d’acide nucléique peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Compte tenu de l’association de l’infection par le virus Zika avec des anomalies congénitales, les femmes enceintes, qui essaient de concevoir ou partenaires de ces femmes devraient réduire considérablement leur exposition en laboratoire au virus Zika.

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