Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse

Cette méthode permet de déterminer rapidement si les échantillons contiennent le virus Zika. Ceci est utile pour les femmes enceintes, les couples qui essaient de concevoir, ou la surveillance des populations locales de moustiques qui sont à risque d’infection à Zika. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, facile, ne nécessite pas d’équipement coûteux, et peut être fait sans une étape d’isolement arn.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de l’infection de Zika, parce que l’infection pendant la grossesse est liée à la fausse couche, à la mortinaissance, et à d’autres malformations congénitales congénitales et neurologiques graves. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du Virus Zika, elle peut également être appliquée à d’autres maladies infectieuses telles que la dengue, le chikungunya ou le virus du Nil occidental en utilisant des amorces spécifiques au virus. Pour commencer, reconstituer chaque amorce RT-LAMP dans l’eau de qualité moléculaire à une concentration finale de 100 micromolaires.

Vortex brièvement la solution d’amorce pour s’assurer que la solution est homogène. Centrifugeuse pendant environ cinq secondes à vitesse maximale pour recueillir la solution d’amorce. Préparez ensuite un mélange d’amorce RT-LAMP 10x tel qu’il est décrit dans le tableau deux du protocole de la technologie.

Vortex brièvement pour assurer l’homogénéité. Et centrifugeuse brièvement à vitesse maximale pour éviter toute perte. Rangez les amorces à moins 20 degrés Celsius, entre les utilisations, en évitant tout cycle gel-dégel.

Pour les échantillons d’urine humaine, utiliser de l’urine fraîche, de l’urine congelée ou de l’urine dans un agent de conservation. Décongeler les échantillons congelés sur la glace avant utilisation. Les échantillons de sérum humain devraient être frais ou congelés, tandis que les lignées cellulaires infectées par zikv devraient contenir des supports conditionnés ou des lysates cellulaires.

Enfin, pour les moustiques Aedes aegypti, utilisez des carcasses entières, fraîches ou congelées. Décongeler les carcasses de moustiques congelés sur la glace. Placez un moustique individuel dans 100 microlitres de PBS.

À l’aide d’une pointe de pipette P10 écraser le moustique 10 fois, et l’homogénéiser pour créer un lysate de moustique brut. Centrifugez brièvement le lysate brut pour granuler les débris et utilisez le supernatant pour l’analyse rt-LAMP en aval. Pour commencer, préparez une réaction de mélange maître RT-LAMP sur la glace pour chaque amorce à utiliser, comme le décrit le tableau trois dans le protocole de la technologie.

Vortex chaque échantillon pour s’assurer qu’il est bien mélangé. Puis tournez-les brièvement vers le bas pour éviter la perte de volume. Pour chaque réaction, pipette 23,0 microlitres du mélange maître RT-LAMP dans un tube PCR de 200 microlitres.

Ensuite, ajoutez deux microlitres d’échantillon pour porter le volume total à 25,0 microlitres. Utilisez de l’eau de qualité moléculaire pour le contrôle négatif, et assurez-vous d’inclure un contrôle positif. En option, inclure une réaction de contrôle de spécificité d’un arbovirus connexe tel que le virus de la dengue, tel que décrit dans le protocole de la technologie.

À l’aide d’un bloc thermique, d’un bain d’eau ou d’un thermocycleur, chauffer les échantillons à 61 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, augmenter la chaleur à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour chauffer désactiver la polymése. Effectuez l’analyse RT-LAMP dans un espace clos séparé.

Diluer le colorant à l’acide nucléique fluorescent un à dix dans le tampon TAE. Ajouter deux micorlitres de la solution fluorescente de colorant d’acide nucléique à 12 micorlitres de la réaction de RT-LAMP. Évaluez visuellement les réactions rt-LAMP en recherchant la présence d’un changement de couleur.

Utilisez en option un appareil photo pour prendre des photos des réactions RT-LAMP sur un fond blanc. Ensuite, placez les échantillons sous une lumière UV de 302 nanomètres pour confirmer la présence de produits RT-LAMP par fluorescence. Utilisez un appareil photo pour prendre une photo du résultat.

Pour commencer à effectuer l’électrophoresis verser 2% gel agarose dans 1x TAE tampon avec une tache d’acide nucléique pour la visualisation. Ajouter cinq microlitres d’une échelle d’ADN dans la première voie pour comparer les poids moléculaires. Pour chaque réaction RT-LAMP, mélanger 13 microlitres de mélange de réaction RT-LAMP avec deux microlitres de colorant de chargement de l’ADN.

Chargez ce mélange de 15 microlitres. Faire fonctionner le gel à 90 volts pendant 90 minutes ou jusqu’à ce que les bandes soient séparées. Une image avec la lumière UV de 302 nanomètres.

Une fois terminé, éliminer les réactions RT-LAMP dans des sacs doublement scellés. Dans cette étude, trois méthodes différentes sont utilisées pour analyser les réactions RT-LAMP. Lors de l’utilisation de colorants nucléiques fluorescents colorants positifs deviennent jaune-vert en couleur, tandis que les réactions négatives apparaissent orange.

Ce colorant entraîne également un signal fluorescent lorsque les échantillons sont excités par la lumière UV. Enfin, les réactions RT-LAMP peuvent être à court d’un gel agarose. Les réactions positives de RT-LAMP auront un modèle de baguage, tandis que les réactions négatives n’auront pas de bandes d’ADN.

Ces méthodes sont utilisées pour démontrer la spécificité de la réaction ZIKV RT-LAMP. Seul le contrôle moléculaire ZIKV a une réaction POSITIVE RT-LAMP. En outre, tandis que ZIKV est détecté dans l’urine et le sérum d’un patient présentant l’infection connue de ZIKV, il n’est pas vu dans le patient asymptomatique de contrôle sans infection de ZIKV.

Les échantillons sont ensuite testés pour l’ARN humain 18S. Seuls les échantillons prélevés sur des patients sont considérés comme positifs pour 18S rRNA. Les échantillons de moustiques peuvent être testés de la même façon pour zikv ou le contrôle de qualité RT-LAMP AEDAE.

Seul le contrôle moléculaire positif pour ZIKV et le moustique infecté par ZIKV sont considérés comme positifs pour ZIKV. Toutefois, tous les moustiques sont positifs pour l’AEDAE par RT-LAMP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée en moins de 30 minutes si elle est exécutée correctement.

Il est important de se rappeler que les réactions RT-LAMP sont sujettes à de fausses réactions positives. Les étapes de prévention incluent l’utilisation d’une glycosylase thermolabile d’ADN d’uracil dans les réactions, utilisant un flux latéral de travail, effectuant l’analyse dans un espace séparé, et réduisant des tubes d’amplification de poteau de temps sont ouverts. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme QPCR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le nombre de copies que le virus, ou d’autres cibles, sont présentes dans l’échantillon.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser RT-LAMP pour détecter le virus Zika et cibler les contrôles dans l’urine humaine et le sérum, ainsi que les moustiques. N’oubliez pas que le travail avec le virus Zika et la tache d’acide nucléique peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Compte tenu de l’association de l’infection par le virus Zika avec des anomalies congénitales, les femmes enceintes, qui essaient de concevoir ou partenaires de ces femmes devraient réduire considérablement leur exposition en laboratoire au virus Zika.