Génération de Cultures de tissus pulmonaires humains de 3D (3D-SFLC) pour la modélisation de la maladie
12 février 2019
Nous présentons ici un protocole pour la préparation de tranches de poumon de coupe de précision humain rempli d’agarose de tissus réséqués du patient qui sont aptes à produire des cultures de tissus pulmonaires 3D aux maladies pulmonaires humaines modèle dans études biologiques et biomédicales.
Cette méthode permet d’investigation des tissus humains vivants dans sa structure et sa composition 3D naturelles pour la traduction des principales découvertes de laboratoire en thérapies potentielles. Cette technique permet spécifiquement la génération de cultures tissulaires à partir de tissus pulmonaires humains réséqués ou explantés chirurgicalement pour la visualisation d’échantillons individuels de tissus pulmonaires patients décédés. Le tissu pulmonaire sans maladie peut être employé comme cultures de tissu 3D pour modéliser des maladies pulmonaires ex vivo permettant l’analyse des pathométismes tôt dans une résolution spatiotemporal élevée.
Commencez par placer l’échantillon pulmonaire réséqué en 15 millilitres de milieu de culture dans un plat de culture stérile de 15 centimètres et un plateau métallique stérile recouvert de papier de soie, et remplissez une seringue de 30 millilitres avec un agarose à faible point de fusion de 42 degrés Celsius. Retirez l’obturateur d’un cathéter veineux périphérique et attachez le cathéter à la seringue de 30 millilitres. Identifiez une bronche de 0,5 à 3 millimètres de diamètre dans le tissu de ventilation dans une section intacte du tissu, et insérez doucement la canule dans les bronches autant que possible.
Utilisez des forceps pour comprimer la paroi bronchique autour de la canule, idéalement en serrant toute artère pulmonaire adjacente en même temps, pour sceller les bronches autour de la canule et utiliser une pince chirurgicale pour occluser toutes les autres voies respiratoires supplémentaires, afin d’éviter les fuites d’agarose. Ensuite, utilisez les forceps pour soulever le tissu pulmonaire du plat de culture, et utilisez la seringue pour livrer manuellement l’agarose à travers la canule, pas plus vite que 0,3 millilitres par seconde. Lorsque le tissu pulmonaire est complètement rempli sans gonfler trop le tissu, retirez immédiatement la canule et serrez la bronche.
Submergez le tissu dans le milieu de culture à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour faciliter la solidification de l’agarose, et répétez la procédure de remplissage de l’agarose pour toutes les ouvertures supplémentaires de bronchiole. Ensuite, conservez les sections de tissu pulmonaire remplies d’agarose dans un milieu de quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles se tranchent. Pour le découpage de poumon coupé avec précision, identifiez les régions solidement agarose-remplies dans le tissu de poumon, qui ne s’effondrent pas une fois doucement pressées avec des pinces contre le fond du plat de culture cellulaire.
Exciser un bloc de 1 à 1,5 centimètre cube de région solidement remplie avec un côté encore recouvert de plèvre, et utiliser de la colle cyanoacrylate pour fixer le côté pluriel de chaque bloc de tissu au support vibratome. Trancher tout le chemin à travers le bloc de tissu long, jusqu’à ce que seulement deux à trois milomètres de tissu sont laissés sans permis. Utilisation de forceps pour transférer chaque section de 500 micromètres dans un puits d’une plaque de douze puits contenant un milieu de culture, tel qu’il est obtenu.
Lorsque tout le tissu a été sectionné, transférez les échantillons de chaque puits dans des plats de culture individuels de dix centimètres et placez un poinçonneur de biopsie de quatre millimètres orthogonally à la surface supérieure de la tranche pulmonaire découpée avec précision. Ensuite, en déplaçant le poinçonneur dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, obtenir des poinçons de tissu de l’échantillon pulmonaire. Placer chaque poinçon dans un milieu de culture cellulaire fraîche dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits au fur et à mesure qu’ils sont obtenus.
Lorsque tous les poinçons tissulaires ont été obtenus, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à cinq jours. L’immunolabeling de la fibronectine dans les noyaux cellulaires utilisant l’immunofluorescence dans les cultures humaines de tissu pulmonaire 3D permet l’imagerie de la structure alvéolaire préservée ex vivo. Le traitement des poinçons coupés de tranche de poumon de précision humaine avec un cocktail profibrotique de cytokine pendant 48 heures a comme conséquence des changements fibrose-comme dans les cultures humaines de tissu 3D de poumon, y compris l’induction significative des composants extracellulaires pertinents de matrice de fibrose, type un de collagène, et gènes de fibronectine.
En outre, les niveaux de protéine de la vimentine de marqueur mésenchymal sont jusqu’à réglés dans trois sur quatre patients après traitement des poinçons de culture de tissu pulmonaire 3D. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse de l’ARN par PCR quantitative en temps réel, ou l’analyse des protéines par ballonnement occidental, peuvent être effectuées pour évaluer l’expression des gènes et des protéines respectivement dans le tissu. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la pneumologie expérimentale, à l’explantation de la biologie pulmonaire ainsi qu’à des études toxicologiques et pharmacologiques dans des échantillons de tissus humains.
N’oubliez pas que les tissus humains vivants sont potentiellement infectieux et que des mesures de précaution telles que l’utilisation d’équipement de protection individuelle et le stockage approprié des tissus, le transport et la manipulation des déchets doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour préparer des tranches pulmonaires humaines de précision remplies d'agarose à partir de tissu patient résecté. Ces tranches conviennent à la génération de cultures tissulaires pulmonaires en 3D afin de modéliser les maladies pulmonaires humaines dans des études biologiques et biomédicales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche biomédicale
- Modélisation des maladies pulmonaires
- Techniques de culture tissulaire en 3D
Contexte
- Le tissu pulmonaire humain peut être utilisé pour étudier les maladies dans une structure tridimensionnelle naturelle.
- Cette méthode permet la visualisation d'échantillons pulmonaires provenant de patients individuels.
- Elle permet l'analyse des premiers mécanismes pathogènes avec une résolution spatiotemporelle élevée.
- Des mesures préventives sont nécessaires en raison du caractère infectieux du tissu humain vivant.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour la création de cultures tissulaires pulmonaires en 3D.
- Faciliter l'étude des maladies pulmonaires ex vivo.
- Permettre l'analyse de l'expression des gènes et des protéines dans le tissu pulmonaire humain.
Méthodes utilisées
- Préparation d'échantillons de tissu pulmonaire à l'aide d'agarose à bas point de fusion.
- Découpe précise de sections pulmonaires incluses dans l'agarose.
- Techniques d'immunomarquage pour la visualisation de la structure tissulaire.
- Analyse de l'expression des gènes et des protéines par PCR et immunobuvardage (western blotting).
Résultats principaux
- Induction de modifications similaires à la fibrose dans des cultures de tissu pulmonaire après un traitement par cytokines.
- Sur-régulation des gènes de collagène de type I et de fibronectine.
- Augmentation des niveaux protéiques du marqueur mésenchymateux vimentine dans les échantillons traités.
- Potentiel pour des recherches complémentaires en pneumologie et pharmacologie expérimentales.
Conclusions
- Cette technique fait progresser la compréhension de la biologie pulmonaire.
- Elle fournit une plateforme pour les études toxicologiques et pharmacologiques.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur cette méthode afin d'améliorer la modélisation des maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Les cultures de tissus pulmonaires humains en 3D, dérivées de tranches pulmonaires découpées avec précision, fournissent un modèle ex vivo physiologiquement pertinent pour l'étude des mécanismes des maladies et des réponses aux médicaments dans l'architecture tissulaire humaine native. Cette approche permet la validation de cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques en facilitant l'évaluation directe des effets des composés sur des échantillons pulmonaires malades ou péritumoraux provenant de patients individuels. Le modèle améliore la fiabilité prédictive de l'évaluation préclinique en préservant la diversité cellulaire, la composition de la matrice extracellulaire et les propriétés biomécaniques essentielles à la pertinence translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans un tissu pulmonaire humain intact, avec une structure tridimensionnelle et une diversité des types cellulaires préservées.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en mesurant les modifications induites par les médicaments sur des biomarqueurs liés à la fibrose, tels que le collagène de type I et la fibronectine.
- Valeur scientifique : Facilite l'élucidation des voies métaboliques grâce à une analyse spatiotemporelle des premiers mécanismes physiopathologiques dans un tissu humain pertinent pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des prélèvements tissulaires standardisés et reproductibles, adaptés au criblage de composés en plaque multi-puits.
- Valeur opérationnelle : Permet des mesures quantitatives par immunofluorescence, qPCR et immunoblotting pour des analyses de réponse dose-dépendante et de cinétique temporelle.
- Valeur scientifique : Augmente le rendement tissulaire à partir d'échantillons patients limités grâce au prélèvement par biopsie, améliorant ainsi l'évolutivité des tests et la capacité de réplication.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Modélise des processus fibrotiques spécifiques à l'humain au niveau subcellulaire à l'aide de modifications induites par des cytokines, semblables à la fibrose, dans des tranches pulmonaires découpées avec précision.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système pertinent pour la maladie permettant d'évaluer l'interaction avec la cible et le mécanisme d'action dans un tissu humain avant des études in vivo.
- Valeur scientifique : Facilite l'alignement translationnel des biomarqueurs en permettant la corrélation entre les réponses moléculaires et les résultats fonctionnels au niveau tissulaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test précoce d'hypothèses sur des cibles jusqu'à l'identification de composés candidats et la validation préclinique, permettant un affinement itératif fondé sur les réponses des tissus humains.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant la visualisation de la structure alvéolaire et des réponses cellulaires dans des explants pulmonaires humains intacts.
- Criblage : Fournit des biopsies de tissu prêtes à l'analyse, de taille et de viabilité constantes, pour le criblage de bibliothèques de composés dans des formats 96 puits.
- Analytique : Permet des lectures multiplexées incluant l'expression génique (qPCR), les niveaux protéiques (immunotransfert) et l'imagerie structurale (immunofluorescence) afin de comparer différentes conditions de traitement.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les travaux précliniques en conservant la complexité du tissu humain et en permettant une analyse des réponses stratifiées par patient.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour la modélisation des maladies pulmonaires, applicable à plusieurs projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant les écarts de traduction entre espèces grâce à l'utilisation directe de tissu pulmonaire humain.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des tissus par inclusion dans l'agarose et découpage de précision, améliorant ainsi la reproductibilité entre utilisateurs et sites.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'engagement ou de retrait en fournissant précocement des signaux d'efficacité et de toxicité basés sur des tissus humains.
- Impact sur le portefeuille : Permet de hiérarchiser les composés selon un niveau de risque ajusté, fondé sur leurs effets mécanistiques observés sur des échantillons humains de poumon malade ou péri-tumoral.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de tissus humains, les techniques stériles et la sectionnement au vibratome.
- Dépend de l'accès à du tissu pulmonaire réséqué chirurgicalement et à de l'agarose à point de fusion basse pour la préservation de la structure.
- Exige des conditions de culture standardisées et des contrôles de contamination en raison du potentiel infectieux du tissu humain vivant.
- Implique l'optimisation de la taille du punch biopsique et de la technique de rotation afin d'assurer une uniformité des échantillons entre les réplicats.
- Est limité par la fenêtre de viabilité du tissu, nécessitant une mise en culture rapide et opportune après la réséction.
