Génération de Cultures de tissus pulmonaires humains de 3D (3D-SFLC) pour la modélisation de la maladie

Cette méthode permet d’investigation des tissus humains vivants dans sa structure et sa composition 3D naturelles pour la traduction des principales découvertes de laboratoire en thérapies potentielles. Cette technique permet spécifiquement la génération de cultures tissulaires à partir de tissus pulmonaires humains réséqués ou explantés chirurgicalement pour la visualisation d’échantillons individuels de tissus pulmonaires patients décédés. Le tissu pulmonaire sans maladie peut être employé comme cultures de tissu 3D pour modéliser des maladies pulmonaires ex vivo permettant l’analyse des pathométismes tôt dans une résolution spatiotemporal élevée.

Commencez par placer l’échantillon pulmonaire réséqué en 15 millilitres de milieu de culture dans un plat de culture stérile de 15 centimètres et un plateau métallique stérile recouvert de papier de soie, et remplissez une seringue de 30 millilitres avec un agarose à faible point de fusion de 42 degrés Celsius. Retirez l’obturateur d’un cathéter veineux périphérique et attachez le cathéter à la seringue de 30 millilitres. Identifiez une bronche de 0,5 à 3 millimètres de diamètre dans le tissu de ventilation dans une section intacte du tissu, et insérez doucement la canule dans les bronches autant que possible.

Utilisez des forceps pour comprimer la paroi bronchique autour de la canule, idéalement en serrant toute artère pulmonaire adjacente en même temps, pour sceller les bronches autour de la canule et utiliser une pince chirurgicale pour occluser toutes les autres voies respiratoires supplémentaires, afin d’éviter les fuites d’agarose. Ensuite, utilisez les forceps pour soulever le tissu pulmonaire du plat de culture, et utilisez la seringue pour livrer manuellement l’agarose à travers la canule, pas plus vite que 0,3 millilitres par seconde. Lorsque le tissu pulmonaire est complètement rempli sans gonfler trop le tissu, retirez immédiatement la canule et serrez la bronche.

Submergez le tissu dans le milieu de culture à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour faciliter la solidification de l’agarose, et répétez la procédure de remplissage de l’agarose pour toutes les ouvertures supplémentaires de bronchiole. Ensuite, conservez les sections de tissu pulmonaire remplies d’agarose dans un milieu de quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles se tranchent. Pour le découpage de poumon coupé avec précision, identifiez les régions solidement agarose-remplies dans le tissu de poumon, qui ne s’effondrent pas une fois doucement pressées avec des pinces contre le fond du plat de culture cellulaire.

Exciser un bloc de 1 à 1,5 centimètre cube de région solidement remplie avec un côté encore recouvert de plèvre, et utiliser de la colle cyanoacrylate pour fixer le côté pluriel de chaque bloc de tissu au support vibratome. Trancher tout le chemin à travers le bloc de tissu long, jusqu’à ce que seulement deux à trois milomètres de tissu sont laissés sans permis. Utilisation de forceps pour transférer chaque section de 500 micromètres dans un puits d’une plaque de douze puits contenant un milieu de culture, tel qu’il est obtenu.

Lorsque tout le tissu a été sectionné, transférez les échantillons de chaque puits dans des plats de culture individuels de dix centimètres et placez un poinçonneur de biopsie de quatre millimètres orthogonally à la surface supérieure de la tranche pulmonaire découpée avec précision. Ensuite, en déplaçant le poinçonneur dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, obtenir des poinçons de tissu de l’échantillon pulmonaire. Placer chaque poinçon dans un milieu de culture cellulaire fraîche dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits au fur et à mesure qu’ils sont obtenus.

Lorsque tous les poinçons tissulaires ont été obtenus, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à cinq jours. L’immunolabeling de la fibronectine dans les noyaux cellulaires utilisant l’immunofluorescence dans les cultures humaines de tissu pulmonaire 3D permet l’imagerie de la structure alvéolaire préservée ex vivo. Le traitement des poinçons coupés de tranche de poumon de précision humaine avec un cocktail profibrotique de cytokine pendant 48 heures a comme conséquence des changements fibrose-comme dans les cultures humaines de tissu 3D de poumon, y compris l’induction significative des composants extracellulaires pertinents de matrice de fibrose, type un de collagène, et gènes de fibronectine.

En outre, les niveaux de protéine de la vimentine de marqueur mésenchymal sont jusqu’à réglés dans trois sur quatre patients après traitement des poinçons de culture de tissu pulmonaire 3D. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse de l’ARN par PCR quantitative en temps réel, ou l’analyse des protéines par ballonnement occidental, peuvent être effectuées pour évaluer l’expression des gènes et des protéines respectivement dans le tissu. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la pneumologie expérimentale, à l’explantation de la biologie pulmonaire ainsi qu’à des études toxicologiques et pharmacologiques dans des échantillons de tissus humains.

N’oubliez pas que les tissus humains vivants sont potentiellement infectieux et que des mesures de précaution telles que l’utilisation d’équipement de protection individuelle et le stockage approprié des tissus, le transport et la manipulation des déchets doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.