Name: Règlement de voie signalisation innée myéloïde par MALT1 Paracaspase activité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez l'analyse comparative des voies de signalisation dans les cellules myéloïdes humaines et murines. Cette méthode utilise des cellules primaires et des inhibiteurs sélectifs pour étudier la régulation de la production de cytokines par MALT1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Elsevier pour leur autorisation (numéro de licence 4334770630127) reproduire ici la Figure 2 a de Unterreiner et al. (2017).

Des expériences ont été menées selon les lignes directrices et les normes de la Novartis Human Research Ethics Committee.
1. préparation des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) de manteaux Buffy humaine
Remarque : Nous avons reçu buffy manteaux de volontaires sains, un jour après le prélèvement, dans des sacs de 50 mL. Ils ont été fournis en vertu du consentement éclairé et recueillies par le biais de l' Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Nous avons traité à l’aide de la procédure ci-dessous, à la température ambiante, sauf indication contraire.
<ol><li>Préparer une stérile et propre paire de ciseaux et un bécher de 1 L avec un sac en plastique (sous un flot de limbe).</li>
	<li>Transférer la couche leuco-plaquettaire dans le bécher et ouvrez-le avec précaution avec les ciseaux.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette 25 mL, ajouter 100 mL de tampon/EDTA solution saline tamponnée au phosphate (PBS/EDTA : pH de PBS 1 x 7,4 contenant aucune CaCl2 et aucun MgCl2, additionné de 2 mM EDTA pH 8.0). Remarque : Utilisant la même pipette et après avoir lentement effectué la solution de haut en bas, diluer 25 mL de la couche leuco-plaquettaire diluée dans 6 tubes à centrifuger conique de 50 mL pré-remplie avec 15 mL de gradient de densité à base de polysaccharide.</li>
	<li>Centrifuger 20 min à 800 x g avec accélération modérée (fixé à 4 sur 9) et sans frein permettant la séparation des cellules selon leurs densités. Remarque : Après centrifugation, trois couches seront visibles ; une pastille contenant des globules rouges et les granulocytes, une couche supérieure faite de plasma et entre un anneau de couleur blanche contenant des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC).</li>
	<li>Récolter l’anneau PBMC à l’aide d’une pipette 10 mL et le transfert dans de nouveaux tubes de 50 mL. Remarque : Deux ou trois tubes de 50 mL sont normalement exigées par la couche leuco-plaquettaire. À ce stade, certains plasma susceptible de contamine les PBMC recueillies, qui ne devraient avoir aucune incidence sur les étapes ultérieures de l’enrichissement.</li>
	<li>Supérieure à 50 mL chaque tube à l’aide de PBS/EDTA et procéder à trois lavages successifs avec la diminution des temps de centrifugation et de la vitesse (15 min à 520 x g, 10 min à 330 x g, 8 min à 150 x g). Remarque : À chaque étape, le surnageant est coulé au large dans un conteneur à déchets liquid et le culot cellulaire est remis en suspension dans 50 mL de PBS/EDTA (granulés peuvent être mises en commun après le premier lavage).</li>
	<li>Après le lavage final, resuspendre le culot dans 25 mL d’un tampon de lyse glacee (voir Table des matières) pour lyser les globules rouges par la pression osmotique.</li>
	<li>Incuber jusqu'à ce que la solution devienne claire (plus de 5 min à température ambiante).</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 25 mL de tampon de séparation (PBS 1 x pH 7,4 contenant aucune CaCl2 et aucun MgCl2, additionné de 2 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Laver une fois de plus à 150 x g pendant 8 min. Remarque : À ce stade les PBMC peut être utilisé comme une population en vrac (voir étape 3 : traitements PBMC et les monocytes et les conditions stimulantes) ou transformés pour l’enrichissement de monocyte (voir étape 2 : préparation des monocytes de PBMC), ou congelés vers le bas pour une utilisation ultérieure (voir l’étape 5 : Monocytes et PBMC procédures de gel/dégel).</li>
</ol>2. préparation des Monocytes de PBMC
<ol><li>Remettre en suspension les PBMC obtenues à l’étape 1.10 dans le tampon de séparation et les compter pour atteindre 5 x 107cellules/mL.</li>
	<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger conique 14 mL avec bouchon.</li>
	<li>Ajouter 50 µL d’anticorps d’enrichissement de monocyte cocktail par mL de suspension cellulaire, vortex et incuber 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de perles enrichissement monocyte de cellules par mL. Remarque : Les billes doivent être soigneusement mixés afin d’assurer l’homogénéité de la suspension.</li>
	<li>Après l’ajout des perles, peu vortex la suspension cellulaire et incuber 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Rincer la partie supérieure du tube avec le tampon de séparation jusqu'à ce que le tube est rempli jusqu'à 10 mL.</li>
	<li>Mélangez lentement la solution de pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Placer le tube sans bouchon dans un aimant de séparation.</li>
	<li>Incuber pendant 2,5 min à température ambiante.</li>
	<li>Verser lentement dans un tube à centrifuger conique 15 mL.</li>
	<li>À ce stade, utilisez monocytes directement (voir étape 3 : traitements PBMC et les monocytes et les conditions stimulantes) ou différencier dans jemichielsmariepaule Monocyte-dérivé Dendritic Cells (iMoDCs) (voir étape 4), ou Congelez-les vers le bas pour une utilisation ultérieure (voir étape 5).</li>
</ol>3. PBMC et Monocytes traitements et Conditions stimulantes
<ol><li>Compter les cellules et diluez-les dans le milieu de culture (milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10 % BF + 1 mM de Pyruvate de Sodium, 100 U/mL de pénicilline streptomycine (Pen/Strep) + 5 µM β-mercaptoéthanol), jusqu'à 1,25 x 104 cellules/puits.</li>
	<li>Distribuer 30 µL de la suspension de cellules / puits d’une plaque 384 puits.</li>
	<li>Ajouter 15 µL de 4 x solutions concentrées de composés et les incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter le lipopolysaccharide (LPS) à une concentration finale de 10 ng/mL, appauvri zymosan (DZ) à une concentration finale de 100 µg/mL ou maintenir en milieu ordinaire.</li>
	<li>Incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Prendre 10 µL du liquide surnageant pour mesurer les concentrations de TNF-a sécrété (voir étape 7 : mesures de Cytokines et de viabilité).</li>
</ol>4. monocytes différenciation en iMoDCs et Conditions stimulant
<ol><li>Compter les monocytes (enrichis à l’étape 2) et centrifuger la suspension cellulaire à 520 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Pipeter hors le surnageant et ajouter le milieu de culture (RPMI + 10 % FBS pour obtenir une suspension cellulaire finale de 0,4 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 80 ng/mL recombinante humaine IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>Diluer 5 mL de suspension de cellules par puits dans une plaque 6 puits.</li>
	<li>Incuber pendant 7 jours à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Au jour 7, récolter les cellules par pipetage doucement afin d’éviter leur mise en route.</li>
	<li>Centrifuger à 520 x g pendant 5 min.</li>
	<li>L’aspirateur aspirer et remettre en suspension dans 50 mL de milieu de culture sans facteurs de croissance.</li>
	<li>Centrifuger à 520 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture.</li>
	<li>Déposer 100 µL de la suspension (105 cellules) de cellules / puits d’une plaque de fond plat de 96 puits.</li>
	<li>Avant incubate pendant 1 h à 37 ° C après l’ajout de 50 µL de 4 x concentré composées solutions, préparées comme décrit à l’étape 8 : préparation des composés.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de stimuli (4 x concentré), préparé comme décrit à l’étape 9.</li>
	<li>Incuber 24 h à 37 ° C.</li>
	<li>Mélanger chaque puits et le transfert de cellules et le surnageant (SN) dans une plaque de fond en V 96 puits.</li>
	<li>Tournez en bas à 475 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Transvaser le surnageant dans une nouvelle plaque de fond plat de 96 puits, sceller et congeler à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>5. les monocytes et les procédures de gel/dégel PBMC
<ol><li>
Point de congélation
	<ol>
<li>Tournez en bas PBMC ou monocyte préparations de cellules à 520 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirateur aspirer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans un milieu à 1 x 107 cellules/mL de gel.</li>
		<li>Diluer 1 mL de suspension cellulaire dans des cryotubes, les tubes de transfert à un dispositif de refroidissement spécifique (voir tableau des matériaux) et placez-le à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dégel
	<ol>
<li>Décongeler le cryotube et transférer rapidement son contenu dans un tube à centrifuger conique 15 mL contenant 9 mL de milieu de culture.</li>
		<li>Centrifuger à 520 x g pendant 5 min.</li>
		<li>L’aspirateur aspirer surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture. Les cellules sont maintenant prêts pour traitement expérimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cellules de rate de souris préparation et traitement
Remarque : Nous avons effectué des sacrifices d’animaux selon les lignes directrices et les normes de l’organisation de bien-être Animal Novartis. Des études ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’autorité gouvernementale régionale (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Nous avons sacrifié animaux par surexposition isoflurane, avec tous les efforts faits pour réduire au minimum les souffrances.
<ol><li>Récolter de la rate et se dissocient les tissus à l’aide d’un tube munis d’un broyeur mécanique tissulaire et contenant 5 mL de froid milieu RPMI.</li>
	<li>Utilisez le programme rate de la machine de dissociation pour moudre des organes.</li>
	<li>Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire de 100 mm en nylon.</li>
	<li>Transférer la suspension dans les tubes de 50 mL et centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 320 x g.</li>
	<li>Aspirateur aspirer le surnageant, resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de lyse glacee et laisser incuber à ≤ 2 min sur la glace.</li>
	<li>Arrêtez la lyse en ajoutant 7 mL de milieu RPMI.</li>
	<li>Filtrer à nouveau à travers un tamis de cellule 100 µm en nylon.</li>
	<li>Tournez en bas la suspension cellulaire à 330 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>L’aspirateur aspirer surnageant et remettre en suspension les cellules à 11 x 106 cellules/mL dans le milieu complet (RPMI additionné de 10 % FBS, 100 U/mL stylo/Step et 5 µM β-mercaptoéthanol).</li>
	<li>Plaque de 1 x 106 cellules/puits (90 µL) dans une plaque à 96 puits (fond plat).</li>
	<li>Ajouter 5 µL de 20 x concentré composé en solution dilué auparavant dans un milieu RPMI comme indiqué au point 8.3 : dilution en série de cellules spléniques de souris.</li>
	<li>Incuber 30 min à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de 20 x concentrés DZ (concentration finale 30 µg/mL) ou 20 x concentrés LPS + IFN-g (TLR-4) (concentration finale 1 µM LPS et 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Centrifuger à 330 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Transfert de surnageants en nouvelles plaques, sceller et congeler à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>7. les Cytokines et les mesures de viabilité
<ol><li>
Mesure de TNF-a humaine par HTRF (homogène temps Fluorescence résolue) Remarque : Le protocole suivi les recommandations du fournisseur, brièvement résumées ci-dessous.<ol>
<li>Mélanger 1 volume de réactif reconstitué (anti-TNF-a-cryptate et anti-TNF-a-XL665) avec 19 volumes de tampon de reconstitution (50 mM tampon phosphate pH 7.0, 0,8 M fluorure de potassium (KF), 0,2 % d’albumine sérique bovine (BSA)).</li>
		<li>Mélanger les deux solutions de prêt-à-utiliser anticorps 1:1 juste avant la distribution des réactifs.</li>
		<li>Administrer 10 µL de surnageants de l’étape 3.6 dans les plaques 384 puits blanches.</li>
		<li>Distribuer 10 µL du mélange anticorps.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec un scellant et incuber une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Lire la plaque sur un lecteur de microplaques (50 – 200 flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Humaine IL-23 mesure de HTRF (homogène temps Fluorescence résolue) Remarque : Le protocole suivi les recommandations du fournisseur, brièvement résumées ci-dessous.<ol>
<li>Mélanger 1 volume de réactif reconstitué (anti-IL-23-cryptate-anticorps et anti-IL-23 D2-anticorps) avec 19 volumes de tampon de détection #3.</li>
		<li>Mélanger les deux solutions de prêt-à-utiliser anticorps 1:1 juste avant la distribution des réactifs.</li>
		<li>Administrer 10 µL de surnageants de l’étape 3.6 dans les plaques 384 puits blanches.</li>
		<li>Distribuer 10 µL du mélange anticorps.</li>
		<li>Couvrir la plaque avec un scellant et incuber une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Lire la plaque sur un lecteur de microplaques (50 – 200 flash de nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Humaine IL-6, IL-8, IL-1β et mesures de TNF-α par électrochimiluminescence Remarque : Tous les échantillons ont été dilués au 1/150 en diluant 2 (première dilution : 10 µL dans 150 µL, puis 20 µL dans 180 µL). Le protocole de suivi des recommandations du fournisseur :<ol>
<li>Diluer les échantillons et la norme en diluant 2.</li>
		<li>Procéder à une dilution de la norme en diluant 2 à l’aide d’une dilution au 1/4 série pli.</li>
		<li>Laver les plaques trois fois avec le tampon de lavage.</li>
		<li>Administrer 50 µL d’échantillons ou de la norme / puits.</li>
		<li>Incuber pendant 2 h à température ambiante sous agitation.</li>
		<li>Laver la plaque quatre fois avec PBS + 0.05 % Polysorbate 20.</li>
		<li>Ajouter 25 µL d’anticorps de détection (60 µL de chaque anticorps pour 3 mL final) en diluant 3.</li>
		<li>Incuber pendant 2 h à température ambiante sous agitation.</li>
		<li>Laver la plaque quatre fois avec PBS + 0.05 % Polysorbate 20.</li>
		<li>Éviter les bulles, ajouter 150 µL / puits de tampon de lecture (tampon Tris contenant des groupements, dilué 2 x FD20) comme réactif pour la production de lumière dans les Immunoessais par électrochimiluminescence co.</li>
		<li>Lire la plaque (sans délai) sur un lecteur de plaques multiplex.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Souris de TNF-a mesure par ELISA suivant le protocole du fournisseur
	<ol>
<li>Diluer le liquide surnageant 1:1 dans le diluant de dosage (prêt à l’emploi de tampons contenant des protéines).<ol>
<li>Préparer des réactifs, des échantillons et des dilutions standards tel que décrit dans le kit. Ajouter 50 μL de dosage diluant dans chaque puits.</li>
			<li>Ajouter 50 μL de standard, contrôle ou échantillon / puits.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mélanger en tapotant doucement le cadre de la plaque pendant 1 min.</li>
		<li>Recouvrir avec la bande adhésive fournie et incuber pendant 2 h à température ambiante.</li>
		<li>Aspirez chaque puits et laver avec 400 μL/puits (Répétez cette étape cinq fois au total).</li>
		<li>Après le lavage final, supprimer n’importe quel tampon de lavage restant en aspirant.</li>
		<li>Inverser la plaque et tache contre essuie-tout propre.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de conjugué de TNF-α de la souris dans chaque puits. Couvrir avec une nouvelle bandelette adhésive.</li>
		<li>Incuber pendant 2 h à température ambiante.</li>
		<li>Répétez l’aspiration/lavage comme à l’étape 7.4.4.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de solution de substrat dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, Abrie de la lumière.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de solution d’acide chlorhydrique dilué (solution d’arrêt) dans chaque puits. Tapoter légèrement la plaque pour assurer un mélange complet.</li>
		<li>Mesurer la densité optique à 450 nm (avec la longueur d’onde de correction fixé à 560 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques (à faire dans les 30 minutes).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viabilité cellulaire
	<ol>
<li>Après avoir retiré les surnageants de préparations PBMC ou monocytes, évaluer la viabilité des cellules à l’aide d’un prêt à utiliser la solution de résazurine (indicateur d’oxydo-réduction) ajoutée directement à la suspension de cellules à une concentration finale de 10 %.</li>
		<li>Incuber pendant 1 à 2 h à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Lecture de fluorescence à 590 nm (Excitation 540 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. composé de préparation
<ol><li>
Dilution en série pour iMoDCs
	<ol>
<li>Diluer la solution mère de MLT-827 (10 mM en diméthylsulfoxyde (DMSO) en moyenne pour atteindre 8 µM en une seule fois (4 x concentré).</li>
		<li>Effectuer une dilution en série six-étape 1:5, à l’aide de médium + 0,08 % DMSO. Utilisez le même support + solution DMSO 0,08 % pour l’état du véhicule (aucun composé).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dose unique test pour iMoDCs
	<ol>
<li>Diluer les solutions mères MLT-827, AFN700 et Cpd11 en moyenne pour atteindre 4 µM en une seule fois (4 x concentré).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dilution en série de cellules spléniques de souris
	<ol>
<li>Diluer une solution de MLT-827 10 µM (obtenue à partir d’une solution stock de 10 mM après une un dilution aller dans le milieu) à 0,01 µM, avec une concentration de fin de DMSO de 0,1 %.</li>
		<li>Pour les étapes de la dilution, prenez 2 µL de chaque dilution, ajouter 38 µL RPMI et ajouter 5 µL dans le puits. Remarque : Tous les traitements sont effectués en trois exemplaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. préparation de stimuli
<ol><li>
Zymosan appauvri (DZ)
	<ol>
<li>Ajouter 2 mL d’eau stérile exempt d’endotoxine à 10 mg de DZ.</li>
		<li>Vortex pour homogénéiser la solution mère, vortex aussi avant chaque utilisation.</li>
		<li>Aliquotes aliquotes de solution et magasin à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tréhalose-6, 6-dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>Ajouter 100 µL de DMSO à 1 mg TDB, chaleur à 60 ° C dans un bain-marie pendant 15 à 30 s.</li>
		<li>Vortex et ajouter immédiatement 900 µL de PBS stérile, vortex à nouveau.</li>
		<li>Chauffer pendant 10 à 15 min à 60 ° C et homogénéiser par avant l’utilisation du vortex à chaque utilisation.</li>
		<li>Conserver la solution à 4 ° C.</li>
		<li>Effectuer des dilutions successives et préparation de la dose unique comme pour le composé de MLT-827. Remarque : Parce que le TDB doit être préparé dans le DMSO, une concentration finale de 1 % DMSO est présente lors de la stimulation des cellules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li>
<li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li>
<li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paracaspase+MALT1%3A+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li>
<li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li>
<li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+architecture+of+the+CARMA1%2FBcl10%2FMALT1+signalosome%3A+nucleation-induced+filamentous+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li>
<li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li>
<li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li>
<li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li>
<li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pediatrics%22%5BJournal%5D)">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li>
<li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li>
<li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-%CE%B1+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li>
<li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22265677">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li>
<li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li>
<li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li>
<li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li>
<li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li>
<li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HemITAM%3A+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li>
<li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1001259">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li>
<li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).</li>
<li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , In press (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce travail, nous avons utilisé les paramètres expérimentaux simples pour étudier les voies de signalisation chez les humains et les cellules de souris innée et interroger leur dépendance sur la MALT1 fonction protéolytique. Élargissant le précédent travail11, notre étude a montré que la MALT1 paracaspase activité contrôle type C type lectine récepteurs induit la production de cytokines, dont le TNF-α. En revanche, les TLR 4-induite par le TNF-α est indépendante de la MALT1 chez les deux espèc...

L’activité paracaspase de la MALT1 (protéine de translocation du tissu lymphoïde associé aux muqueuses lymphome 1) a été révélé en 20081,2. Depuis lors, un certain nombre d’études ont signalé sa contribution essentielle aux réponses du récepteur antigène dans les lymphocytes. Modèles génétiques chez la souris ainsie que les données pharmacologiques appuient un rôle clé dans les cellules de T, en auto-immunité dépendante de lymphocytes T et B-cell lymphoma paramètres3,4. Dans les lymphocytes, MALT1 paracaspase activation se produit lors de l’Assemblée d’un CARD11-BCL10-MALT1 complexe5, qui est déclenchée par le récepteur d’antigène-signalisation proximale en aval du récepteur T - ou B-cellule. Il y a aussi amplement prouvé qu’un complexe CARD9-BCL10-MALT1 semblable est important pour la propagation des signaux en aval des récepteurs de type lectine de type C (m.), par exemple, Dectin-1, 2-Dectin et MINCLE dans myéloïde cellules6,7. Dectin-1 a été particulièrement bien étudié car cette voie est critique pour la défense de l’hôte contre les infections fongiques8,9. Implication de la MALT1 dans les voies du récepteur Toll-like (TLR), cependant, est resté controversé10. Des preuves récentes dans les cellules myéloïdes humaines exclue un rôle direct pour l’activité paracaspase MALT1 dans la régulation du TNF-production en aval de TLR-411.
Dans le présent travail, nous avons utilisé divers paramètres expérimentaux, stimulateurs conditions chez les humains et les cellules myéloïdes souris pour sonder les voies de signalisation innées, en s’appuyant sur les inhibiteurs de l’outil pharmacologique spécifique et la mesure de la production de cytokines.

<table><tbody><tr><td>100 et micro ; Crépine à cellules en nylon</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tube Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube Falcon</td><td>Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube Falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat 96 puits, avec couvercle à faible évaporation</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en V 96 puits</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Diluant d’essai RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>Diluant de dosage</td></tr><tr><td>Microplaque de culture cellulaire, 384 puits, noir</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan appauvri</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>maintenant : tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alpha ;</td><td>R& D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleDissociateur</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Sérum</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fœtal bovin inactivé par la chaleur</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha ;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de reconstitution HTRF</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM Tampon phosphate, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2 %</td></tr><tr><td>BSA IFN-&gamma ;</td><td>R& D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isoflurane</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS utilisé dans les échantillons humains</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS utilisé dans les échantillons murins</td></tr><tr><td>Tampon de lyse</td><td>Self-made-155</td><td></td> <td>mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque, 384 puits blanc</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’enrichissement des monocytes</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg ; C Récipient de congélation</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Dispositif de refroidissement (contenant du propanol-2)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td> saline tamponnée au phosphate <td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Streptocoque</td></tr><tr><td>Bicarbonate de potassium - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Solution de résazurine pour l’évaluation de</td></tr><tr><td>la viabilité Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lecture</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tampon à base de Tris contenant de la tripropylamine</td></tr><tr><td>Milieu de congélation de culture cellulaire de récupération</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>Milieu de congélation</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10 % FBS pour iMoDCs + 10 % FBS + 1 mM Pyruvate de sodium + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &micro ; M &bêta-mercaptoéthanol pour PBMC et monocytes humains + 10 % FBS + Pen/Strep + 5 & micro ; M &beta ;-mercaptoéthanol pour splénocytes murins</td></tr><tr><td>Tampon de séparation</td><td>Self-made-PBS</td><td></td> <td>pH 7,4 + 2 % FBS + 1 mM EDTA pH 8,0</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose-6,6-dibehenate</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polysorbate 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td></tr><tr><td>Scelleuse Viewseal</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>dosage multiplex électrochimiluminescent (IL-1&beta ;, TNF-&alpha ;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

règlement de voie signalisation innée myéloïde par malt1 paracaspase activité

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

En plus de sa fonction dans les cellules lymphoïdes, qui a été traitée par de nombreuses études, la paracaspase MALT1 joue également un rôle important dans les cellules innées en aval des récepteurs de reconnaissance de modèle. Mieux étudiés sont les membres de la famille des récepteurs de type lectine de type C Dectin-1 et Dectin-2 qui induisent une fonction SYK et CARD9 signalisation cascade conduisant à l’activation de NF-κB, d’une manière MALT1-dépendante. Par contre, les récepteurs Toll-like (TLR), tels que le TLR-4, propager l’activation de NF-κB, mais le signal via une cascade de MYD88/IRAK-dépendante. Néanmoins, si MALT1 pourrait contribuer à la signalisation TLR-4 est restée incertaine. Des preuves récentes MLT-827, un inhibiteur puissant et sélectif de la MALT1 paracaspase activité, indiquent que TNF-production en aval du TLR-4 dans les cellules myéloïdes humains est indépendante de la MALT1, par opposition à la production de TNF en aval du Dectin-1, qui est MALT1 dépendant. Ici, nous avons abordé la participation sélective des MALT1 en reconnaissance des formes de détection plus loin, en utilisant une variété de préparations cellulaires de souris de l’homme et la stimulation des voies Dectin-1, MINCLE ou TLR-4. Nous avons également fourni des perspicacités supplémentaires en explorant les cytokines au-delà de TNF-et en comparant les MLT-827 à un inhibiteur SYK (Cpd11) et d’un inhibiteur de l’IKK (AFN700). Collectivement, les données fournies preuves supplémentaires pour la MALT1-dépendance du récepteur de type lectine de type C — signalisation en revanche à la signalisation TLR.

Dans les cellules myéloïdes, MALT1 relaie les signaux d’activation en aval de plusieurs récepteurs de type lectine de type C, tels que Dectin-1, 2-Dectin et MINCLE6. Ces voies s’appuient sur les récepteurs contenant du motif (hem) ITAM (p. ex., Dectin-1) ou corécepteurs contenant du motif ITAM (p. ex., FcRγ, pour Dectin-2 et MINCLE) qui recrutent et activer la kinase SYK (Figure 1). Cela conduit à l’activation d’une p...

MALT1 régule l’immunité innée, mais comment dans ce cas reste mal défini. Nous avons utilisé l’inhibiteur sélectif du paracaspase MALT1 MLT-827 à démêler la contribution de MALT1 innée de signalisation en aval des récepteurs Toll-like ou type C de type lectine, démontrant que la MALT1 régule la production de cytokines myéloïde et en aval des récepteurs de type lectine de type C, sélectivement.

Règlement de voie signalisation innée myéloïde par MALT1 Paracaspase activité

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Ainsi, le but de la méthode dans notre manuscrit est de fournir une analyse comparative des voies de signalisation dans les cellules myéloïdes à l’aide de systèmes humains et muraux. Il aide à définir quelle voie de signalisation est impliquée en aval de certains récepteurs de reconnaissance de motifs. Cette méthode est donc simple à mettre en œuvre.Il s’appuie sur les préparations cellulaires primaires et les composés de référence validés, ce qui est essentiel pour l’élucidation des mécanismes de signalisation. Ratiba Touil et Adeline Unterreiner, respectivement scientifique et associée de recherche dans notre groupe, démontreront la procédure. Dans une hotte d’écoulement laminaire mis en place une paire stérile de ciseaux, un bécher d’un litre, et un sac en plastique.Placez le pelage bouffi précédemment obtenu dans le bécher et utilisez les ciseaux pour l’ouvrir soigneusement. À l’aide d’une pipette de 25 mm, ajouter 100 ml de PBS complétés par 2 millimolaires d’EDTA. Mélanger en pipetting lentement de haut en bas.Et puis transférer 25 ml de la couche buffy diluée en six tubes de centrifugeuse conique de 50 ml qui ont chacun été précalillés avec 15 ml de gradient de densité à base de polysaccharide. Centrifugeuse les tubes pendant 20 minutes à 800 g avec accélération modérée sans rupture pour permettre la séparation des cellules en fonction de leur densité. Après centrifugation, trois couches seront visibles, une pastille contenant des globules rouges et des granulocytes, une couche supérieure en plasma et un anneau blanc contenant des cellules mononucléaires périphériques du sang.Utilisez une pipette de 10 ml pour récolter les anneaux PBMC et les transférer dans un nouveau tube de 50 ml. Rechargez-le avec PBS et EDTA. Effectuez trois lavages successifs avec une diminution du temps et de la vitesse de centrifugation, comme le décrit le protocole texte.Après le lavage final, resuspendez la pastille dans 25 ml de tampon de lyse glacée pour lyser les globules rouges par pression osmotique. Incuber la solution à température ambiante jusqu’à ce qu’elle devienne claire. Ajouter ensuite 25 ml de tampon de séparation pour arrêter la réaction.Centrifugeuse à 150 g pendant huit minutes pour laver la solution. Versez le supernatant et resuspendez la pastille avec le tampon de séparation. Après avoir compté les cellules, diluer dans le milieu de la culture jusqu’à 12 500 cellules par puits.Répartir 30 ml de cette suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de puits de 384. Ajoutez ensuite 15 microlitres de quatre solutions composées concentrées à chaque puits et préincubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Si désiré, ajouter le LPS à la concentration finale de 1 ng par ml ou le Zymosan épuisé à une concentration finale de 100 mcg par ml.Puis incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, prenez 10 microlitres du supernatant pour mesurer les niveaux alpha TNF sécrétés. Pour commencer la dilution en série, diluer la solution de stock MLT-827 avec moyen pour atteindre une concentration de 8 micromolaires en une seule fois.Effectuez une dilution en série en six étapes 1:5 à l’aide d’un support avec 0,08% DMSO. Pour se préparer aux tests à dose unique, diluer le MLT-827, l’APN700 et composé 11 solutions de stock avec moyen pour atteindre une concentration de 4 micromolaires en une seule fois. Tout d’abord, ajouter 2 ml d’eau stérile sans endotoxine à 10 mg de zymosan appauvri.Vortex cette solution de stock pour l’homogénéiser. Aliquot la solution, puis stocker les aliquots à 20 degrés Celsius. Dans cette étude, les PBMCs humains et les cellules de la rate de souris sont stimulés soit avec zymosan épuisé, agoniste de déctine-1, soit lipopolysaccharide, agoniste TL4.La libération alpha NTNF dans le surnatant est mesurée après 20 heures. Dans les analyses humaines et souris, le composé MLT-827 bloque sélectivement la production alpha du TNF entraînée par la voie Dectin-1, mais pas par la voie TLR4. Chez les monocytes stimulés par le LPS, la production d’alpha TNF est presque entièrement abrogée par l’APN700, mais elle n’est pas sensible au Cpd11, ce qui est compatible avec la dépendance de la voie TLR4 à l’activité du NF-kappa B et son indépendance sur l’activité du SIC.En revanche, la production alpha de TNF entraînée par Dectin-1 et les MODCs montre une sensibilité au MLT-827, à l’AFN700 et au Cpd11. Cela fournit d’autres preuves de la participation d’une cascade de signalisation CBM de la SIC dans la voie Dectin-1. La production d’IL-1 bêta, IL-6 et IL-23 est également sensible aux trois inhibiteurs, indiquant des mécanismes réglementaires similaires à TNF alpha.Cependant, l’effet limité observé sur la production d’IL-8 suggère que cette cytokine a un mécanisme réglementaire distinct. L’augmentation des concentrations de Tréhalose-dibehenate au-dessus de 50 mcg par ml conduit à la production de bêta TNF alpha, IL-6 et IL-1, qui s’est appuyée sur l’activité malt1 paracaspase selon l’effet de blocage du MLT-827. Des résultats similaires ont été observés lors de la remise en question des MODCs avec des concentrations croissantes de Zymosan épuisé pour stimuler Dectin-1.Cette méthode a permis de montrer que la paracaspase MALT1 régule sélectivement la signalisation des récepteurs de type C. Il est essentiel d’utiliser des composés de référence bien caractérisés. Faites attention à la procédure de dilution des solutions de stock.Ceci est essentiel pour le composé avec une solubilité limitée.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Le dosage de la sialidase est une approche simple technique qui élucidera roman mécanisme moléculaire (s) de capteurs TLR des infections microbiennes et leur implication dans les maladies inflammatoires au niveau des récepteurs à la surface cellulaire de macrophages vivre.

Détection de Neu1 activité sialidase dans la régulation activation du récepteur Toll-like

Imagerie des cellules vivantes de l'apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant...

Surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.

Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis

Ce protocole décrit le flux de travail pour obtenir des macrophages dérivés des monocytes (MDM) à partir d’échantillons de sang humain, une méthode simple pour introduire efficacement des rapporteurs de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) de caspase inflammatoire dans le MDM humain sans compromettre la viabilité et le comportement des cellules, et une approche basée sur l’imagerie pour mesurer l’activation des caspases inflammatoires dans les cellules vivantes.

Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées

Le présent protocole décrit deux méthodes pour mesurer l’activité des caspases à travers un substrat fluorogénique à l’aide de la cytométrie en flux ou d’un spectrofluoromètre.

Mesure de l’activité des caspases à l’aide d’un dosage fluorométrique ou d’une cytométrie en flux

Ici, une méthode basée sur la cytométrie phosphoflow est décrite pour analyser la signalisation en aval des voies mTORC1, JAK/STAT5 et MAPK dans des cellules de leucémie myéloïde humaine aiguë xénogreffées chez la souris et obtenues à partir d’aspirations de moelle osseuse. Les niveaux de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 et p-ERK1/2 sont mesurés simultanément à l’aide d’un cytomètre en flux spectral de nouvelle génération à haute sensibilité.

Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Découvrez l'analyse comparative des voies de signalisation dans les cellules myéloïdes humaines et murines. Cette méthode utilise des cellules primaires et des inhibiteurs sélectifs pour étudier la régulation de la production de cytokines par MALT1.

Règlement de voie signalisation innée myéloïde par MALT1 Paracaspase activité

Explorer plus de vidéos