Name: Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Découvrez la transformation PEG pour exprimer des protéines dans des protoplastes et étudier leur importation dans les chloroplastes. Cette méthode permet d'analyser la localisation protéique in vivo.

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Ce travail a été réalisée avec le soutien du programme de recherche coopérative pour les sciences de l’Agriculture et le développement technologique (projet No PJ010953012018), Administration du développement Rural et la subvention de la National Research Foundation (Corée) financé par le ministère de la Science et de la TIC (no 2016R1E1A1A02922014), République de Corée.

1. la croissance des plantes Arabidopsis
<ol><li>Préparer 1 L Gamborg B5 (B5) moyen en ajoutant 3,2 g de milieu B5 y compris les vitamines, 20 g de saccharose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) éthane sulfonique (MES) à environ 800 mL d’eau désionisée et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter plus désionisée eau porter le volume total de 1 L. ajouter 8 g de phytoagar et stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C.</li>
	<li>Laisser le milieu à refroidir à 55 ° C et verser 20 à 25 mL de milieu B5 dans une boîte de pétri (9 cm de diamètre, 1,5 cm de hauteur) à un banc propre. Plaques sèches pour 2 – 3 jours, les emballer avec emballage propre et garder au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Arabidopsis thaliana de stériliser les graines avec 1 mL d’éthanol à 70 % (v/v) dans un tube à centrifuger (e-tube) en agitant continuellement pendant 2 à 3 min. retirer le surnageant, ajouter 1 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) et agiter continuellement pendant 2 à 3 min. préparer 100 – 150 graines par boîte de pétri.<ol>
<li>Enlevez les surnageants et lavez les graines avec 1 mL d’eau distillée. Répétez cette étape 4 x. Placez les graines stérilisées à 4 ° C pendant 3 jours pour synchroniser la germination des graines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semer les graines de 100 à 150 sur des plaques de B5 à l’aide d’une micropipette et sceller la plaque avec ruban chirurgical.</li>
	<li>Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance avec un cycle lumière/obscurité de 16 h/8 h à 100 µmol·m ·s-1 -2l’intensité lumineuse, de 70 % d’humidité relative et de température de 20 ° C pendant 2 semaines.</li>
</ol>2. préparation du plasmide
Remarque : Les plasmides de haute pureté doivent être utilisés pour la transformation ; l’utilisation d’un kit de purification de plasmide commercial est recommandée.
<ol><li>Purifier le plasmide (globules rouges-nt:GFP) à l’aide d’un kit d’isolation de l’ADN. Pour concentrer l’ADN, effectuer la précipitation d’éthanol dans un tube de 1,5 mL et dissoudre le culot d’ADN dans 100 µL d’eau distillée. Déterminer la concentration du plasmide à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm. Diluer le plasmide à une concentration finale de ~ 2 µg / µL. conserver le plasmide à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>3. isolement de protoplastes
<ol><li>Préparer les solutions suivantes.<ol>
<li>Préparer la solution d’enzyme pour contenir 0,25 % (p/v) macerozyme, cellulase de 1,0 % (p/v), 400 mM D-mannitol, chlorure de calcium 8 mM (CaCl2), 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) et MES de 5 mM. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH.<ol>
<li>Filtrer la solution enzymatique à l’aide d’une unité de filtration d’acétate de cellulose avec une taille de pores de 0,45 µm. Aliquote 25 mL de la solution d’enzyme dans les tubes coniques de 50 mL et conserver à-20 ° C. Décongeler la solution enzymatique à température ambiante (RT) et mélanger bien juste avant utilisation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer une solution de saccharose de 21 % (p/v) en dissolvant 21 g de saccharose dans 100 mL d’eau désionisée et stériliser la solution.</li>
		<li>Préparer la solution W5 contiennent du chlorure de sodium (NaCl) 154 mM, 125 mM CaCl2, 5 mM chlorure de potassium (KCl), glucose 5 mM et 1,5 mM MES. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH et stériliser la solution.</li>
		<li>Préparer la solution de MaMg pour contenir 400 mM D-mannitol, le chlorure de magnésium (MgCl2), 15 mM et 5 mM MES. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH et stériliser la solution.</li>
		<li>Préparer 1 M D-mannitol et 1 M de nitrate de calcium solutions pour rendre la solution de PEG. Autoclave ces solutions.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récolter des tissus foliaires intacts de 2 plantes semaines de ~ 1 à 2 plaques de B5 à l’aide d’un bistouri et place les feuilles récoltées dans une 50 mL conique tube contenant 25 mL de solution d’enzyme. Placer le tube conique contenant des tissus de solution et de feuilles d’enzyme horizontalement sur un agitateur rotatif avec agitation modérée dans l’obscurité. Il faut compter 8 à 12 h pour la digestion complète des tissus foliaires.</li>
	<li>8 à 12 heures après l’incubation, verser la solution enzymatique (contenant des protoplastes libérés des tissus foliaires) frais pétri au travers d’une maille avec 140 µm de porosité. Soigneusement la solution enzymatique protoplaste contenant 15 mL de solution de saccharose de 21 % (p/v) sur le dessus de la couche et il centrifuger à 98 g pendant 10 min avec les plus petits paramètres d’accélération et de décélération dans un rotor oscillant-seau.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, transvaser avec soin les protoplastes de la couche supérieure (solution enzymatique) et à l’interface entre la solution enzymatique et une solution de saccharose à un tube conique de 50 mL contenant 30 mL de solution de W5. Centrifuger à ce tube à 51 x g pendant 6 min. À ce stade, les protoplastes sera dans le culot en bas du tube conique.</li>
	<li>Jeter le surnageant soigneusement à l’aide d’une pipette sans déranger le culot de protoplastes. Ajouter 25 mL de solution de W5 et resuspendre doucement les protoplastes. Incuber la solution de protoplastes dans un réfrigérateur de 4 ° C pendant au moins 1 h pour la stabilisation.</li>
</ol>4. protoplaste Transformation à l’aide de polyéthylène Glycol
<ol><li>Préparer un 40 % PEG solution en ajoutant 4 g de PEG 8000, 4 mL de solution de mannitol de 1 M, 1 mL de 1 M Ca (NO3)2et 1,8 mL d’eau distillée dans un tube conique de 50 mL et bien mélanger. Dissoudre le PEG en chauffant dans un four à micro-ondes pendant 20 à 30 s. Place les 40 % solution PEG à RT pour refroidir. Remarque : Les 40 % PEG solution doit être fraîchement préparée chaque fois. Si les protoplastes sont granulées pas complètement pendant l’incubation de 4 ° C dans le réfrigérateur, centrifuger le matériau à 46 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant délicatement mais complètement et ajoutez MaMg solution au culot protoplaste pour obtenir la concentration de 5 x 106/ml. Remarque : Le nombre de protoplaste peut être déterminé par un hémocytomètre examiné sous un microscope.</li>
	<li>Placer 10 µg de l’ADN de plasmide chaque vide 13 mL tube fond rond et ajouter 300 µL de solution de protoplaste à l’aide d’une pipette. Remarque : L’extrémité de l’embout de la pipette doit être coupée. Chaque fois que les protoplastes sont échantillonnés, la solution contenant du protoplaste devrait être remis en suspension juste avant le pipetage afin que le même nombre de protoplastes est ajouté dans chaque tube.</li>
	<li>Mélanger l’ADN de plasmide avec des protoplastes en tournant doucement les tubes et immédiatement ajouter 300 µL de 40 % PEG solution à l’aide d’une pipette. Mélanger doucement mais complètement en faisant tourner les tubes et les incuber 30 min à température ambiante ; incliner le tube presque horizontalement et tournez-le plusieurs fois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de W5 et mélanger doucement mais complètement en tournant le tube à la main de manière similaire. Incuber l’échantillon pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Répétez cette étape deux fois plus à l’aide de 1,5 mL et 2 mL de solution de W5, respectivement. Incuber 30 min après l’addition finale de solution W5.</li>
	<li>Centrifuger à 46 x g pendant 4 min. jeter le surnageant et ajouter 2 mL de solution de W5. Mélanger doucement mais complètement. Incuber à 22 ° C dans une chambre noire.</li>
</ol>5. analyse de l’importation de protéines dans les chloroplastes
Remarque : Après transformation PEG-négociée des protoplastes, temps d’incubation varie de 8 à 24 h.
<ol><li>
Microscopie en fluorescence
	<ol>
<li>Déposer 10 µL de la solution de protoplaste sur un verre de diapositive à l’aide d’une pipette avec une pointe taillée et soigneusement couvrir avec un lamelle couvre-objet pour éviter d’endommager les protoplastes.</li>
		<li>Place du chariot sur la scène d’un microscope à fluorescence équipé de filtre d’excitation/émission définit pour l’observation de la protéine fluorescente verte (GFP) et auto-fluorescence de la chlorophylle.</li>
		<li>Capturer des images avec un refroidi à dispositif à couplage de charge (CCD) caméra et processus images à l’aide d’un logiciel de retouche d’image pour produire des images de pseudo-couleur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunobuvardage et Extraction des protéines totales
	<ol>
<li>Préparer le tampon de dénaturation contenant 2,5 % (p/v) le dodécylsulfate de sodium (SDS) et 2 % (v/v) 2-mercaptoéthanol. NOTE : Import des protéines dans des chloroplastes peut être quantifié en mesurant le degré de peptide de traitement par immunoblot analyse à l’aide d’anticorps anti-GFP.</li>
		<li>Transférer les protoplastes dans un tube à centrifuger et centrifuger à 46 x g pendant 4 min.</li>
		<li>Retirez le surnageant et ajouter 80 µL de tampon de dénaturation. Vigoureusement vortexer pendant 5 s puis ajoutez 5 x tampon SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, SDS de 10 % (p/v), bleu de bromophénol 0,05 % (p/v) et 50 % (v/v) de glycérol). Bien mélanger et faire bouillir pendant 10 min.</li>
		<li>Sous réserve cet échantillon de protéine standard SDS-PAGE et immunoblotting avec anticorps anti-GFP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
<li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li>
<li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons fourni un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d' Arabidopsis pour étudier l’import des protéines dans des chloroplastes. Cette méthode est puissante pour étudier le processus d’importation de protéines. Cette technique simple et versatile est utile pour examiner le ciblage des protéines cargo destiné aux chloroplastes. En utilisant cette méthode, protoplastes sont préparés à partir des tissus foliaires de Arabidopsis11,12...

Le chloroplaste est l’un des principaux organites chez les plantes. Une des fonctions principales des chloroplastes est de réaliser la photosynthèse1. Chloroplastes accomplissent également de nombreuses autres réactions biochimiques pour la production d’acides gras, acides aminés, nucléotides et de nombreux métabolites secondaires1,2. Pour toutes ces réactions, les chloroplastes nécessitent un grand nombre de différents types de protéines. Toutefois, le génome chloroplastique contient seulement environ 100 gènes3,4. Par conséquent, les chloroplastes doivent importer la majorité de leurs protéines du cytosol. En fait, la plupart des protéines de chloroplastes ont été montrés à être importé du cytosol après traduction4,5,6. Les cellules végétales nécessitent des mécanismes spécifiques pour importer les protéines du cytosol vers chloroplastes. Cependant, bien que ces mécanismes d’importation de protéines ont été étudiées pour les dernières décennies, nous ne comprends toujours pas pleinement leur au niveau moléculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour la préparation des protoplastes et exogène exprimant des gènes dans des protoplastes. Cette méthode pourrait être utile pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents import des protéines dans des chloroplastes en détail.
Import des protéines peut être étudié à l’aide de différentes approches. Une de ces méthodes implique l’utilisation d’un in vitro protéine importation système7,8. En utilisant cette approche, en vitro-précurseurs de protéines traduites sont incubés avec chloroplastes purifiée in vitro, et import des protéines est analysée par SDS-PAGE, suivie par l’analyse par western blot. L’avantage de cette approche est que chaque étape de l’import des protéines dans des chloroplastes peut être étudié en détail. Ainsi, cette méthode a été largement utilisée pour définir les composants de la machinerie moléculaire de protéine importation et disséquer les informations de séquence pour les peptides de transit. Plus récemment, une autre approche impliquant l’utilisation de protoplastes de tissus foliaires a été développée et il a devenu employé couramment pour étudier l’importation de protéines dans les chloroplastes9,10. L’avantage de cette approche est que les protoplastes fournissent un environnement cellulaire qui est plus proche de celle des cellules intactes que le système in vitro . Ainsi, le système de protoplaste nous permet d’aborder de nombreux autres aspects de ce processus, tels que les événements cytosoliques associés et comment la spécificité du ciblage des signaux est déterminé. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier l’import des protéines dans des chloroplastes.

<table><tbody><tr><td>GAMBORG B5 MEDIUM AVEC VITAMINES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>SUCROSE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES MONOHYDRATE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>Agar, poudre</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Ruban chirurgical</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale acier inoxydable No.10</td><td>FEATHER</td><td>Indisponible</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique, 50ml</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Indisponible</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase ONOZUKA R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Indisponible</td><td></td></tr><tr><td>ALBUMINE BOVINE (BSA)VWR</td><td></td> <td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CHLORURE DE CALCIUM, DIHYDRATÉ</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Twister</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>Coupelle d’écran pour CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>Écrans pour CD-1</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>HILGENBERG</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>CENTRIFUGEUSE DE LABORATOIRE / BENCH-TOP</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-GLUCOSE, ANHYDRUS</td><td>BIO BASIC</td><td>GB0219</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de calcium tétrahydraté</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol)</td><td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td><td>SARSTEDT</td><td>55.515</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection de microscope</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 2 Microscope d’imagerie</td><td>Carl Zeiss</td><td>Indisponible</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1.5ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoéthanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS), qualité protéomique</td><td>VWR</td><td>M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS, qualité ultra pure</td><td>VWR</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>TNT (DL-Dithiothreitol), qualité biotechnologie</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium bleu de bromophénol ACS</td><td></td><td>VWR 0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>JUNSEI</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. Anticorps monoclonal (JL-8)</td><td>TAKARA</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier l’import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Le chloroplaste est un organite indispensable qui est responsable de divers processus cellulaires chez les plantes, comme la photosynthèse et la production de nombreux métabolites secondaires et les lipides. Chloroplastes nécessitent un grand nombre de protéines pour ces différents processus physiologiques. Plus de 95 % de protéines de chloroplastes sont noyau codé et importés dans des chloroplastes du cytosol après traduction sur des ribosomes cytosoliques. Ainsi, l’importation appropriée ou le ciblage de ces protéines chloroplastiques noyau codé aux chloroplastes est essentiel au bon fonctionnement des chloroplastes ainsi que la cellule végétale. Chloroplaste noyau codé protéines contiennent des séquences signal pour un ciblage spécifique aux chloroplastes. Les machines moléculaires localisé dans les chloroplastes ou cytosol reconnaître ces signaux et mener le processus d’importation. Afin d’étudier les mécanismes d’importation de protéines ou de ciblage aux chloroplastes in vivo, nous avons développé une méthode rapide et efficace axée sur les protoplastes pour analyser l’import des protéines dans des chloroplastes d’Arabidopsis. Dans cette méthode, nous utilisons des protoplastes isolés de tissus foliaires d’Arabidopsis. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier le mécanisme par lequel les protéines sont importés dans des chloroplastes.

L’importation de protéines dans les chloroplastes peut être examinée à l’aide de deux approches : analyse de microscopie et immuno fluorescence après séparation véhiculée par SDS-PAGE. Ici, nous avons utilisé des globules rouges-nt:GFP, une fusion construire codant les 79 résidus d’acides aminés N-terminaux de globules rouges contenant le peptide de transit fusionné à la GFP. Lorsque les protéines sont importés dans des chloroplastes, fluorescence verte des signaux de la protéine cible Rb...

Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Ce mystère peut aider à répondre à quelques questions dans le domaine de la biologie cellulaire comme l’entrée de protéines dans les chloroplastes. Le principal avantage de cette technologie est que l’entrée de protéines dans les chloroplastes peut être étudiée dans des conditions en vivo. Junho Lee et Hyangju Kang, deux post-outs de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, récoltez les tissus intacts des feuilles des plantes de deux semaines d’une à deux plaques B5. Utilisez un couteau chirurgical pour récolter les feuilles et les placer dans un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution enzymatique. Placez le tube horizontalement sur un shaker rotatif et incubez avec une légère agitation à 22 degrés Celsius dans l’obscurité pendant huit à 12 heures jusqu’à ce que seuls les pétioles et les tiges restent dans la solution.Après avoir terminé l’incubation, filtrer la solution enzymatique contenant des protoplastes libérés à travers un maillage de taille pore de 140 micromètres dans une boîte de Pétri fraîche. Couchez ensuite soigneusement la solution sur 15 millilitres de solution saccharose à 21% dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube dans un rotor balançant seau à 98 gs pendant 10 minutes avec les réglages d’accélération et de décélération les plus faibles.Après cela, utilisez la pipette patura pour enlever soigneusement les protoplastes de la couche supérieure contenant une solution enzymatique et de l’interface entre la solution enzymes et la solution de saccharose. Transférez cette solution dans un tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de solution W5 et inversez le tube pour le mélanger. Centrifuger le tube à 51 gs pendant six minutes.Utilisez une pipette pour jeter soigneusement ce supernatant sans déranger les protoplastes dans la pastille. Ajouter 25 millilitres de solution W5 et suspendre doucement les protoplastes. Pour la stabilisation, incuber dans un réfrigérateur de quatre Degrés Celsius pendant au moins une heure.Après quatre degrés Celsius d’incubation, pelleter complètement les protoplastes en les centrifugant à 46 gs pendant deux minutes. Retirez soigneusement le supernatent complètement et ajoutez la solution MANG à la pastille de protoplaste pour atteindre cinq fois dix à six par millilitre. Utilisez une pipette pour ajouter 10 microgrammes de l’ADN plasmatique et 300 microlitres de solution protoplastique à un nouveau tube à fond rond de 13 millilitres.Mélanger en tournant doucement les tubes à la main, puis ajouter immédiatement 300 microlitres de solution PEG fraîchement préparée à 40%. Mélanger complètement en inclinant le tube presque horizontalement et en le tournant doucement plusieurs fois à la main. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Ajoutez ensuite un millilitre de solution W5 et mélangez complètement en tournant doucement le tube à la main comme auparavant. Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez deux fois de plus avec l’ajout d’abord 1,5 millilitre, puis deux millilitres de W5 et après l’ajout final et le mélange, incuber pendant 30 minutes.Centrifuger le tube à 46 gs pendant quatre minutes, puis jeter le supernatant. Ajouter deux millilitres de solution W5 à la pastille et mélanger délicatement, mais complètement, de la même manière qu’auparavant. Incuber à 22 degrés Celsius dans une chambre sombre pendant 18 heures.Pour analyser l’importation de protéines à l’aide de la microscopie de florescence, utilisez une pipette avec une pointe taillée pour placer 10 microlitres de la solution protoplaste sur une glissière en verre. Utilisez un bordereau de couvercle pour couvrir soigneusement la solution afin d’éviter d’endommager les protoplastes. Placez la diapositive sur la scène d’un microscope à fluorescence avec un filtre d’admission excitation qui est prêt à observer la protéine fluorescente verte et l’autofluorescence chlorophylle.Utilisez une caméra de couple de charge refroidie pour capturer des images et les traiter à l’aide d’un logiciel d’édition imagine pour produire des images pseudo-couleur. Pour l’extraction totale des protéines et l’immunoblotting, retirez un millilitre de la solution protoplastique et mélangez le reste d’un millilitre. Transférer cette solution protoplaste dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 46 gs pendant quatre minutes.Retirer le supernatant après avoir terminé la centrifugation et ajouter 80 microlitres de tampon de dénaturation. Vortex vigoureusement pendant cinq secondes. Ajouter cinq tampons d’échantillon XDS, bien mélanger et faire bouillir pendant 10 minutes pour dénoaturer.Procéder à la page STS standard et immunoblotting avec anticorps anti-GFP. RbcS et TGFT, une construction de fusion codant les 79 résidus d’acides aminés terminaux finaux de RBCS contenant le peptide de transit fusionné au GFP, ont été utilisés pour étudier l’importation de protéines dans les chloroplastes par microscopie de florescence et immunoblotting. Lorsqu’ils sont examinés par microscopie par florescence, les signaux fluorescents verts de la protéine cible fusionnent avec les signaux fluorescents rouges de l’autoflorescence chlorophylle indiquant l’importation de protéines dans les chloroplastes.Après avoir isolé la protéine totale, deux bandes protéiques sont observées dans l’immunoblot, montrant qu’une protéine a été correctement importée dans les chloroplastes. La bande supérieure correspond au précurseur de pleine longueur et à la bande inférieure à la forme traitée après importation dans les chloroplastes. La quantité de la forme traitée de la protéine a augmenté d’une manière dépendante du temps, ce qui suggère que la protéine est importée dans les chloroplastes.Lors de ce développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la fatigue des protéines ou la cueillette des fils membranaires dans arabidopsis.

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour étudier l'importation de protéines dans les chloroplastes isolés sous contrainte. La méthode est simple et rapide, et peut être appliqué pour étudier les conséquences des différentes conditions de stress pour les protéines de chloroplaste importation, et les mécanismes de régulation correspondants.

Analyse des protéines d&#39;importation dans les chloroplastes isolés de plantes stressées

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

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Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.

Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Nous décrivons ici une méthode pour purifier les chloroplastes intacts des feuilles de l’Arabidopsis et leurs trois compartiments secondaires principaux (enveloppe, stroma et les thylakoïdes), en utilisant une combinaison de centrifugations différentielles, gradient de Percoll continue, et gradients de sucrose discontinu. La méthode est importante par subplastidial et localisation sous-cellulaire des protéines par immunotransfert et protéomique.

Préparation des compartiments des chloroplastes d’Arabidopsis pour l’analyse de la localisation de la protéine par immunotransfert ou protéomique

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flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

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Découvrez la transformation PEG pour exprimer des protéines dans des protoplastes et étudier leur importation dans les chloroplastes. Cette méthode permet d'analyser la localisation protéique in vivo.

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