Name: Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Apprenez à générer des nanoliposomes cationiques par la méthode du film sec pour la livraison d'ARN messager in vitro. Cette technique améliore l'absorption cellulaire de l'ARNm et augmente l'expression protéique sans compromettre la viabilité cellulaire.

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1. génération de Nanoliposomes cationique (Figure 1)
<ol><li>Dissoudre les lipides DC-cholestérol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol chlorhydrate) et DOPE (dioléoyl phosphatidyléthanolamine), livrés sous forme de poudre, dans le chloroforme à une concentration finale de 25 mg/mL. Note : Stocker les lipides dissous à-20 ° C.</li>
	<li>Travailler avec 25 mg/mL de solution de ces deux lipides. Mix 40 µL de la DC-cholestérol dissous et 80 µL de la DOPE dissoute dans un flacon en verre. Remarque : La quantité de lipides totaux est de 3 mg. Pour éviter une évaporation rapide du chloroforme, placez les lipides sur glace pendant le pipetage.</li>
	<li>Vaporiser le chloroforme pendant 15 min sous un débit de gaz d’argon. Par la suite, remplissez un dessiccateur avec gel de silice, placer la fiole de verre ouvert à l’intérieur et d’appliquer un vide durant la nuit pour s’assurer que le chloroforme restant s’évapore, et un film lipidique est formé à l’intérieur de la fiole de verre. Remarque : Travailler vite et d’éviter les contacts inutiles de2 O.</li>
	<li>Réhydrater le film lipidique formé avec 1 mL d’eau exempte de nucléase et vortexer la suspension pendant 15 min (Figure 2 a). Par la suite, placez la suspension dans un bain de sonication pendant 1 h (Figure 2 b). Remarque : La suspension sera légèrement nuageuse.</li>
	<li>Assembler l’extrudeuse mini selon les instructions du fabricant, remplissez une seringue avec la suspension de lipides et placez la seringue remplie et une seringue vide des deux côtés de l’extrudeuse. Appuyez sur la suspension des lipides à travers la membrane d’une seringue à l’autre, 20 x – x 25, à extruder la suspension (Figure 2). Remarque : La taille de la PNV est déterminée par la taille des pores de la membrane utilisée.</li>
	<li>Conserver le PNV dans une fiole de verre à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure. Remarque : Après un temps de stockage prolongé, le PNV doit être placé dans le bain de sonication à nouveau pendant 15 min en 35 kHz à contourner la formation d’un complexe.</li>
</ol>2. in Vitro la Transcription de l’ARNm synthétique
<ol><li>Préparer l’eGFP-encodage ARNm suivant le protocole publié plus tôt34.</li>
	<li>Amplifier la séquence eGFP du plasmide avec 0,7 µM de vers l’avant (5'-TTG GAC TDC CGT ACA GAA GCT AAT NOC-3') et inverse (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA CA GAC-3') des amorces et la polymérase kit avec PCR.<ol>
<li>Mélanger 20 µL d’une solution de tampon commercial qui modifie le comportement de fusion de l’ADN (Table des matières), ainsi que 20 µL du mélange 5 x de la trousse de la polymérase. Ajouter 7 µL de chaque amorce (avant et arrière).</li>
		<li>Ajouter 25 ng de plasmide eGFP pour le mélange et 2 µL de polymérase de la trousse de la polymérase. Remarque : Conservez la polymérase sur la glace avant de pipetage il à la solution.</li>
		<li>Ajouter exempte de nucléase H2O et le mélange jusqu'à un volume de 100 µL.</li>
		<li>Exécuter les cycles de la PCR dans le thermocycleur suivant le protocole dans le tableau 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purifier la séquence d’ADN codant eGFP avec le kit de purification de PCR.<ol>
<li>Par conséquent, mélanger la solution PCR avec 500 µL de tampon de liaison de la trousse et utilisez-la pour remplir les colonnes de purification.</li>
		<li>Centrifuger les colonnes à vitesse maximum pendant 1 min et éliminer le filtrat.</li>
		<li>Ajouter 750 µL de tampon de lavage j’ai à la colonne, centrifuger à nouveau au maximum vitesse pendant 1 min, puis annuler le filtrat.</li>
		<li>Répétez l’étape centrifugeuse 1 x pour supprimer le tampon du filtre des colonnes.</li>
		<li>Transférer la colonne pour un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 20 µL d’exempte de nucléase H2O à la colonne, incuber pendant 1 min et centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale. Répétez cette étape.</li>
		<li>Mesurer la concentration de l’ADN avec un photomètre et conserver à-20 ° C.</li>
		<li>Effectuer les analyses de qualité d’ADN par électrophorèse sur gel. Ajouter 0,5 g d’agarose dans un tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) et le faire chauffer au micro-ondes à haute température jusqu'à dissolution complète de l’agarose.</li>
		<li>Ajouter 5 µL de solution de gel de coloration à l’agarose liquide, remplissez la solution dans le compartiment de gel et attendez que le gel est polymérisé.</li>
		<li>Mix 200 ng d’ADN avec 2 µL de 6 x chargement colorant et remplir jusqu'à un volume de fin de 12 µL. pipetter une échelle d’ADN, ainsi que l’échantillon d’ADN, dans les puits du gel et exécutez l’électrophorèse pendant 1 h à 100 V.</li>
		<li>Analyser le gel à l’aide d’une station d’analyse de gel sous la lumière UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez la transcription in vitro pour générer des ARNm de la séquence d’ADN avec un kit transcription in vitro contenant polymérase T7 et substituer les nucléotides modifiés de l’UTP et CTP avec Ψ-UTP et méthyl-CTP.<ol>
<li>Pour la transcription in vitro , mélanger les ingrédients suivant le tableau 2. Remarque : Remplacer 1,5 µL de méthyl-CTP à 01:10 Cy3-CTP dilué en exempte de nucléase H2O pendant la transcription in vitro d’eGFP ARNm pour atteindre Cy3-marquage de l’ARNm.</li>
		<li>Incuber le mélange de réaction IVT pendant 4 h à 37 ° C.</li>
		<li>Ajouter 1 µL de DNase I par la polymérase T7 kit et il incuber pendant 15 min par 37 ° C à digérer la matrice d’ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour purifier les ARNm, utiliser le kit de nettoyage d’ARN.<ol>
<li>Remplir le mélange IVT au volume de 100 µL avec exempte de nucléase H2O.</li>
		<li>Ajouter 350 µL de tampon de lyse et mélanger par pipetage de haut en bas.</li>
		<li>Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % et mélanger à nouveau. Déposer le mélange dans les colonnes de nettoyage.</li>
		<li>Centrifuger pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le filtrat.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de la mémoire tampon de lavage dans une colonne, centrifuger à nouveau pendant 15 s à 8 000 x get enlever le filtrat.</li>
		<li>Laver la colonne 1 x avec 500 µL de tampon de lavage et centrifuger pendant 2 min à 8 000 x g.</li>
		<li>Déplacer la colonne dans un tube à essais frais de 1,5 mL. Éluer les ARNm 2 x par une incubation de 1 min 20 µL d’exempte de nucléase H2O sur la membrane de la colonne, suivie d’une centrifugation de 1 min à vitesse maximale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Supprimer les groupes phosphates de l’ARNm en utilisant un kit de déphosphorylation. Ajouter 4,5 µL de tampon de phosphatase x 10 et 1 µL de phosphatase de l’ARNm et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
	<li>Purifier l’ARNm encore une fois, en suivant les étapes 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Mesurer la concertation d’ARNm avec un photomètre.</li>
	<li>Électrophorèse sur gel permet d’analyser la pureté et la taille de l’ARNm. Par conséquent, préparer un gel d’agarose comme décrit aux étapes 2.3.9 - 2.3.10.<ol>
<li>3.3 mix µL de formamide, 1 µL de 37 % de formaldéhyde, 1 µL de 10 x hommes et 1,7 µL de 6 x chargement colorant avec 200 ng d’ADN messagère et remplissez-le jusqu'à 10 µL exempte de nucléase H2O pour chaque échantillon et marqueur de RNA.</li>
		<li>Incuber le mélange pendant 10 min à 65 ° C, pour dénaturation de l’ARNm. Chargez les puits du gel avec l’ARNm et marqueur de RNA et exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.</li>
		<li>Analyser le gel à l’aide d’une station de doc de gel avec lumière UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la complexation de l’ARNm synthétique
<ol><li>Décongeler l’ARNm synthétique sur la glace, vortex et centrifugeuse peu avant l’ouverture du tube.</li>
	<li>Mix 10 µL d’ARNm synthétique (concentration de l’ARNm est 100 ng/µL) avec 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou 20 µL de suspension de la PNL (PNL concentration est de 3 mg/mL). Centrifuger brièvement et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT) pour la formation de nanolipoplex. Remarque : Ne pas mélanger de pipetage. Cela peut conduire à la perte de volume. Vortex prochainement pour un mélange intime.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu cellulaire ordinaire à la nanolipoplexes et mélangez-les en pipettant également de haut en bas.</li>
</ol>4. analyse de l’efficacité de l’Encapsulation du Nanoliposomes
<ol><li>Pour effectuer les expériences d’encapsulation, utilisez le kit de quantification ARN.</li>
	<li>Préparer la solution de travail en diluant le colorant fluorescent 1 : 200 pour un haut de gamme et 1:2,000 pour un dosage bas de gamme. Remarque : Décongeler le colorant fluorescent sur la glace. Préparer la solution de travail directement avant utilisation.</li>
	<li>Préparer les courbes standards haut de gamme et bas de gamme, à l’aide de 1 mL d’une solution mère de 2 µg/mL d’eGFP ARNm en exempte de nucléase H2O. Remarque : Pour les courbes standards, utilisez l’ARNm qui est utilisés dans les expériences de l’encapsulation.</li>
	<li>Utilisez le tableau 3 pour la préparation de la norme haut de gamme (20 ng/mL - 1 µg/mL).</li>
	<li>Pour le standard de la gamme basse, diluer l’eGFP 2 µg/mL ARNm solution mère 01:20 pour obtenir une concentration finale de 100 ng/mL. Élaborer une norme de bas de gamme (1 ng/mL - 50 ng/mL) comme décrit dans le tableau 4.</li>
	<li>Mélanger 1 µg d’eGFP ARNm (10 µL) et 7,5 µg du PNV (2,5 µL) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Remarque : Conservez l’ARNm sur la glace pour éviter une dégradation.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’exempte de nucléase H2O de forme nanolipoplexes et mix par pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution 1 : 200 ou 1:2,000 de travail du colorant fluorescent RNA aux normes et échantillons encapsulés et incuber pendant 5 min à la RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Pipetter, les normes et les échantillons en double dans une plaque à 96 puits noire et mesurer la fluorescence à 530 nm sur un lecteur de microplaques (Figure 3).</li>
</ol>5. préparation des cellules pour la Transfection
<ol><li>Plaque de 1,5 x 105 A549 cellules/puits d’une plaque de 12 puits 1D avant la transfection.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un milieu cellulaire ordinaire (glucose DMEM/haut avec 10 % sérum de veau fœtal [BF], 2 mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine) pendant 24 h avant la transfection.</li>
</ol>6. la transfection des cellules
<ol><li>Laver les préparés cellules 1 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de mélange nanolipoplex préparés, contenant 1 µg d’eGFP Qu'arnm encapsulée dans 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou PNV 20 µL, à un puits de la plaque préparée avec des cellules A549.</li>
	<li>Ajouter la suspension nanolipoplex aux cellules et incuber pendant 24 h analyser l’efficacité de transfection, ou aux conditions régulières pour 24h et 72 h pour analyser la viabilité cellulaire après la transfection. Remarque : Transfection avec le PNV ne nécessite pas un changement médiatique.</li>
</ol>7. analyse de l’efficacité de Transfection cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et la microscopie de Fluorescence
<ol><li>Retirez le surnageant et laver les cellules avec 1 mL/bien PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) pour enlever le PNV restants.</li>
	<li>Préparer les cellules pour la cytométrie en flux.<ol>
<li>Trypsinize les cellules avec 500 µL/puits trypsine/EDTA (0,05 %) à 37 ° C pendant 3 min. arrêt du processus et inactiver la trypsine en ajoutant la même quantité (500 µL/puits) d’ordinaire milieu contenant du FBS.</li>
		<li>Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g et retirer délicatement le surnageant sans toucher le culot cellulaire.</li>
		<li>Laver les cellules avec 1 mL de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de solution de fixation 1 x et les cellules de transfert dans des tubes de cytométrie de flux.</li>
		<li>Analyser les cellules à 488 nm dans un cytomètre de flux (Figure 4 a). Remarque : Vortex les cellules 1 x directement avant la mesure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les cellules pour la microscopie de fluorescence.<ol>
<li>Fixer les cellules avec 1 mL/puits 100 % de méthanol, qui a été précédemment stocké à-20 ° C.</li>
		<li>Ajouter 500 µL/puits 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phénylindole) dissous dans du PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et incuber pendant 5 min dans le noir.</li>
		<li>Enlever la solution DAPI et laver les cellules encore une fois avec 100 % de méthanol stocké à-20 ° C.</li>
		<li>Analyser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 4 b). Remarque : Utilisez les longueurs d’onde d’excitation/émission suivante : eGFP 488/509 nm, nm DAPI 358/461 et Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. analyse de viabilité de cellules
<ol><li>Dissoudre 5 mg de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dans 1 mL de milieu RPMI (sans rouge de phénol). Remarque : Le MTT dissous doit être plus dilué 01:10 (concentration finale : 0,5 mg/mL) en milieu RPMI avant utilisation.</li>
	<li>Laver les cellules transfectées 3 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 +/Mg2). Remarque : Les restes du milieu cellulaire ordinaire devraient être complètement enlevés.</li>
	<li>Ajouter 500 µL/puits de 01:10 solution MTT aux cellules dilué et incuber pendant 4 h à 37 ° C.</li>
	<li>Enlever la solution MTT des cellules après incubation et ajouter 500 µL/puits DMSO (diméthyl sulfoxyde). Incuber à nouveau pendant 10 min à 37 ° C.</li>
	<li>Dans une plaque de 96 puits clear-fond, déposer la solution DMSO en triolets et mesurer l’adsorption à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.</li>
	<li>La valeur de la viabilité de la cellule non traitée sur 100 % et calculer la viabilité cellulaire des autres groupes en comparaison avec les cellules témoins non traitées (Figure 5).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté décrit la génération du PNV avec efficacité d’encapsulation élevée d’ARNm synthétiquement mis à jour le, ainsi que la fiabilité transfection des cellules in vitro. En outre, le PNV garantie la libération des ARNm, qui à son tour, est traduit en une protéine fonctionnelle à l’intérieur des cellules. En outre, les transfections utilisant le PNV peut être effectuée dans un milieu ordinaire cellulaire, résultant en grande viabilité de cellules au cours de la transfection, et durer jusqu'à trois...

L’utilisation du mRNA modifiés pour des applications thérapeutiques a montré beaucoup de potentiel dans les deux dernières années. Maladies cardiovasculaires, inflammatoires et monogénique, ainsi que dans le développement de vaccins, l’ARNm est agent thérapeutique prometteur1.
Thérapie de remplacement de protéines avec l’ARNm offre plusieurs avantages sur la thérapie génique classique, qui repose sur la transfection d’ADN dans les cellules de cible2. La fonction ARNm lance directement dans le cytosol. Bien que le plasmide ADN (pDNA), une construction de double-brin, circulaire ADN contenant une région promotrice et une séquence de gène codant pour la protéine thérapeutique3, également des actes dans le cytosol, il peut seulement être incorporé dans les cellules qui traversent la mitose au moment de la transfection. Cela réduit le nombre de cellules transfectées dans le tissu1,4. Plus précisément, la transfection des tissus ayant une activité faible mitose, telles que les cellules cardiaques, est difficile5. Contrairement à pDNA, la transfection et la traduction des ARNm produisent dans les cellules mitotiques et non-mitotique dans le tissu1,6. L’intégration virale d’ADN dans le génome hôte peut venir avec des effets mutagènes ou réactions immunitaires7,8, mais après la transfection de cellules avec un ARNm codant des protéines, la synthèse de novo de la protéine désirée commence de manière autonome9,10. En outre, la synthèse des protéines peut être ajustée précisément au besoin du patient par le biais de doses individuelles, sans interférer avec le génome et risquer des effets mutagènes11. Le potentiel d’activation immunitaire des ARNm synthétiquement généré pourrait être considérablement réduit en utilisant des pseudo-uridine et 5'-méthylcytidine au lieu de l’uridine et cytidine12. Pseudo-uridine, mis à jour le mRNA a également été montré pour avoir une meilleure stabilité biologique et une significativement plus élevée capacité translationnelle13.
Pour pouvoir bénéficier des propriétés prometteuses de la thérapie axée sur les ARNm en applications cliniques, il est essentiel de créer un véhicule adapté pour le transport de l’ARNm dans les cellules. Ce véhicule devrait porter non toxique propriétés in vitro et in vivo, de protéger l’ARNm contre la nucléase-dégradation et fournir absorption cellulaire suffisante pour une disponibilité prolongée et la traduction de l’ARNm de14.
Parmi tous les types de support possible pour in vivo l’administration de médicaments, tels que les nanotubes de carbone, points quantiques et liposomes, ces derniers ont été étudiées les plus de15,16. Liposomes sont des vésicules constituée d’une bicouche de lipides10. Ils sont amphiphiles comporte un hydrophobe et une partie hydrophile, et grâce à l’entente autonome de ces molécules, une double couche sphérique est formé de17. Dans les liposomes, agents thérapeutiques ou drogues peuvent encapsulés et, ainsi, protégés de dégradation enzymatique18. Liposomes contenant N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorure (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(triméthylammonio) propane] (DOTAP)20et21de dioctadecylamidoglycylspermine (chiens), ou DC-cholestérol22, sont bien caractérisées et fréquemment utilisé pour la transfection cellulaire avec l’ADN ou d’ARN.
Les liposomes cationiques forment un lipide chargé positivement et un phospholipide sans inculpation23. La transfection par l’intermédiaire des liposomes cationiques est l’une des méthodes plus courantes pour le transport d’acides nucléiques dans des cellules24,25. Les particules de lipide cationique forment des complexes avec les groupes phosphates chargés négativement dans le squelette de l’acide nucléique molécules26. Ces soi-disant lipoplexes fixent à la surface de la membrane cellulaire et entrer dans la cellule par endocytose ou endocytose-mécanismes27.
En 1989, Malone et al. avec succès décrits médiée par les lipides cationiques ARNm transfection28. Toutefois, à l’aide d’un mélange de DOTMA et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), le groupe a estimé que DOTMA manifeste des effets cytotoxiques28. En outre, Zohra et coll. ont montré que DOTAP (chlorure de 1, 2-dioleoyloxy-3-triméthylammonium-propane) peut être utilisé comme un ARNm transfection réactif29. Toutefois, pour la transfection efficace des cellules, DOTAP doit être utilisé en combinaison avec d’autres réactifs, tels que la fibronectine29 ou30de la DOPE. Jusqu'à présent, DOTMA a été le premier lipide cationique sur le marché utilisé pour la livraison de gène31. Autres lipides sont utilisées comme supports thérapeutiques ou sont actuellement testés à différents stades d’essais cliniques (p. ex., EndoTAG-I, contenant DOTAP comme un transporteur de lipides), est actuellement à l’étude dans un essai clinique de phase II32.
Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération du PNV contenant DC-cholestérol et DOPE. Cette méthode est facile à réaliser et permet la génération du PNV de différentes tailles. L’objectif général de génération de PNL à l’aide de la méthode sèche-film est de créer des liposomes pour la complexation de l’ARNm, ce qui permet de transfection de cellules efficace et biocompatible en vitro14,33.

<table><tbody><tr><td>(Bromure de cholestérol (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Allemagne</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta ;-[N&prime ;,N&prime ;--diméthylaminoéthane)-carbamoyl]chlorhydrate de cholestérol (DC-Cholesterol)</td><td>Avanti, Alabama, États-Unis</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp ; &prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD Système FACScan</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Allemagne</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, États-Unis</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini extrudeuse</td><td>Avanti, Alabama, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>tampon PBS (sans Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs d’ARN Quant-iT Ribo Green</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (sans rouge de phénol)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silice</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA (0,05 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit de polymérase HotStar HiFidelity</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>28104<</td><td></td></tr><tr><td>br/> Pseudouridine-5'-triphosphate (&Psi ;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, États-Unis</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-méthylcytidine-5'-triphosphate (méthyl-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, États-Unis</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Allemagne</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute ;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Structure du chapeau d’ARN Analogique</td><td>New England Biolabs, Ipswich, États-Unis</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase antarctique</td><td>Nouveau Angleterre Biolabs, Ipswich, États-Unis</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, États-Unis</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD Mélange d’échelle d’ADN</td><td>VWR, Pennsylvanie,</td><td>États-Unis 25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0,5-10 kb Échelle d’ARN</td><td>Fisher Scientific, G&ouml ; teborg, Suède</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de in vitro transcrit l’arn messager

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Le développement de l’ARN messager (ARNm)-fonction thérapeutique pour le traitement de diverses maladies devient plus important à cause de la positive propriétés de in vitro transcrit mRNA (IVT). Avec l’aide de l’ARNm de l’IVT, la synthèse de novo d’une protéine désirée peut être induite sans changer l’état physiologique de la cellule cible. En outre, biosynthèse des protéines peut être contrôlée avec précision en raison de l’effet transitoire du mRNA IVT.
Pour la transfection efficace des cellules, nanoliposomes (PNV) peut représenter un véhicule de livraison sûre et efficace pour l’ARNm thérapeutique. Cette étude décrit un protocole pour générer sûre et efficace cationique PNV composée de DC-cholestérol et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) comme un vecteur de livraison d’ARNm IVT. PNV ayant une taille, une répartition homogène et une capacité élevée de complexation et peut être produites à l’aide de la méthode sèche-film. Par ailleurs, nous présentons des systèmes de test différent afin d’analyser leur complexation et efficacité de transfection utilisant synthétique renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) mRNA, ainsi que leur effet sur la viabilité des cellules. Globalement, le protocole présenté fournit une approche efficace et sans danger pour la complexation d’ARNm, qui peut faire avancer et améliorer l’administration de l’ARNm thérapeutique.

En utilisant le protocole comme décrit, PNV consistant en des lipides DC-cholestérol et DOPE ont été préparés selon la méthode de sec-film (Figure 1). Pendant la préparation, la solution de nanoliposome montre différentes étapes de la turbidité (Figure 2).
L’efficacité de l’encapsulation de la PNV peut ensuite être analysée après l’encapsulation de 1 µg d’ARNm codant eG...

Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Ce protocole permet la production de nanoliposomes sûrs et efficaces qui peuvent être utilisés comme véhicules de transfection pour l’ARN messager thérapeutique. Ces nanoliposomes facilitent l’absorption de l’ARNm dans les cellules, ce qui augmente les niveaux d’expression des protéines sans affecter la viabilité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est la génération rapide et facile de nanoliposomes stables avec une taille définie et une distribution homogène.En outre, ils protègent l’ARNm encapsulé contre la dégradation et conduisent à une traduction prolongée. Antonia Link, doctorante de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, préparer des solutions de stock pour les lipides, dc-cholestérol et DOPE en dissolvant chacun dans le chloroforme à une concentration finale de 25 milligrammes par millilitre.Mélanger 40 microlitres du cholestérol DC dissous avec 80 microlitres du DOPE dissous dans un flacon de verre. Vaporiser le chloroforme sous un flux de gaz argon pendant 15 minutes. Ensuite, remplissez un dessiccator avec du gel de silice.Placez le flacon de verre ouvert à l’intérieur et appliquez un vide pendant la nuit pour vous assurer que le chloroforme restant est évaporé. Le film lipidique qui en résultera se formera à l’intérieur du flacon de verre. Le lendemain, ajouter un millilitre d’eau sans nucléase pour réhydrater le film lipidique.Et vortex de la suspension pendant 15 minutes. Placez la suspension dans un bain de sonication pendant une heure. Après cela, assembler le mini extrtruder selon les instructions des fabricants.Remplissez une seringue avec la suspension liquide et placez-la d’un côté de l’extrème. Placez une seringue vide de l’autre côté. Appuyez sur la suspension lipidique à travers la membrane d’une seringue à l’autre, environ 20-25 fois pour extruder la suspension.Ensuite, conservez les nanoliposomes dans un flacon de verre à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Tout d’abord, décongeler l’ARNm synthétique sur la glace. Vortex de l’ARNm congelé, puis centrifugeuse peu de temps avant l’ouverture du tube.Ensuite, mélangez un microgramme de l’ARNm synthétique avec diverses quantités de suspension nanoliposome. Centrifugeuse brièvement et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour la formation de nanolipoplex. Ensuite, ajoutez millilitre de milieu cellulaire régulier au nanolipoplex et mélanger en pipetting de haut en bas.Préparer les cellules un jour avant la transfection. Par conséquent, plaque 150.000 cellules A549 dans chaque puits d’une plaque de puits 12 un jour avant la transfection. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et milieu cellulaire régulier pendant 24 heures.Puis le lendemain, lavez chaque puits de cellules préparées une fois avec un millilitre de PBS. Ajouter un millilitre d’un mélange de nanolipoplex préparé à l’un des puits contenant les cellules A549. Incuber à des conditions régulières pendant 24 heures pour analyser l’efficacité de la transfection, ou pendant 24-72 heures pour analyser la viabilité cellulaire après la transfection.Retirer le supernatant et bien laver avec un millilitre de PBS pour enlever les nanoliposomes restants. Pour préparer les cellules à la cytométrie, ajoutez d’abord 500 microlitres de trypsine EDTA à chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour trypsiniser les cellules. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu régulier contenant du FBS pour arrêter le processus et inactiver la trypsine.Centrifuger les cellules à 400 fois G pendant cinq minutes. Et retirez soigneusement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire. Lavez les cellules avec un millilitre de PBS.Puis re-suspendre les cellules dans 300 microlitres de solution de fixation cellulaire et les transférer dans des tubes de cytométrie d’écoulement. Utilisez un cytomètre d’écoulement pour analyser les cellules à 488 nanomètres. Pour préparer les cellules à la microscopie par fluorescence, ajouter un millilitre de méthanol réfrigéré à chaque puits pour fixer les cellules.Ajouter 500 microlitres d’une solution nanomolaire de 300 nanomolaires de DAPI dissous dans PBS à chaque puits. Incuber dans le noir pendant cinq minutes. Après cela, retirez la solution DAPI et lavez les cellules à nouveau avec 100% de méthanol qui était précédemment stocké à moins 20 degrés Celsius.Utilisez un microscope à fluorescence pour analyser les cellules à l’aide des longueurs d’onde d’excitation et d’émission montrées ici. Dans cette étude, les nanoliposomes sont générés avec une efficacité élevée d’encapsulation pour l’ARNm synthétiquement modifié. À l’aide du kit de quantification de l’ARN, l’efficacité de l’encapsulation des nanoliposomes peut être analysée après l’encapsulation d’un microgramme d’ARNm codant eGFP en analysant la quantité libre d’ARNm qui n’est pas encapsulée.Après l’encapsulation de l’ARNm EGFP en différentes quantités de nanoliposomes, les nanolipoplexes formés peuvent être incubés avec des cellules in vitro et le pourcentage de cellules exprimant l’eGFP peut être analysé à l’aide de la cytométrie du débit 24 heures après la transfection. Comme on le voit ici, même un seul microlitre de la solution nanoliposomes est suffisant pour atteindre une transfection élevée des cellules invitro. Lorsque les cellules sont transfectées avec des nanoliposomes contenant de l’ARNm EGFP étiqueté Cy3, la présence de l’ARNm eGFP dans le cytoplasme, ainsi que la protéine eGFP déjà produite, peuvent être visualisées.Puisque la transfection des cellules utilisant des nanolipoplexes peut avoir des effets défavorables sur des cellules, la viabilité des cellules a été examinée après 24 heures et 72 heures post-transfection. Aucun effet sur la viabilité des cellules n’a pu être détecté lorsque les cellules ont été traitées avec 2,5 ou cinq microlitres de nanolipoplexes. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans un environnement sans éthanol tout le temps parce que cela pourrait nuire à la stabilité nanoliposome.Tout en préparant et en mélangeant le DC-cholestérol avec DOPE, vous devriez utiliser une pipette en verre pour éviter la contamination des lipides dissous avec des composants solubles des bouts de pipette en plastique. Suivant ce protocole, les nanoliposomes générés peuvent être facilement manipulés pendant ou après la préparation. Par exemple, l’incorporation de molécules PEG ou d’anticorps spécifiques entraînerait une stabilité accrue ou lancerait un ciblage actif des tissus.Les nanoliposomes générés remplissent les aspects de sécurité nécessaires et facilitent l’absorption de l’ARNm dans les cellules cibles. Les nanoliposomes complexes avec un ARN thérapeutique spécifique peuvent apporter une contribution essentielle au développement de nouvelles thérapeutiques à base d’ARNm dans le domaine de l’ingénierie tissulaire ou de la thérapie de remplacement par exemple.

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Bioengineering

Bioingénierie

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l'expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n'a pas d'effets indésirables et évite les accidents mortels.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

L’objectif de ce protocole est d’utiliser des liposomes cationiques/anioniques avec un peptide neuro-ciblant comme système d’administration du SNC pour permettre aux siRNA de traverser la BHE.  L’optimisation d’un système d’administration pour les traitements, comme les siRNA, permettrait davantage d’options de traitement pour les prions et d’autres maladies neurodégénératives.

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On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.

Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques

Les nanoparticules lipidiques sont développées à l’aide d’une approche de plate-forme de mélange microfluidique pour l’encapsulation de l’ARNm et de l’ADN.

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Les méthodes de production de nanoparticules lipidiques (LNP) à base de microfluidique ont attiré l’attention dans les systèmes d’administration de médicaments (DDS), y compris l’administration d’ARN. Ce protocole décrit les processus de fabrication, de production de LNP (LNP chargé de siRNA) et d’évaluation LNP à l’aide de notre dispositif microfluidique original nommé iLiNP.

Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Une nanoparticule peptide-poloxamine auto-assemblée (PP-sNp) est développée à l’aide d’un dispositif de mélange microfluidique pour encapsuler et délivrer in vitro de l’ARN messager transcrit. L’ARNm/PP-sNp décrit pourrait transfecter efficacement des cellules cultivées in vitro.

Transfection efficace d’ARNm transcrit in vitro dans des cellules cultivées à l’aide de nanoparticules de peptide-poloxamine

Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.

Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique

Un protocole détaillé pour la synthèse de nanoparticules lipidiques (LNP) à l’aide de technologies de mélangeur à jet d’impact confiné (CIJ), y compris un CIJ à deux jets et un mélangeur vortex multi-entrées à quatre jets (μMIVM), est présenté. Les mélangeurs CIJ génèrent des environnements de micro-mélange reproductibles et turbulents, ce qui permet de produire des LNP monodispersés.

Synthèse de nanoparticules lipidiques par écoulement turbulent dans des mélangeurs à jet d’impact confinés

Apprenez à générer des nanoliposomes cationiques par la méthode du film sec pour la livraison d'ARN messager in vitro. Cette technique améliore l'absorption cellulaire de l'ARNm et augmente l'expression protéique sans compromettre la viabilité cellulaire.

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

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