Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions protéiques en permettant la détection de nouveaux partenaires contraignants pour les protéines extracellulaires, à la fois à haut débit et avec une sensibilité élevée. Le principal avantage de cette méthode est que, avec seulement quelques microgrammes de protéines, vous pouvez générer des centaines de diapositives à l’aide de l’imprimante micro tableau. Utilisez un micro-tableauur standard pour l’impression de diapositives.

Cet instrument a une capacité de 57 diapositives par course, utilise une tête d’impression tenant 48 broches de repérage, et peut accueillir jusqu’à 8000 taches par diapositive. Produire des plaques de travail à l’aide de 384 plaques de puits à 10 microlitres d’échantillon par puits à partir des plaques de stock. Effectuez cette étape manuellement, avant l’impression de diapositives à l’aide du micro arrayer.

Repérage ensuite des protéines avec des épingles de repérage de type piquant sur des glissières de silane époxy à 60% d’humidité pour empêcher la déshydratation des taches protéiques. L’albumine de sérum bovin étiquetée Cy3 peut être repérée en double entre chaque échantillon de protéines pour visualiser le tableau pour l’ajustement du masque. Après l’impression, retirez les diapositives de micro-tableau protéique de l’environnement humidifié.

Ensuite, utilisez un brumère ultrasonique pour générer une fine brume de solution de blocage qui s’installe sur la surface de la glissière. Ensuite, bloquez les glissières pendant la nuit avec 5% de lait dans PBST pour activer la surface. Conservez les glissières à moins 20 degrés Celsius à 50 % de glycérol pour éviter le gel.

Les interactions entre les protéines extracellulaires sont souvent caractérisées par leurs faibles affinités. Pour permettre la détection de ces interactions, en augmentant l’avidité contraignante, nous avons développé une approche multivalente basée sur la capture de la protéine interrogée exprimée sous forme de domaines extracellulaires marqués FC sur les microbilles enduites de protéines A. Faites tourner le transporteur IgG, qui a été étiqueté avec du colorant mono réactif Cy5 tel que décrit dans le protocole de texte.

Pour calculer le rapport molaire de la protéine de requête et de l’IgG Cy5, divisez le poids moléculaire de la protéine de requête par le poids moléculaire de l’IgG et multipliez par 40 microgrammes par millilitre pour déterminer la concentration de Cy5 IgG nécessaire. Une fois que tous les ratios ont été déterminés forment le complexe de protéines de perle micro en combinant la requête marquée FC et l’IgG Cy5 avec la protéine A micro perles. Mélanger la suspension en PBS sur un rotateur à tube pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Pour commencer le criblage, réchauffez les glissières préparées à température ambiante avant de les charger sur la station d’hybridation. Pour effectuer le criblage, lavez d’abord le micro-tableau avec PBST pendant une minute pour enlever le glycérol résiduel. Chargez 200 microlitres d’un milligramme par protéine millilitre A dans le lait PBS 5% et incubez pendant 30 minutes pour empêcher les microbilles de protéines A non complexées de se lier aux protéines étiquetées FC qui peuvent être présentes dans le micro-tableau.

Après que la station d’hybridation lave les glissières avec PBST, chargez 200 microlitres du complexe de micro perles de requête, en présence d’un milligramme par millilitre de protéine A et incubez pendant 30 minutes. Après hybridation et lavage des glissières par la station d’hybridation, rincer les toboggans à l’eau et les placer dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres. Séchez les tubes en tournant à 900 fois G pendant cinq minutes.

Enfin, numérisez les diapositives à l’aide d’un scanner micro-réseau approprié pour détecter la fluorescence Cy3 et Cy5 en excitant à 532 et 635 nanomètres, respectivement. Il est indiqué ici une image représentative d’une diapositive imprimée. Les taches d’albumine de sérum bovin étiquetées Cy3 sont en vert.

Les spots ont été imprimés en double comme un contrôle de qualité du processus d’impression. Les résultats représentatifs d’une protéine orpheline, sélectionnés pour l’identification des partenaires liants à l’aide de la technologie de micro-réseau de protéines extracellulaires, sont présentés ici. Les taches rouges en double sont identifiées comme un succès pour la protéine de requête filtrée.

Cette méthode qui est décrite est très polyvalente et peut être utilisée pour l’impression d’une gamme de bibliothèques de protéines, qu’il s’agit de familles de protéines spécifiques ou de grandes compilations de protéines comme la nôtre. Toute protéine d’intérêt peut être évaluée. Tout en essayant cette procédure, il est important de manipuler les diapositives avec soin et de s’assurer qu’elles ne se dessèchent pas afin d’éviter la perte d’activité des protéines imprimées.

Après l’écran d’une protéine d’intérêt, il est fortement conseillé de valider davantage les coups observés en utilisant des technologies orthogonales, telles que la résonance plasmon de surface. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier les interactions protéiques extracellulaires chez l’homme.