Utilisation de résonance paramagnétique électronique dans des échantillons biologiques à température ambiante et à 77 K
11 janvier 2019
Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.
La signalisation de redox dysregulated est impliquée dans la pathogénie de diverses maladies. L’étude de la biologie du redox nécessite la détection précise d’espèces réactives d’oxygène dans différents compartiments cellulaires et tissulaires. La spectroscopie EPR est la seule méthode qui mesure sans ambiguïté les radicaux libres.
Ce protocole démontre une méthode pratique pour la manipulation et le stockage d’échantillons biologiques pour la spectroscopie EPR. Ces protocoles illustrent l’utilisation d’EPR et de sondes spin dans deux modèles représentatifs. Bien qu’ils puissent être adaptés pour évaluer les espèces actives dans d’autres milieux biologiques.
La conception de l’expérience et la manipulation de l’échantillon sont essentielles à sa reproductibilité. Nous vous recommandons d’envisager la densité cellulaire et d’assurer des contrôles adaptés au temps. Commencez par laver doucement les cellules brutes de 264,7 avec un millilitre de Tampon Krebs-Henseleit ou KHB, par puits.
Et traiter les cellules avec 500 microlitres de KHB, complétées par 100 micromil de DTPA par puits. Pour prétraiter avec la dismutase de superoxyde, ajoutez 15 microlitres de stock de dismutase de superoxyde, ou véhicule, à chaque puits, et placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin du prétraitement de dismutase de superoxyde, ajoutez 12,5 microlitres de CMH de 10 millimolaires et 40 microlitres de 125 micromolar PMA solution de travail aux puits appropriés, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes.
Placez immédiatement les plaques sur la glace et recueillez le tampon de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de KHB frais plus DTPA à chaque puits et grattez doucement les cellules du fond de chaque puits. Puis résuspendez les suspensions cellulaires avec pipetting et transférez les cellules dans des tubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace.
Pour la détection du superoxyde à température ambiante, chargez d’abord 50 microlitres d’un tampon ou d’un échantillon cellulaire dans un tube capillaire et scellez le tube. Placez immédiatement le tube dans le spectromètre paramagnetic électronique, ou EPR, et définissez les paramètres d’acquisition de l’EPR pour les mesures de température ambiante. Testez toujours un échantillon vierge de tampon contenant la même concentration de sonde traitée dans les mêmes conditions expérimentales qu’un contrôle.
Pour la détection du superoxyde à 77 degrés Kelvin, chargez 150 microlitres d’un échantillon dans un morceau de polytétrafluoroéthylène droit d’un à deux pouces, ou PTFE, tube, avec un bouchon en caoutchouc à une extrémité. Sceller l’autre extrémité du tube à l’intérieur d’un deuxième bouchon et congeler l’échantillon dans de l’azote liquide. Retirez ensuite rapidement les bouchons et placez le tube PTFE dans un cryotube étiqueté pour le stockage de l’azote liquide.
Pour les mesures EPR, remplissez le déwar doigt du spectromètre EPR avec de l’azote liquide et placez le tube PTFE contenant l’échantillon dans l’azote liquide. Placez le bout des doigts dans le spectromètre EPR et définissez les paramètres d’acquisition de l’EPR pour les mesures à 77 degrés Kelvin. Pour la détection ros dans les tissus pulmonaires congelés, placez le tissu sur la glace sèche et utilisez des pinces à épiler pour stabiliser le tissu flash-congelé sur la glace sèche.
Couper l’échantillon en cinq morceaux de 15 milligrammes et peser les morceaux dans un tube goudronné de 1,5 millilitre. Ajouter 196 microlitres de KHB plus DTPA et quatre microlitres de CMH à l’échantillon, et incuber l’échantillon pulmonaire pendant une heure dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius avant de pelleter les fragments de tissu avec une brève centrifugation. Placez ensuite l’échantillon sur la glace avant de transférer 150 microlitres du supernatant dans un morceau de tube PTFE pour le gel flash en préparation de la mesure epr comme nous venons de le démontrer.
L’évaluation de la production totale de superoxyde dans les cellules brutes de 264,7 stimulées par la PMA comme démontré, révèle que la concentration de nitroxide dans la suspension cellulaire et le tampon des cellules traitées par pma est similaire, en raison de la nature perméable et de l’équilibrage rapide de la sonde spin. Le signal des radicaux nitroxides augmente dans les cellules brutes de 264,7 stimulées par pma, par rapport aux cellules de contrôle, mais pas dans les cellules prétraitées avec la dismutase de superoxyde cellule-imperméable. La concentration de nitroxide obtenue à basse température dans 264,7 cellules brutes après stimulation par PMA est également atténuée en présence d’une dismutase de superoxyde compatible avec les données sur la température ambiante.
La concentration de nitroxide est augmentée dans le sang et le liquide de lavage bronchoalveolar des souris bleo et des souris traitées, aussi bien qu’à l’intérieur des supernatants des morceaux récoltés de tissu de poumon des souris de bleo et des animaux blessés, comparés aux contrôles PBS-traités. En outre, après injection rétro-orbitale de sonde de spin, les souris de bleo et les animaux traités démontrent un signal plus élevé de sonde de spin comparé aux contrôles. Ces protocoles pratiques permettront aux chercheurs de tester la production de radicaux libres dans différents compartiments cellulaires et échantillons biologiques par EPR, y compris des mesures à basse température.
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Aperçu
Cet article présente une méthode pratique pour la collecte et la manipulation d'échantillons biologiques destinés à la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). La RPE est une technique unique permettant la mesure sans ambiguïté des radicaux libres, qui jouent un rôle crucial en biologie redox.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie redox
- Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE)
- Détection des radicaux libres
Contexte
- Un signal redox dysrégulé est associé à diverses maladies.
- La détection précise des espèces réactives de l'oxygène est essentielle dans la recherche biologique.
- La spectroscopie de RPE est la seule méthode qui permette des mesures sans ambiguïté des radicaux libres.
- Cette étude porte sur les protocoles de manipulation et de stockage des échantillons biologiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode pratique de prélèvement d'échantillons pour la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE).
- Illustrer l'utilisation de sondes de spin sélectives dans des contextes biologiques.
- Fournir des protocoles adaptables à divers modèles biologiques.
Méthodes utilisées
- Prélèvement d'échantillons biologiques pour les mesures de RPE.
- Utilisation de sondes de spin sélectives pour la détection des radicaux libres.
- Protocoles de traitement et de stockage des échantillons.
- Application des méthodes à des modèles biologiques représentatifs.
Résultats principaux
- Les protocoles facilitent efficacement la manipulation et le stockage des échantillons.
- La spectroscopie de RPE fournit des mesures fiables des radicaux libres.
- Les sondes de spin peuvent être adaptées à divers contextes biologiques.
- L'étude démontre la polyvalence de la RPE en biologie redox.
Conclusions
- La spectroscopie de RPE est un outil précieux pour l'étude des radicaux libres.
- Une manipulation adéquate des échantillons est cruciale pour des mesures précises.
- Les méthodes présentées peuvent améliorer la recherche en biologie redox.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection précise des espèces réactives de l'oxygène (ROS) est essentielle pour comprendre la signalisation redox dans les mécanismes des maladies et la validation des cibles. La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) permet une mesure directe et sans ambiguïté des radicaux libres, facilitant ainsi la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. Cette méthode renforce la fiabilité prédictive en autorisant la quantification des ROS spécifique à chaque compartiment dans des modèles cellulaires et tissulaires, orientant ainsi les décisions « aller/nʼy aller pas » dans les programmes précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en détectant des niveaux physiologiques d'espèces spécifiques de ROS avec une grande spécificité.
- Valeur opérationnelle : Différencie le superoxyde extracellulaire du superoxyde cytosolique à l'aide de sondes perméables aux cellules et de contrôles avec SOD, précisant ainsi l'implication des voies métaboliques.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques biologiques grâce à des mesures quantitatives du superoxyde résolues par compartiment dans des modèles pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval grâce à un marquage standardisé par des sondes de spin et à une stabilisation des échantillons.
- Reproductibilité : Permet le stockage des échantillons à -80 °C et leur analyse à 77 K, assurant des mesures EPR cohérentes entre les lots et les sites.
- Extensibilité : Facilite l'évaluation fiable de composés en permettant le transfert et la réutilisation d'échantillons congelés pour un criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Détecte le superoxyde dans les tissus pulmonaires, le sang et le liquide de lavage broncho-alvéolaire provenant de modèles de lésions, soutenant ainsi l'alignement translationnel des biomarqueurs.
- Continuité préclinique : Relie les résultats in vitro à des modèles in vivo grâce à des stratégies identiques de détection des sondes paramagnétiques (par exemple, CPH, mito-TEMPO-H).
- Progression ajustée au risque : Guide les décisions de progression en confirmant l'interaction avec la cible par modulation des ERO dans des contextes physiopathologiques pertinents.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La spectroscopie de RPE s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible jusqu'à la validation préclinique, en fournissant une confirmation orthogonale des effets liés au mécanisme sur la signalisation redox.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses en quantifiant le superoxyde dans des compartiments cellulaires spécifiques à l'aide de sondes paramagnétiques sélectives et de contrôles enzymatiques.
- Criblage : Assure la préparation reproductible des échantillons et leur cryoconservation, offrant ainsi une lecture fiable et reproductible des radicaux libres pour des bibliothèques de composés.
- Analyse : Génère des signaux quantitatifs de nitroxyde proportionnels à la concentration en superoxyde, permettant la comparaison entre différentes conditions et l'évaluation de la réponse dose-dépendante.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en détectant les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les surnageants tissulaires et les fluides biologiques provenant de modèles de maladies.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour le profilage redox dans divers domaines thérapeutiques, réduisant ainsi les développements méthodologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Permet une détection sans ambiguïté des radicaux libres, réduisant ainsi l'incertitude mécanistique dans la validation des voies redox.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des cinétiques normalisées de sondes de spin, une manipulation contrôlée des échantillons et des options de mesure à basse température.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant une preuve directe de la modulation des ERO dépendante de la cible, réduisant ainsi l'échec biologique en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en confirmant la fidélité mécanistique des composés dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en spectroscopie de RPE et en chimie des sondes paramagnétiques pour une sélection adéquate des sondes et une interprétation précise des données.
- Dépend de l'accès à un spectromètre de RPE doté de capacités permettant des mesures à température ambiante et à 77 K.
- Exige des protocoles standardisés concernant la densité cellulaire, les durées d'incubation et l'utilisation de témoins appariés afin d'assurer la comparabilité des données.
- Implique des adaptations selon les différents systèmes modèles (par exemple, cellules en culture versus tissu pulmonaire), en ce qui concerne l'administration des sondes et le traitement des tissus.
- Présente des limites pratiques, notamment la nécessité d'utiliser des tubulures spécialisées stables à des températures cryogéniques et une manipulation soigneuse pour éviter la dégradation des sondes paramagnétiques.
