Name: Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez la séparation des complexes thylakoïdes d'épinards par électrophorèse sur gel vert natif et leur caractérisation par comptage de photons uniques corrélé dans le temps. Cette méthode rapide permet d'analyser les connexions énergétiques en une seule journée.

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Financement et le soutien ont été fournis par le département de chimie à la Michigan State University.

1. préparation de Solutions stock pour le coulage des Gels natifs de vert
<ol><li>Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour résoudre les gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 8,3.</li>
	<li>Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour empilage gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 6,3.</li>
	<li>Stocker ces tampons à 4 ° C pour empêcher la croissance de moisissures. Remarque : Les tampons sont stables pendant des mois à 4 ° C, préparation de 100-200 mL de chaque tampon pour une utilisation continue est recommandée.</li>
	<li>Préparer 1 L de 10 x tampon contenant 250 mM Tris HCl, pH 8,3, glycine de 1,92 M et le 1 % SDS. Stocker les 10 de mémoire tampon en cours d’exécution sur la paillasse.</li>
</ol>2. préparation de la Solution stock pour l’isolement et la solubilisation des thylakoïdes
<ol><li>Préparer 100 mL de tampon d’homogénéisation TMK contenant un tampon Tris 50 mM (pH 7), 10 mM MgCl2et 10 mM KCl et conserver à 4 ° C. Note : Ceci est le tampon principal pour l’homogénéisation et la manipulation des échantillons de thylakoïdes. Alternativement, des solutions concentrées de stock peuvent être préparées et diluées selon les besoins (tampon Tris, MgCl2et KCl peut tous être facilement stocké sur la paillasse comme concentre de 1 M).</li>
	<li>Préparer les solutions des thylakoïdes des détergents de solubilisation, B-décyl maltoside (DM) et n-octyle B-d-glucoside (OG), en dissolvant chaque détergent dans un tampon TMK 20 % w / v gel à-20 ° C dans les parties aliquotes 1 mL.</li>
	<li>Préparer le tampon de solubilisation de thylakoïdes (SB), qui est également le tampon de dissociation de l’échantillon.<ol>
<li>Tout d’abord, faire TMK-glycérol tampon en combinant 7 ml de tampon TMK et 3 ml de glycérol.</li>
		<li>À 800 μL de tampon de TMK-glycérol, ajouter 100 μL de solution étalon de DM et 100 μL de solution d’OG. Conserver cette solution de travail de SB, contenant OG DM et 2 % 2 %, congelé à-20 ° C dans les parties aliquotes 1 mL. Remarque : Chaque aliquote peut être décongelé et recongelé selon les besoins.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coulée vertes Mini Gels pour une utilisation ultérieure
<ol><li>Préparer distinct empilage et résoudre les solutions gel dans des éprouvettes jetable de 15 mL. Remarque : Les volumes fournis sont suffisants pour un simple gel mini à l’aide d’entretoises 1,5 mm.<ol>
<li>Pour faire la solution de gel empilement, mélanger 1,25 mL 4 x 3,25 mL d’eau pour donner 5 mL de 4 % d’acrylamide dans 1 x tampon empilement empilement tampon de gel et 0,5 mL de solution mère de 40 % d’acrylamide (39 : 1 C). Pour faire la solution de gel résolution combiner 1,875 mL 4 x résolution 4,7 mL d’eau pour obtenir 7,5 mL de 5 % d’acrylamide dans 1 x solution tampon tampon et 0,94 mL de solution mère de 40 % d’acrylamide (39 : 1 C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verser le gel résolution.<ol>
<li>Ajouter 50 μL de persulfate d’ammonium 10 % (APS) à la solution de gel résolution, puis ajouter 10 μL de TEMED, bouchon du tube et retourner doucement plusieurs fois pour mélanger. Versez immédiatement la solution de gel entre les plaques de gel, en laissant environ 1 cm entre le haut du gel résolution et bas des dents peigne pour le gel de concentration.</li>
		<li>Pipetez doucement 100 % éthanol sur le dessus du gel résolution au niveau du gel. Remarque : Si le gel ne définit pas moins de 15 min, il faudrait une solution fraîche APS et/ou TEMED nouvelle doit être utilisé.</li>
		<li>Après le gel a polymérisé (l’interface entre le gel et l’éthanol sera facilement visible et ne se déplacera pas lorsque le gel est perturbé), décanter de l’éthanol et la tache avec un papier absorbant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verser le gel de concentration.<ol>
<li>Ajouter 25 μL de 10 % APS à la solution de gel empilement, ajouter 5 μl de TEMED, ensuite cap et inverti de mélanger de la même manière que le gel résolution. Verser la solution de gel sur le dessus du gel résolution jusqu'à ce que l’espace entre les plaques est complètement rempli et insérer un peigne de 10 puits. Remarque : Lorsque vous êtes prêt à servir, retirer le peigne du gel et rincer les puits avec de l’eau, en s’assurant que les puits sont droites et non obstruée par le gel. Le gel peut être stocké avec le peigne en place à 4 ° C pendant au moins plusieurs jours.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l’isolement des Membranes des thylakoïdes brut des épinards laisse
Remarque : Toutes les étapes effectuer sur glace à l’aide de tampons et matériel préalablement réfrigérée. Éclairage tamisé est également recommandée. Selon la discrétion de l’expérimentateur et les processus biologiques à l’étude, les inhibiteurs de protéase ou phosphatase devraient être ajoutés frais aux tampons TMK avant l’homogénéisation.
<ol><li>Complètement homogénéiser les feuilles d’épinards dans un tampon TMK avec un homogénéisateur Dounce de verre. Note : Environ 1 à 2 mL de tampon est normalement suffisante pour une feuille d’épinard petit bébé. Une feuille d’épinard seul bébé permettent généralement assez de matériel pour charger plusieurs puits sur un gel mini de 1,5 mm.</li>
	<li>Filtrer l’homogénat de feuille brute pour enlever les débris insolubles.<ol>
<li>Pour faire un simple dispositif de filtrage, couper une tâche délicate essuyer au semestre et pliez-la en quartiers. Emballez la tâche délicate de lingette au fond d’une seringue de 5 mL et pré mouillage l’essuyer avec un tampon TMK.</li>
		<li>Le piston de la seringue permet d’appuyer sur excès de tampon sur la lingette tâche délicate et n’oubliez pas que le filtre de la lingette est pressé fermement au fond de la seringue après que le piston est supprimé.</li>
		<li>Pipeter l’homogénat de feuille vers le centre du filtre nettoyer et utiliser le piston pour passer l’homogénat à travers le filtre. Recueillir l’homogénat filtrée dans un tube à centrifuger 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger l’homogénat à 5 000 x g pendant 10 min à 4° C pour granuler matières insolubles, y compris les membranes thylakoïdes. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de tampon TMK.</li>
	<li>Normaliser la quantité de chlorophylle dans chaque échantillon en ajustant le volume de chaque échantillon de thylakoïdes resuspendues afin que chaque échantillon contienne la même quantité totale de chlorophylle, tel que décrit ci-dessous. Remarque : Ceci permettra à chaque échantillon à être solubilisées dans le même volume de détergent et minimise la variabilité de la solubilisation en raison des différences dans le volume de granulés.<ol>
<li>Pour extraire la chlorophylle de chaque échantillon des membranes des thylakoïdes remises en suspension, prendre un 50 μL aliquote dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 950 μl de méthanol. Boucher le tube et mélanger en retournant plusieurs fois.</li>
		<li>Centrifuger l’extrait de méthanol/chlorophylle à 10 000 x g pendant 10 min granuler protéines précipitées.</li>
		<li>Déterminer la concentration de chlorophylle du pigment contenant du surnageant selon Porra et al. 23. prendre des mesures d’absorbance à 652 et 665 nm à l’aide d’un spectrophotomètre et une cuvette de 1 cm. Déterminer la concentration de chlorophylle totale à l’aide de l’équation suivante : Chls a + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)</li>
		<li>À l’aide de mesures de concentration de chlorophylle comme guide, enlevez et jetez quelques volume de chaque échantillon, si nécessaire, afin que chaque tube contient la même quantité totale de chlorophylle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Re-pellet membranes thylakoïdes par centrifugation à 5 000 x g pendant 10 min. enlever et jeter le surnageant. Veillez à supprimer tous les surnageant sans aspirer tout le culot.</li>
</ol>5. la solubilisation des Membranes des thylakoïdes pour le chargement des Gels natifs
<ol><li>Décongeler une partie aliquote de la solution détergente TMK 30 % glycérol (SB) et inverser plusieurs fois pour mélanger. Gardez-le sur la glace.</li>
	<li>En ajoutant le volume approprié de SB pour donner une concentration de chlorophylle de 1 mg/mL, dissoudre le culot de thylakoïdes. Note : Cette concentration est un point de départ pour trouver les conditions optimales de solubilisation, qui doivent être déterminées de manière empirique. La concentration de chlorophylle doit rester les mêmes entre les échantillons pour permettre des comparaisons valables à apporter.</li>
	<li>Pipetter en haut et en bas à plusieurs reprises tout en prenant soin d’éviter de faire mousser de l’échantillon. Rester sur la glace afin de permettre à solubiliser les thylakoïdes. Remarque : Solubiliser pendant au moins 10 minutes. Temps de solubilisation devrait être assez longtemps que la différence de temps de solubilisation entre les échantillons est réduit au minimum. Exemple : Si 3 minutes sont nécessaires pour solubiliser tous les échantillons, puis environ 30 minutes devraient pouvoir de solubilisation.</li>
	<li>Centrifuger les thylakoïdes solubilisées à 10 000 x g à 4 ° C pour granuler matière insoluble. Remarque : Solubilisée thylakoïdes échantillons sont stables sur la glace pendant des heures, mais conservation à-70 ° C doit être évitée, comme les cycles de gel-dégel peuvent provoquer une perte de mégacomplexe bandes.</li>
</ol>6. séparation des protéines des thylakoïdes solubilisée par électrophorèse sur Gel natif
<ol><li>Charger le surnageant de thylakoïdes solubilisée préparées à l’étape 5.4 directement sur le gel natif préparée plus tôt. Pour un gel de 1,5 mm, charge 15 μL de thylakoïdes solubilisée par puits.</li>
	<li>Exécutez le gel vert natif dans essentiellement la même manière que les gels SDS-PAGE à l’aide de 1 x tampon. Exécutez le gel à 100 V et placez le réservoir de gel tout sur glace mouillée pendant la durée de la course afin d’atténuer le chauffage résistif du gel. Remarque : Le gel devrait nécessiter environ 2 heures pour le pigment libre à l’avant de la migration pour atteindre le fond du gel (Figure 1).</li>
</ol>7. l’excision des thylakoïdes complexe bandes de Gels natifs de vert
Remarque : Excision de la bande spécifique d’intérêt du gel est nécessaire pour permettre à la bande pour être placé dans le chemin du faisceau et empêcher fluorescence parasite de complexes à proximité d’être collecté.
<ol><li>Retirer le gel de la cellule de l’électrophorèse, puis rincez exécutant tampon hors les plaques de gel avec de l’eau distillée. Enlever la plaque supérieure du gel et de rincer le gel avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Conserver le gel sur la plaque de verre de fond et placer le gel et la plaque sur la glace. Quand pas en service, garder le gel dans l’obscurité et recouvrir d’une pellicule de plastique pour éviter qu’il ne se dessèchent pas.</li>
	<li>Avec le gel restant sur la plaque de verre, l’accise chaque bande d’intérêt lorsqu’il est prêt pour l’analyse TCSPC. D’accise bandes proprement avec un scalpel tranchant ou une lame de rasoir et veiller à ce que la bande excisée ne contient aucun matériel de bande contaminantes.</li>
</ol>8. collecte des spectres de Fluorescence en état stationnaire de la température ambiante
<ol><li>Pour chaque complexe qui est analysé par TCSPC, un spectre de fluorescence de la température ambiante est pris entre 600 et 800 nm à l’aide d’un spectromètre à fluorescence. Remarque : La longueur d’onde d’excitation utilisée pour recueillir ce spectre doit correspondre à la longueur d’onde utilisée pour TCSPC.</li>
</ol>9. TCSPC des bandes de Gel vert
Remarque : Reportez-vous à la Figure 2 pour une description de la configuration TCSPC.
<ol><li>"Sandwich" de la tranche de gel entre deux lames microscopie de verre. Utilisez du ruban, placés à chaque extrémité de l’une des lames microscopie et plié à plusieurs reprises, pour créer des entretoises pour que les diapositives peuvent être tenus ensemble fermement sans comprimer la tranche de gel. Remarque : Cela va créer un chemin pour le faisceau laser à passer entre les lames de microscope et par l’intermédiaire de la tranche de gel.</li>
	<li>Ajouter une petite quantité d’eau à la tranche de gel sur le bord des lames de verre pour créer une interface lisse qui réduire la diffusion du signal.</li>
	<li>Pince dans la marche des rayons, la gel/diapositive sandwich afin que le faisceau frappe la tranche de gel par le bord libre des plaques, permettant l’émission de fluorescence à travers le côté des lames de verre où le gel est pris en sandwich, perpendiculaire au trajet du faisceau. Remarque : La longueur d’onde d’excitation utilisée dépendra de l’expérience. Une longueur d’onde de 435 nm va exciter la chlorophylle a et b de chlorophylle, tandis que 465 nm va exciter préférentiellement la chlorophylle b. Dans ce cas, 435 nm a été utilisé comme la longueur d’onde d’excitation.</li>
	<li>Collecter 10 000 points de données total à intervalles réguliers à travers le spectre d’émission de fluorescence pour chaque complexe. Par exemple, recueillir des données toutes les 10 nm, commençant à 680 nm et se terminant à 750 nm. Note : Préparez plusieurs bandes de gel pour chaque complexe à étudier ce nouvel échantillon est donc disponible dans le cas où le Photoblanchiment empêche la collection signal adéquat.</li>
</ol>10. TCSPC (analyse des données)
<ol><li>Pour un immeuble donné, tout d’abord normaliser la hauteur de chaque courbe de décroissance pour toutes les longueurs d’ondes recueillies. Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire pour la construction de la DAS, mais permet des courbes de décomposition d’être superposées et comparées visuellement entre eux comme une première inspection des données.</li>
	<li>Queue-match chaque courbe de décroissance pour le spectre de fluorescence de l’état stationnaire du complexe tel que décrit ci-dessous.<ol>
<li>Choisissez un validant, après quoi le signal de la désintégration a aplati, habituellement au bout de quelques nanosecondes.</li>
		<li>Pour chaque longueur d’onde, normaliser la courbe de décroissance de sorte que l’intensité du signal en le validant sélectionné est égale à la valeur du spectre fluorescence stabilisé à cette longueur d’onde (c'est-à-dire, les valeurs de toutes les longueurs d’onde ensemble à la validant sélectionné recrée le spectre de fluorescence de l’état stationnaire).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construire des spectres de décomposition-associé (DAS) partir des courbes de décroissance queue assortie, tel que décrit ci-dessous.<ol>
<li>À l’aide de données points à partir des courbes de décroissance queue assortie construire une série de parcelles en traçant la courbe intensité de fluorescence vs longueur d’onde à intervalles réguliers (par exemple, chaque 10 ps). Par exemple, le DAS à 50 ps est construit en reportant la valeur de chaque courbe de décroissance à 50 ps vs longueur d’onde.</li>
		<li>Superposition de tous les spectres associés à désintégration pour créer un terrain de style cascade qui montre la décomposition du spectre de fluorescence au fil du temps.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Une solubilisation de thylakoïdes réussie et le gel natif exécuter seront traduira par la résolution de plusieurs bandes distinctes de verts visibles sur le gel sans distorsion importante ou bavures des bandes. Surcharge le gel, une forte concentration de détergent, un pH de l’échantillon incorrect, non dissous matériel, tourne le gel trop rapidement ou à une température trop élevée, et un gel mal coulé sont autant de facteurs qui peut-être contribuer aux complexes de thylakoïdes mal résolus. Tout en optimisant les condi...

Les organismes photosynthétiques doivent ajuster en permanence leur physiologie à l’évolution des conditions environnementales afin de maximiser leur productivité et soutenir la concurrence avec les voisins de1. Ceci est particulièrement vrai pour le mécanisme responsable des lumière des réactions de photosynthèse, comme la lumière ambiante conditions peuvent fluctuer de trois ordres de grandeur entre les ombres et plein soleil. En outre, les facteurs environnementaux tels que la sécheresse, froid ou de chaleur peuvent réduire la disponibilité de dioxyde de carbone pour la fixation du carbone, qui est l’évier électron naturelle pour les produits des réactions lumière. Plantes doivent, par conséquent, récolter et utiliser le rayonnement solaire aussi efficacement que possible tout en conservant la capacité de dissiper le surplus d’énergie lumineuse que nécessaire. Tandis que photooxidative dommages se produisent encore régulièrement au titre de l’ensemble de conditions de lumière2,3, incapacité à gérer les énergie d’excitation absorbé avec succès peut conduire à la lésion des cellules catastrophique et la mort. Plusieurs mécanismes d’adaptation existent qui permettent à l’appareil photosynthétique à accorder aux changements de conditions d’environnement, tant à des fluctuations transitoires (p. ex., sur des échelles de temps longues et courtes)4. Il s’agit de la réponse à long terme (LTR) et non photochimique trempe (QNP). QNP est lui-même considéré comme pour englober au moins trois autres phénomènes de composant, y compris les transitions d’État (qT), trempe rapidement inductible de l’énergie (qE) et photoinhibition (qI)5.
Ces processus ont été initialement observés et définis en grande partie en termes de phénomènes spectroscopiques [p. ex. QNP se réfère à une goutte d’eau dans la fluorescence de la chlorophylle observés (extinction de fluorescence de la chlorophylle) qui n’est pas due à une augmentation du taux de photochimie]6. « Les transitions d’état » de la même façon on entend le changement observé dans la quantité relative de la fluorescence du PSI et PSII7. Alors que les techniques spectroscopiques qui ont fait l’énumération de ces phénomènes possible [en particulier, la spectroscopie de fluorescence (PAM) modulation d’amplitude d’impulsion] et continuent d’être un moyen vital d’observation et dissection photosynthétiques processus dans Vivo, beaucoup de biochimie est nécessaire afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent ces observations spectroscopiques. Transitions de l’États, par exemple, implique un cycle de phosphorylation/déphosphorylation des protéines LHCII par la protéine kinase STN7 et TAP38/PPH1 phosphatase, respectivement8,9,10. Ce programme permet de régler la distribution physique de l’antenne LHCII entre les deux photosystèmes en déplaçant une partie des trimères LHCII de PSII au PSI, modifiant ainsi l’absorption coupe transversale des photosystèmes11,12. Le composant qE de QNP se transforme rapidement en énergie d’excitation excessive en chaleur par l’intermédiaire de l’action de la violaxanthine/zéaxanthine époxydation/de-époxydation cycle et la protéine de l’OSP. Le rôle exact des organes subsidiaires principaux dans ce processus, c’est pas encore pleinement compris13. Le composant de qI de QNP, photoinhibition, est généralement attribué aux dommages à la protéine D1 du PSII. Restauration de compétence pleine photosynthèse nécessite un processus de réparation complexe pour résoudre endommagé photocenters PSII. Le cycle de réparation PSII implique la migration des complexes PSII hors les piles contiennent, démantèlement des complexes, remplacement des protéines endommagées de D1, remontage des complexes PSII et mouvement des complexes PSII dans les piles contiennent14. La nature exacte de la photoinhibition et PSII photovieillissement reste un objet d’un examen minutieux,15.
Les transitions de la difficulté à étudier des phénomènes comme l’état ou la réparation PSII découle en partie du fait qu’il n’y a pas un moyen simple de visualiser la mécanique des systèmes biochimiques complexes. L’approche biochimique classique pour comprendre un processus consiste à séparer ses composants afin qu’ils peuvent être caractérisés en vase clos. Électrophorèse sur gel natif découle d’efforts couronnés de succès dans les années 1980 à séparer et à caractériser les complexes de photosystème des membranes thylakoïdes avec plusieurs méthodes préparatives (centrifugation en gradient de saccharose et chromatographie)16. Les détergents systèmes développés pour solubiliser doucement les complexes natives des membranes thylakoïdes étaient bientôt adaptés aux méthodes de séparation par électrophorèse, plus particulièrement par Allen et Staehelin17 et et Peter et Thornber18, donnant lieu électrophorèse sur gel vert natif. Alors que le seul représentant de diverses techniques dans l’arsenal expérimentale, natif de PAGE a un certain nombre de caractéristiques attrayantes qui en ont fait une méthode couramment employée dans la recherche de la photosynthèse. PAGE native est relativement rapide et simple, nécessitant des équipements peu spécialisés, tout en assurant simultanément la séparation de haute résolution d’un grand nombre de complexes de thylakoïdes. Cela rend PAGE native, un outil pratique pour l’étude dynamique des thylakoïdes et, lorsqu’il est combiné avec une PAGE standard dans la deuxième dimension, mais aussi une variété de systèmes de détergent et de la mémoire tampon, un système polyvalent pour la trouver et la caractérisation de nouveaux complexes de thylakoïdes.
Cela étant dit, gels verts natifs ont eu la réputation d’être une technique peu fiable, en particulier dans des mains inexpérimentées, tel qu’il est facile de produire des résultats médiocres, consistant en des gels floues, graisseux avec peu de bandes. Ce problème a été résolu, en partie, avec l’introduction de bleu-indigène PAGE19. L’utilisation de colorant coommassie dans le système de tampon ne rend la séparation de protéines plus robustes. Par conséquent, BN-PAGE est souvent une technique plus facile et plus fiable pour un novice relative à mettre en place et peut fournir des séparations de haute résolution de thylakoïdes complexes. Pour ces raisons, BN-PAGE est devenu la méthode de choix pour la plupart des travaux de ce champ. BN-PAGE est généralement plus lente à gérer que l’électrophorèse sur gel vert, son inconvénient principal est que la coloration coommassie interfère avec l’identification de faibles bandes contenant de la chlorophylle, tout en s’en aval spectroscopiques caractérisation de problématique.
L’information biochimique fournie par gels natifs et SDS-PAGE 2D peut être considérablement renforcée lorsqu’il est combiné avec les données techniques spectroscopiques. Quel que soit le système utilisé, un problème central avec l’aide de gels natifs pour identifier des complexes est que l’identification peut toujours être contestée (c'est-à-dire, les protéines trouvées dans une bande pourrait toujours représenter complexes migrent ou composants, plutôt qu’un seul complexe physiologiquement authentique). Caractérisation spectroscopique fournit des informations biophysiques sur les pigments dans les bandes de gel vert et peut être utilisée pour déterminer quels types de complexes, elles sont susceptibles de contenir. Fluorescence de la chlorophylle est particulièrement utile à cet égard en raison de la souvent radicalement différents spectres et les durées de vie de fluorescence qui sont caractéristiques des complexes protéiques-pigment photosynthétique. Alors que les spectres de fluorescence simple équilibre 77K ont été historiquement utiles pour confirmer l’identité des complexes de gel natif, moderne temps-corrélé de photon unique comptant (TCSPC) peut fournir beaucoup plus d’informations. TCSPC permet non seulement de la caractérisation des complexes basées sur des durées de vie de fluorescence, mais rend aussi possible la description détaillée du transfert d’énergie entre les composantes spectrales au sein d’un complexe. Ce genre de caractérisation devient de plus en plus nécessaire que l’utilisation des différents systèmes "spreads" de gel natif et nouveaux complexes putatifs sont découverts, permettant l’identification des complexes de protéines doivent être mieux authentifiées et offrant de nouvelles données biophysiques sur le fonctionnement de ces complexes.
Dans cet article, nous fournissons une méthode qui permet à ceux ayant peu ou pas d’expérience avec électrophorèse native de parvenir haute qualité de thylakoïdes native complexes aux fins de l’enquête sur les mécanismes des réactions de lumière photosynthèse. Cette technique de base peut ensuite être augmentée à la discrétion de l’expérimentateur pour améliorer les résultats ou étendre l’applicabilité à d’autres espèces. Nous décrivons ensuite le processus pour soumettre les bandes de gel vert natif à TCSPC, ainsi que quelques étapes de base analyse et présentation des données fournies par la technique. Le couplage de l’électrophorèse sur gel natif avec analyse TCSPC étend l’utilité de ces systèmes de gel en fournissant l’authentification et la caractérisation biophysique des complexes protéiques dans les bandes. Le système de gel vert décrit ici repose sur développé par Allen et Staehelin17 avec quelques modifications, qui est le même que celui utilisé dans Schwarz et coll.. 20. ce système est un des nombreux mais a des spécificités qui sont utiles pour cette méthode. C’est assez rapide pour que l’isolement des thylakoïdes, électrophorèse sur gel et TCSPC analyse pratique peuvent être effectuées en une seule journée, il ne soit pas des problèmes potentiels de conservation de l’échantillon et de la dégradation. Nous constatons également que cette méthode est robuste dans les mains des utilisateurs inexpérimentés, tout en offrant des résultats qui vont du bon au supérieur, selon le degré d’optimisation.
Il est important de garder à l’esprit que les complexes visualisées sur un gel natif dépendant sur le détergent et le tampon des systèmes utilisés, ainsi que sur la biologie de l’organisme incriminé. Différents systèmes de détergent et tampon préférentiellement séparent différents types de complexes, et un organisme photosynthétique donné auront différents complexes provenant d’autres organismes, pas ce qui se présentera sous aucune circonstance donnée. Le système décrit ici est particulièrement adapté à l’étude des megacomplexes PSI, comme décrit dans Schwarz et al. 20, mais il tombe sur la fin plus déstabilisante du spectre pour ceux qui étudient la PSII megacomplexes. Pour une étude approfondie des différents systèmes de détergent et de la mémoire tampon utilisée en électrophorèse native des protéines des thylakoïdes, il est recommandé de revoir Järvi et al. 21 et Rantala et al. 22.

<table><tbody><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>#648310</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Décyl Maltoside</td><td>Sigma</td><td>D7658</td><td>n-décyl bêta d maltopyranoside, pas dodécyl maltoside ou alpha décyl maltoside</td></tr><tr><td>Octyl Glucoside</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>37,5/1 C solution à 40 %</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr></tbody></table>

séparation des épinards thylakoïdes complexes des protéines par électrophorèse de gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de photon unique time-correlated

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Les réactions de la lumière de la photosynthèse sont effectuées par une série de complexes de protéine pigmentée dans les membranes des thylakoïdes. La stoechiométrie et l’organisation de ces complexes est très dynamique sur long et des échelles de temps courtes en raison de processus qui s’adaptent à la photosynthèse à l’évolution des conditions environnementales (c.-à-d. non photochimique trempe, les transitions d’État et le réponse à long terme). Historiquement, ces processus ont été décrits par spectroscopie en fonction des changements dans la fluorescence de la chlorophylle, et spectroscopie reste une méthode indispensable pour la surveillance des paramètres photosynthétiques. Il y a un nombre limité de façons dont la dynamique complexe de protéine sous-jacentes peut être visualisée. Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour la séparation à haute résolution et la visualisation des thylakoïdes complexes, électrophorèse sur gel vert natif. Cette méthode est couplée avec le temps-corrélé de photon unique comptant pour une caractérisation détaillée des propriétés de fluorescence de la chlorophylle de bandes séparées sur le gel vert.

Les résultats représentatifs pour l’électrophorèse de gel vert sont présentés dans la Figure 1. Lane 1 fournit un exemple des résultats idéaux pour l’électrophorèse de gel vert des épinards thylakoïdes, dans lequel un nombre maximal de bandes vertes claires et nettes est visible. Ces résultats sont quelque peu atypiques, en partie parce que pas toutes les bandes vus en piste 1 sont normalement présents dans un échantillon donné. Nettoyage d’échantillon supplé...

Nous présentons ici un protocole visant à séparer les thylakoïdes solubilisée complexes par électrophorèse sur Gel natif de vert. Gel vert bandes sont caractérisés par la suite par temps en corrélation unique Photon Counting (TCSPC) et les étapes de base pour l’analyse de données sont fournis.

Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Cette méthode est utile pour répondre à certaines questions clés dans le domaine de la recherche sur la photosynthèse, comme le sont les complexes thylakoïdes putatifs physiologiquement réels avec des composants énergétiquement connectés? Le principal avantage du gel vert et du protocole TCSPC décrit ici est qu’il est rapide et robuste. Les échantillons peuvent facilement être traités et analysés en une seule journée, ce qui rend les questions d’entreposage et de stabilité moins préoccupantes.Bien que TCSPC puisse fournir un aperçu des systèmes photosynthétiques que nous avons étudiés ici, il peut également être appliqué à d’autres systèmes allant du produit chimique au physique et biologique tels que les études du mouvement moléculaire fluorescent dans les liquides, les cellules, ou les motifs nouveaux-structurels tels que les couches monomoléculaires et les liquides ioniques. Pour commencer cette procédure, préparez les solutions de stock nécessaires et les mini gels verts tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Ensuite, obtenir de la glace et éteindre les lumières.À l’aide d’un homogénéisateur dounce en verre, homogénéiser complètement les feuilles d’épinards dans environ un à deux millilitres de tampon TMK. Pour créer un simple dispositif de filtrage, coupez une tâche délicate essuyez-la en deux et pliez-la en quartiers. Retirez le piston d’une seringue, puis emballez l’effacement plié dans le fond de la seringue.Pipette la feuille homogénéise au centre du filtre d’effacement des tâches, puis utilisez le piston pour passer l’homogénéité à travers le filtre et le recueillir dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse l’homogénéisation à 5000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter le matériau insoluble, y compris les membranes thylakoid. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon TMK.Pour extraire la chlorophylle de chaque échantillon, prenez un aliquot de 50 microlitres et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 950 microlitres de méthanol, capuchon le tube, et mélanger en l’inversant plusieurs fois. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 minutes pour granuler les protéines précipitées.À l’aide des mesures de concentration de chlorophylle comme guide, retirez et jetez un peu de volume de chaque échantillon au besoin jusqu’à ce que chaque tube contienne la même quantité totale de chlorophylle. Centrifugeuse à 5000 g pendant 10 minutes pour re-pelleter les membranes thylaïdes. Retirer et jeter le supernatant, en prenant soin d’enlever tout le surnatant sans déranger la pastille.Tout d’abord, décongeler un aliquot de TMK 30% solution de détergent glycérol. Inverser plusieurs fois pour mélanger et garder la solution sur la glace. Ajouter un volume approprié de la solution de détergent pour dissoudre la pastille et entraîner une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre.Pipette de haut en bas à plusieurs reprises tout en prenant soin d’éviter de mousser dans l’échantillon. Ensuite, gardez l’échantillon sur la glace pour permettre aux échantillons de thylakoid de solubiliser. Une fois la solubilisation terminée, centrifugez l’échantillon à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler le matériau insoluble, ce qui donne un surnatant vert foncé clair.Après cela, chargez 15 microlitres de supernatant thylakoid solubilized directement sur chaque puits d’un gel indigène précédemment préparé de 1,5 millimètre. À l’aide du tampon de fonctionnement 1X, commencez à exécuter le gel vert indigène à 100 volts. Placez l’ensemble du réservoir de gel sur de la glace humide pendant toute la durée de la course afin d’atténuer le chauffage résistatif.Lorsque le gel a fini de fonctionner, retirez-le de la cellule électrophoresis et rincez le tampon en cours d’exécution des plaques de gel avec de l’eau distillée. Retirer la plaque supérieure du gel, puis rincer le gel à l’eau distillée. Placez le gel, qui est encore sur la plaque de verre inférieure, sur la glace; lorsque le gel n’est pas utilisé, couvrez-le d’une pellicule plastique et gardez-le dans l’obscurité pour l’empêcher de se dessécher.Ensuite, utilisez un scalpel pointu ou une lame de rasoir pour exciser chaque bande d’intérêt lorsqu’il est prêt à procéder à l’analyse tcspc. Assurez-vous que la bande excisée ne contient aucun matériau de bande contaminante. Pour chaque complexe analysé, utilisez un spectromètre fluorescent pour faire un spectre fluorescent à température ambiante entre 600 et 800 nanomètres.Placez du ruban masquant à chaque extrémité des glissières et pliez-le plusieurs fois pour créer des espaceurs, ce qui permettra de tenir fermement les glissières ensemble sans comprimer l’espace entre les deux, puis prendre en sandwich la tranche de gel entre deux diapositives de microscopie en verre. Ajoutez une petite quantité d’eau à la tranche de gel au bord des glissières en verre pour créer une interface lisse qui réduira la diffusion du signal. Ensuite, serrez le sandwich au gel dans le chemin de faisceau de sorte que le faisceau frappe la tranche de gel à travers le bord ouvert des assiettes.Pour chaque complexe, recueillir 10 000 points de données totaux à intervalles réguliers dans tout le spectre des émissions de fluorescence. Pour analyser les données d’un complexe donné, normalisez d’abord la hauteur maximale de chaque courbe de décomposition pour toutes les longueurs d’onde recueillies, puis la queue correspond à chaque courbe de décomposition au spectre de fluorescence à l’état stable du complexe tel que décrit dans le protocole de texte. Les résultats représentatifs de l’électrophoresis gel vert fournit un exemple d’un résultat idéal pour l’analyse des thylakoids épinards, où un certain nombre de bandes claires et nettes vert sont visibles.Les voies 2 et 3 présentent des résultats plus typiques de l’isolement thylakoid simple et de l’électrophoresis sur un gel non-gradient de 5%acrylamide. Les voies 4, 5 et 6 fournissent un exemple de mauvais résultats dus à des degrés croissants de sous-solubilisation de l’échantillon de thylakoid, tandis que la voie 7 démontre les résultats qui peuvent être obtenus quand arabidopsis thylakoids sont utilisés au lieu des épinards. Une fois que les courbes de données des données TCSPC ont été définies dans le même registre de temps, elles peuvent être normalisées à la même hauteur de pointe, ce qui permet de comparer les courbes comme une première analyse des données.Les courbes de décomposition normalisées par pic de différents complexes peuvent ensuite être superposées les unes aux autres à une longueur d’onde donnée, ce qui permet de visualiser les différences de comportement entre les complexes. La queue correspondant aux courbes de décomposition permet la construction de spectres associés à la décomposition. Comme on le voit ici, les spectres associés à la désintégration pour le LHCII sont remarquables par le manque de caractéristiques dynamiques et la forme du spectre de fluorescence LHCII reste la même que les désintégrations du signal au fil du temps.La désintégration du spectre de fluorescence est également retardée, nécessitant 100 picosecondes pour atteindre la fluorescence maximale. Ceci suggère que l’énergie n’est pas transférée entre les pigments énergiquement distincts dans le complexe pendant que la fluorescence se décompose. Les spectres associés à la décomposition sont ensuite construits pour le complexe de la bande 5.Par rapport au LHCII, la fluorescence de la bande 5 se décompose beaucoup plus rapidement, atteignant l’intensité maximale en seulement 30 picosecondes, puis se désintégrer à moins de 20% de l’intensité initiale après 500 picosecondes. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’interprétation des données tcspc s’appuiera sur des informations biochimiques supplémentaires identifiant les composants des complexes à l’étude, par exemple, par 2 DSDS-PAGE et Western Blotting ou spectrométrie de masse.

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Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

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