Purification de cellules peu abondantes dans le système visuel de drosophile

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie, telles que la façon dont divers types de cellules sont générés et organisés en structures d’ordre supérieur avec des fonctions spécifiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la purification efficace des cellules présentes à faible abondance dans le système visuel Drosophila pour l’analyse transcriptomique et génomique. Le mardi de la sixième semaine du protocole, 45 minutes avant les dissections, récupérer un flacon de poudre de papain de quatre degrés Celsius et l’incuber à température ambiante.

Ensuite, mettre de côté complete Schneider’s Medium, ou CSM, dans un tube Eppendorf à température ambiante pour ajouter à la poudre de papain plus tard. Cinq à dix minutes avant les dissections, utiliser une seringue pour ajouter la température ambiante CSM au flacon de papain directement à travers le bouchon à une concentration de 100 unités par millilitre. Pour mélanger, d’abord inverser le flacon pour capturer toute poudre collée à l’intérieur du bouchon, puis pipette le contenu de haut en bas.

Après avoir mélangé les reagents, amener l’eau jusqu’à 37 degrés Celsius dans un bécher dans un bain d’eau. Ensuite, placez le flacon dans le bécher pendant 30 minutes pour activer la papaïne et assurez-vous que le flacon ne flotte pas. Pendant que la papaïne couve, récupérez un aliquot d’enzymes protéolytiques mélangées au congélateur et incubez-la à température ambiante.

Après 30 minutes d’activation, incuber la papaïne à température ambiante. Le mardi de la sixième semaine, disséquer les cerveaux des élèves mis en scène dans le CSM froid avec des forceps propres. Disséquer autant de cerveaux que possible en 10 minutes et mettre le cerveau en commun dans une nouvelle goutte de CSM froid.

Coupez les lobes optiques en pinçant à la jonction du lobe optique et du cerveau central. Ensuite, ajoutez les lobes au fond d’un microtube contenant 500 microlitres de 1x RS. Un microtube pour le tissu expérimental et un pour le tissu de contrôle négatif. Gardez les tubes sur la glace.

Disséquer autant de lobes que possible en une heure. Mettre en commun les lobes optiques disséqués dans un seul microtube pour éliminer la perte de tissu lors du transfert entre microtubes. Retirez soigneusement le 1x RS du microtube avec les lobes optiques disséqués à l’aide d’une pipette P200, laissant suffisamment de solution pour couvrir les lobes.

Ajouter délicatement 500 microlitres de 1x RS sur le côté du tube. Laissez les lobes s’installer au fond du tube, puis pipette jusqu’à 200 microlitres. Expulser le mélange, observer les lobes se déplacer et permettre aux lobes de s’installer à nouveau.

Pour les deux échantillons, aliquot 600 microlitres de papain activé, température ambiante dans un microtube. Ensuite, créez la solution de dissociation. Ajouter 4,2 microlitres d’enzyme protéolytique à température ambiante se fondre dans 600 microlitres de solution de papain pour obtenir une concentration finale de 0,18 WU par millilitre et mélanger la solution en le pipetting de haut en bas.

Retirez ensuite soigneusement le 1x RS de chaque échantillon et ajoutez 300 microlitres de solution de dissociation aux lobes. Incuber les échantillons à 25 degrés Celsius. 1000 RPM pendant 15 minutes dans un microtube ThermoMixer.

Aux points de temps de 5 et 10 minutes, arrêtez le ThermoMixer et laissez les lobes couler au fond du microtube. Pipette jusqu’à 200 microlitres de la solution et mélanger. Après l’incubation de 15 minutes, attendre que les lobes se déposent au fond et retirent soigneusement la solution de dissociation des lobes sans déranger les lobes.

Lavez les lobes deux fois avec 1x RS. Ajouter délicatement 500 microlitres de 1x RS sans déranger les lobes. Puis pipette soigneusement jusqu’à 200 microlitres et expulser doucement la solution. Laissez les lobes couler vers le bas et répétez.

Ensuite, lavez chaque échantillon deux fois avec 500 microlitres de CSM. Retirez soigneusement le CSM et ajoutez 200 microlitres de CSM au tube. À l’aide d’une pipette P200, perturber le tissu en écument de haut en bas sans mousser jusqu’à ce que la solution soit homogène.

À l’aide d’une pipette P200, filtrer la suspension cellulaire à travers un bouchon de maille de 30 micromètres dans un tube de télécopieur de 5 millilitres sur la glace. Et assurez-vous que toute la suspension passe. Ajouter 500 microlitres de CSM pour rincer le microtube de dissociation.

Et filtrer la solution dans le tube de fax. Enfin, enlever soigneusement le bouchon du tube de fax. Recueillir la solution sous le filtre à mailles avec un P200 et l’ajouter au reste de la suspension dans le tube de fax.

La microscopie confoccale des lobes tachés immunos avec des anticorps spécifiques contre DsRed et GFP ainsi que l’anticorps 24B10 comme référence pour les neuropils Lamina et Medulla a confirmé que L3 est le seul type de cellule étiqueté par DsRed et GFP dans le lobe optique. Les données sur les faits de 100 000 événements ont été enregistrées, dont 29,9% de tous les événements sont des singlets potentiels. Après que les doublets dans les cellules avec différentes tailles aient été gated dehors basés sur la granularité et la taille, les cellules simples restantes, neurones de L3, sont apparues en tant que faisceaux serrés dans P1, qui a été bien séparé des cellules de fond.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’ARN-seq ou l’ATAC-seq peuvent être effectuées pour répondre aux questions biologiques par l’analyse de l’expression des gènes ou de l’organisation de la chromatine, respectivement. Cette technique fait considérablement progresser la capacité des chercheurs à explorer les mécanismes génétiques sous-jacents au développement et à la fonction des tissus complexes en utilisant le système visuel Drosophila comme modèle.