Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage

Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

Le principal avantage de cet essai de turbidité à base de plaques est qu’il est rapide et permet à plusieurs inhibiteurs d’interaction amyloïde-bêta fibrinogen d’être examinés à la fois sans configuration sophistiquée ou des exigences. Les composés de tête qui sont dans l’essai de turbidité de fibrine peuvent être davantage évalués pour leur capacité à reconstituer l’anomalie structurale A-bêta-induite dans les caillots de fibrine analysés par microscopie électronique de balayage. La démonstration visuelle de la préparation de caillot pour l’analyse électronique de microscopie de balayage est critique car toutes les variations dans la préparation peuvent contribuer aux variations dans les résultats expérimentaux.

Cette démonstration met l’accent sur les interactions A-beta fibrinogen. Ce protocole peut être facilement modifié pour analyser d’autres interactions avec d’autres protéines et les composés avec le caillot de fibrine. Commencez par ajouter 1,5 micromolaire de fibrinogen fraîchement préparé dans 200 microlitres de tampon de formation de caillots à chaque A-bêta négatif 42 contenant et contrôlant des puits et incubez la plaque sur une plate-forme rotative à température ambiante.

Après 30 minutes simultanément ajouter 30 microlitres de solution thrombine fraîchement préparé directement dans le centre du puits contenant du fibrinogen pour initier la formation de caillots et lire immédiatement l’absorption des caillots in vitro à 350 nanomètres, répétant la mesure toutes les 30 à 60 secondes au cours de 10 minutes. Pour évaluer l’effet des inhibiteurs d’interaction de fibrinogen d’A-bêta sur la structure de caillot de fibrine, utilisez d’abord des forceps pour placer le couvercle propre et siliconized de cercle en verre de 12 millimètres glisse aux puits individuels d’une plaque de puits de 12 et ajoutez 80 microlitres de fibrinogène sur chaque glissement de couverture, répandant doucement la solution de sorte qu’ils soient uniformément distribués. Ajouter 20 microlitres de solution thrombine à chaque puits pour initier la formation de caillots.

Couvrir la plaque pendant une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante, puis submerger doucement chaque caillot en deux millilitres de tampon cacodylate de sodium glacé pendant deux minutes, couvert, à température ambiante deux fois, à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour enlever soigneusement le tampon après chaque lavage. Après le dernier lavage, vérifiez l’état de la formation du caillot sur la feuille de couverture et fixez les caillots en deux à trois millilitres de glutaraldehyde glacé de 2 % sur la glace pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, retirer délicatement le glutaraldehyde de chaque puits et laver les caillots avec un tampon cacodylate de sodium frais comme le démontre la glace.

Pour hydrater les caillots fixes dans une série classée de cinq minutes, l’éthanol glacé se lave sur la glace sans enlever complètement l’éthanol entre les lavages pour protéger les caillots contre l’exposition à l’air. Au cours du dernier lavage à 100 % éthanol, transférer le couvercle dans un porte-échantillon de sécheuse à point critique, en plaçant au moins 1 rondelle entre chaque feuillet de couvercle et en plaçant le support dans une chambre sèche-point critique remplie d’éthanol. Après un cycle de séchage de 30 minutes, utilisez du ruban carbone pour monter les feuillets de couverture sur les talons de microscopie électronique à balayage individuel et transférez les échantillons dans la chambre de revêtement de pulvérisateur d’un revêtement de pulvérisateur sous vide.

Puis pulvériser manteau moins de 20 nanomètres de palladium d’or ou d’autres matériaux conducteurs sur les échantillons pendant 25 secondes à quatre angstroms par seconde et l’image des échantillons sur un microscope électronique à balayage équipé d’un détecteur d’électrons secondaires de type deux à quatre kilovolts. La formation de caillots fibrins provoque la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une turbidité accrue qui plafonne à la fin de la période de lecture. Lorsque le fibrinogen est incubé en présence d’A-beta 42, la turbidité de la solution diminue avec la courbe atteignant une hauteur maximale d’environ la moitié de celle du fibrinogène seul.

En présence d’un bloqueur d’interaction A-beta 42, l’effet de la bêta-amyloïde est amélioré et la turbidité est plus élevée que celle de la bêta-A seule. L’effet du bloqueur n’apparaît pas en raison de la turbidité de fond car le composé ne change pas la turbidité fibrine de caillot quand A-bêta est absent. En outre, la formation de caillots en présence de GPRP, un peptide connu pour interférer avec la polymérisation fibrine, démontre une turbidité significativement réduite par rapport à la formation de caillots fibrine en l’absence de l’inhibiteur.

Le fibrinogène produit en présence de thrombine et de chlorure de calcium ne forme qu’un maillage fibrine avec des fils allongés et intercalés de fibrine ainsi que de plus gros faisceaux. Quand A-bêta est présent, les fils de fibrine sont devenus plus minces avec plusieurs touffes collantes dans les agrégats, indiquant des anomalies structurales induites par A-bêta. Conformément aux résultats de l’analyse de turbidité, la formation de caillots en présence d’un bloqueur d’interaction a-bêta fibrinogen restaure partiellement la structure du caillot de fibrine des changements induits par la bêta-A à mesure que moins de touffes sont observées avec ce traitement.

L’analyse de turbidité des caillots et les protocoles d’analyse du microscope électronique à balayage ont été optimisés pour évaluer plusieurs inhibiteurs de l’interaction a-bêta fibrinogen d’une manière rapide et reproductible. Et bientôt les données fourniront des informations précieuses sur la formation de caillots fibrins qui peuvent être appliquées à d’autres études à la fois in vitro et in vivo.