Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage
30 novembre 2018
Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.
Le principal avantage de cet essai de turbidité à base de plaques est qu’il est rapide et permet à plusieurs inhibiteurs d’interaction amyloïde-bêta fibrinogen d’être examinés à la fois sans configuration sophistiquée ou des exigences. Les composés de tête qui sont dans l’essai de turbidité de fibrine peuvent être davantage évalués pour leur capacité à reconstituer l’anomalie structurale A-bêta-induite dans les caillots de fibrine analysés par microscopie électronique de balayage. La démonstration visuelle de la préparation de caillot pour l’analyse électronique de microscopie de balayage est critique car toutes les variations dans la préparation peuvent contribuer aux variations dans les résultats expérimentaux.
Cette démonstration met l’accent sur les interactions A-beta fibrinogen. Ce protocole peut être facilement modifié pour analyser d’autres interactions avec d’autres protéines et les composés avec le caillot de fibrine. Commencez par ajouter 1,5 micromolaire de fibrinogen fraîchement préparé dans 200 microlitres de tampon de formation de caillots à chaque A-bêta négatif 42 contenant et contrôlant des puits et incubez la plaque sur une plate-forme rotative à température ambiante.
Après 30 minutes simultanément ajouter 30 microlitres de solution thrombine fraîchement préparé directement dans le centre du puits contenant du fibrinogen pour initier la formation de caillots et lire immédiatement l’absorption des caillots in vitro à 350 nanomètres, répétant la mesure toutes les 30 à 60 secondes au cours de 10 minutes. Pour évaluer l’effet des inhibiteurs d’interaction de fibrinogen d’A-bêta sur la structure de caillot de fibrine, utilisez d’abord des forceps pour placer le couvercle propre et siliconized de cercle en verre de 12 millimètres glisse aux puits individuels d’une plaque de puits de 12 et ajoutez 80 microlitres de fibrinogène sur chaque glissement de couverture, répandant doucement la solution de sorte qu’ils soient uniformément distribués. Ajouter 20 microlitres de solution thrombine à chaque puits pour initier la formation de caillots.
Couvrir la plaque pendant une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante, puis submerger doucement chaque caillot en deux millilitres de tampon cacodylate de sodium glacé pendant deux minutes, couvert, à température ambiante deux fois, à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour enlever soigneusement le tampon après chaque lavage. Après le dernier lavage, vérifiez l’état de la formation du caillot sur la feuille de couverture et fixez les caillots en deux à trois millilitres de glutaraldehyde glacé de 2 % sur la glace pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, retirer délicatement le glutaraldehyde de chaque puits et laver les caillots avec un tampon cacodylate de sodium frais comme le démontre la glace.
Pour hydrater les caillots fixes dans une série classée de cinq minutes, l’éthanol glacé se lave sur la glace sans enlever complètement l’éthanol entre les lavages pour protéger les caillots contre l’exposition à l’air. Au cours du dernier lavage à 100 % éthanol, transférer le couvercle dans un porte-échantillon de sécheuse à point critique, en plaçant au moins 1 rondelle entre chaque feuillet de couvercle et en plaçant le support dans une chambre sèche-point critique remplie d’éthanol. Après un cycle de séchage de 30 minutes, utilisez du ruban carbone pour monter les feuillets de couverture sur les talons de microscopie électronique à balayage individuel et transférez les échantillons dans la chambre de revêtement de pulvérisateur d’un revêtement de pulvérisateur sous vide.
Puis pulvériser manteau moins de 20 nanomètres de palladium d’or ou d’autres matériaux conducteurs sur les échantillons pendant 25 secondes à quatre angstroms par seconde et l’image des échantillons sur un microscope électronique à balayage équipé d’un détecteur d’électrons secondaires de type deux à quatre kilovolts. La formation de caillots fibrins provoque la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une turbidité accrue qui plafonne à la fin de la période de lecture. Lorsque le fibrinogen est incubé en présence d’A-beta 42, la turbidité de la solution diminue avec la courbe atteignant une hauteur maximale d’environ la moitié de celle du fibrinogène seul.
En présence d’un bloqueur d’interaction A-beta 42, l’effet de la bêta-amyloïde est amélioré et la turbidité est plus élevée que celle de la bêta-A seule. L’effet du bloqueur n’apparaît pas en raison de la turbidité de fond car le composé ne change pas la turbidité fibrine de caillot quand A-bêta est absent. En outre, la formation de caillots en présence de GPRP, un peptide connu pour interférer avec la polymérisation fibrine, démontre une turbidité significativement réduite par rapport à la formation de caillots fibrine en l’absence de l’inhibiteur.
Le fibrinogène produit en présence de thrombine et de chlorure de calcium ne forme qu’un maillage fibrine avec des fils allongés et intercalés de fibrine ainsi que de plus gros faisceaux. Quand A-bêta est présent, les fils de fibrine sont devenus plus minces avec plusieurs touffes collantes dans les agrégats, indiquant des anomalies structurales induites par A-bêta. Conformément aux résultats de l’analyse de turbidité, la formation de caillots en présence d’un bloqueur d’interaction a-bêta fibrinogen restaure partiellement la structure du caillot de fibrine des changements induits par la bêta-A à mesure que moins de touffes sont observées avec ce traitement.
L’analyse de turbidité des caillots et les protocoles d’analyse du microscope électronique à balayage ont été optimisés pour évaluer plusieurs inhibiteurs de l’interaction a-bêta fibrinogen d’une manière rapide et reproductible. Et bientôt les données fourniront des informations précieuses sur la formation de caillots fibrins qui peuvent être appliquées à d’autres études à la fois in vitro et in vivo.
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Aperçu
Cet article présente des méthodes permettant d'analyser l'effet de l'amyloïde bêta sur la structure du caillot de fibrine, notamment un protocole in vitro de caillot de fibrine ainsi que des méthodes d'analyse de la turbidité du caillot et de microscopie électronique à balayage.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- L'amyloïde bêta est impliquée dans les maladies neurodégénératives.
- Les caillots de fibrine jouent un rôle dans divers processus biologiques.
- La compréhension de la structure des caillots de fibrine peut fournir des informations sur les mécanismes des maladies.
- Des études antérieures ont montré des anomalies structurelles dans les caillots de fibrine dues à l'A-bêta.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'effet du bêta-amyloïde sur la structure du caillot de fibrine.
- Analyser des inhibiteurs des interactions entre l'amyloïde-bêta et le fibrinogène.
- Montrer la préparation des caillots pour l'analyse par microscopie électronique à balayage.
Méthodes utilisées
- Essai de turbidité en plaque pour un criblage rapide.
- Préparation de caillots de fibrine in vitro à l'aide de fibrinogène.
- Microscopie électronique à balayage pour analyser la structure des caillots.
- Modification des protocoles pour étudier d'autres interactions protéiques.
Résultats principaux
- Identification de composés principaux qui restaurent l'intégrité structurelle.
- La démonstration visuelle de la préparation du caillot est cruciale pour assurer la reproductibilité.
- Des variations dans la préparation peuvent influencer les résultats expérimentaux.
- Potentiel d'applications plus larges dans l'étude des interactions protéiques.
Conclusions
- Les méthodes présentées sont efficaces pour analyser la structure des caillots de fibrine.
- L'analyse de l'inhibition peut fournir des informations sur les stratégies thérapeutiques.
- Des recherches supplémentaires peuvent approfondir les interactions avec d'autres protéines.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Ce protocole permet un criblage rapide et reproductible d'inhibiteurs de l'interaction entre l'amyloïde-bêta et le fibrinogène en utilisant un dosage de turbidité en plaque, soutenant ainsi la validation précoce de cibles dans le développement de thérapeutiques contre la maladie d'Alzheimer. La méthode fournit des données quantitatives sur la formation de caillots et une confirmation structurale par microscopie électronique à balayage, facilitant la progression des « hits » vers des candidats médicaments parmi les composés qui atténuent les anomalies des caillots de fibrine induites par l'Aβ. En combinant les mesures de turbidité avec l'imagerie en MEB, cette approche offre une détection mécanistique des risques et une confiance prédictive pour les programmes de découverte ciblant le système neurovasculaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Étudie l'hypothèse thérapeutique selon laquelle l'interaction entre l'amyloïde-bêta et le fibrinogène induit la formation de caillots pathologiques dans la maladie d'Alzheimer.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle de la cible en mesurant la turbidité des caillots comme indicateur direct de l'inhibition de la liaison entre l'amyloïde-bêta et le fibrinogène.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille de composés en identifiant ceux qui restaurent une structure normale des caillots de fibrine, signe d'une interaction avec la cible et d'une réduction du risque biologique.
Développement de tests et criblage
- Prêt à l'emploi du test : Le test de turbidité optimisé est rapide, hautement reproductible et compatible avec les formats de plaques multipuits pour le criblage de grandes bibliothèques de composés.
- Résultat quantitatif : Mesure l'absorbance à 350 nm en fonction du temps, fournissant des données cinétiques sur la formation du caillot permettant de distinguer l'efficacité des inhibiteurs des effets de fond.
- Confirmation structurale : Les composés actifs identifiés par le criblage en turbidité sont validés par MEV afin de visualiser la restauration de l'architecture du caillot de fibrine, garantissant ainsi que les résultats positifs ne sont pas des artefacts du test.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise un mécanisme cérébrovasculaire de la pathologie d'Alzheimer, reliant l'amyloïde-bêta à des anomalies des caillots de fibrine associées à des micro-infarctus et à l'angiopathie amyloïde cérébrale.
- Continuité translationnelle : Associe l'engagement du cible in vitro (turbidité) à la structure phénotypique du caillot (MEB), soutenant une dé-risquisation mécanistique avant la validation in vivo.
- Avancement ajusté au risque : Permet de prendre des décisions d'aller/arrêt selon deux critères : l'inhibition du retard de formation du caillot et la correction des anomalies structurelles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce, permettant de tester l'hypothèse selon laquelle l'interaction entre l'amyloïde-bêta et le fibrinogène constitue une cible thérapeutique exploitable, les résultats alimentant les flux de travail d'identification de composés leaders et de validation préclinique.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant la manière dont l'A-bêta modifie la turbidité et la structure du caillot de fibrine, précisant ainsi le rôle des voies impliquées dans le dysfonctionnement neurovasculaire.
- Criblage : Fournit une prêts-à-l'emploi et une reproductibilité du test pour l'évaluation en haut débit d'inhibiteurs de l'interaction A-bêta-fibrinogène, dans un format de plaque 96 puits.
- Analytique : Fournit des cinétiques de turbidité et des paramètres structuraux fondés sur la MEB, permettant une analyse comparative des effets des composés sur la formation et l'architecture des caillots.
- Recherche translationnelle : Relie l'inhibition de la cible à la restauration phénotypique du caillot, en cohérence avec la continuité préclinique des modèles d'Alzheimer neurovasculaires.
- Réutilisation en entreprise : Le flux de travail combinant turbidité et MEB constitue une plateforme réutilisable, applicable à d'autres interactions protéine-fibrinogène au-delà de l'A-bêta, soutenant ainsi des efforts élargis de validation ciblée.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive en associant l'inhibition biochimique à la récupération structurale du caillot, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans la validation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles optimisés de préparation, de lavage, de fixation et d'imagerie du caillot.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions « aller/ne pas aller » en exigeant une validation à la fois fonctionnelle (turbidité) et structurale (MEB), réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des inhibiteurs qui démontrent une correction double du retard de formation du caillot et de la pathologie structurale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la préparation des protéines, les essais de formation de caillots et la préparation d'échantillons pour la microscopie électronique à balayage.
- Dépend de l'accès à un lecteur de plaques capable de mesures cinétiques d'absorbance à 350 nm et à un dispositif de pulvérisation sous vide doté de capacités d'imagerie en MEB.
- Exige une standardisation des étapes de fixation, de déshydratation et de séchage des caillots afin d'éviter les artefacts structuraux pouvant fausser l'interprétation en MEB.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'adaptation du protocole à d'autres interactions protéine-fibrinogène, notamment en ce qui concerne la composition du tampon et les durées d'incubation.
- Comprend des limites pratiques telles que la nécessité de préparer les réactifs frais et de manipuler soigneusement les échantillons afin d'éviter les variations des caillots dues à l'exposition à l'air ou à des lavages inconstants.
