Name: Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Découvrez une chambre d'écoulement in vitro pour étudier l'adhérence bactérienne aux greffes tissulaires et la pathogenèse de l'endocardite infectieuse. Cette méthode standardisée révèle les interactions moléculaires clés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par une subvention de la recherche fonds KU Leuven (OT/14/097) accordée aux RH. VRT a été stagiaire postdoctoral de la fondation de recherche de FWO - Vlaanderen (Belgique ; Grant Number - 12K0916N) et RH est pris en charge par le fonds de recherche clinique de UZ Leuven.

1. préparer la greffe de tissus pour des études In Vitro
Remarque : Trois types de tissus ont été utilisés : patch de péricarde bovin (BP), greffes Cryopreserved homogreffe (CH) et de la veine jugulaire de bovin (BJV). En cas de conduite BJV et CH (tissus traités par la Banque européenne de homogreffe (EHB) et stockés dans l’azote liquide avant de l’utiliser), le mur et les feuillets valvulaires ont été utilisés. Patch de BP et conduit BJV furent achetées chez les fabricants. Avant utilisation, décongeler le CH suivant les instructions de EHB12.
<ol><li>Rincer tous les tissus à 0,9 % NaCl avant de l’utiliser.</li>
	<li>Préparer des biopsies tissulaires à l’aide d’une biopsie cutanée jetables punch pour couper les morceaux de tissu circulaire (10 mm de diamètre).</li>
	<li>Couper tous les patchs de tissus à la même hauteur à l’aide de bistouris stériles jetables.</li>
	<li>Pour les tissus fixés au glutaraldéhyde (par exemple les conduits BJV), incuber les morceaux de greffon durant la nuit à 4 ° C, avec 200 g/L d’albumine humaine pour neutraliser le fixateur.</li>
	<li>Laver les résidus de glutaraldéhyde avec 0,9 % NaCl dans une plaque de microtitration.  Répétez 3 fois pendant 1 minute.</li>
</ol>2. préparation de bactéries pour expériences de Perfusion
Remarque : Les trois isolats bactériens ont été utilisées : S. aureus Cowan (ATCC 12598), s. epidermidis ATCC 149900 et S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus et S. epidermidis sont cultivées à 37 ° C dans un bouillon trypticase soja (TSB) et S. sanguinis a été cultivé à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI).
<ol><li>Préparer une culture de bactéries sur une gélose au sang solide.<ol>
<li>Utilisez une boucle stérile pour gratter les bactéries congelées et ensemencer sur une gélose Mueller-Hinton sang pour une culture à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser une anse à inoculation stérile pour ramasser une colonie unique de la culture de gélose au sang durant la nuit et ensemencer dans 10 mL de BST ou BHI dans un tube de 14 mL et de la culture pendant une nuit à 37 ° C.</li>
	<li>Centrifuger les cultures pendant la nuit (3000 x g, 4 ° C, 10 min) et remettre en suspension les pellets dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placer les tubes de 14 mL sur la glace.</li>
	<li>Préparer une partie aliquote de la solution de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxy - fluorescéine N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) dans l’éthanol et conserver à-20 ° C. Plus loin, diluer le stock des FC à 150 µg/mL avec de l’eau « ultrapure ». Remarque : Protéger les tubes de lumière à l’aide de papier d’aluminium et conserver à-20 ° C.</li>
	<li>Centrifuger les bactéries (3000 x g, 4 ° C, 10 min) et remettre en suspension les pellets dans 800 µL de PBS et ajouter 200 µL de la solution de CF 150 µg/mL (concentration finale de 30 µg/mL utilisés pour les expériences de perfusion). Protéger les tubes de lumière avec du papier aluminium et incuber 30 min à l’aide d’un agitateur orbital.</li>
	<li>Après marquage, bloc avec 2 % de solution d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS et essorage (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Faire suivre par un lavage à l’aide de 10 mL de PBS et pellet bactéries par centrifugation (3000 x g, 4 ° C, 10 min).</li>
	<li>Diluer les bactéries avec PBS pour obtenir 10 unités formant colonie de7 (UFC) par millilitre (vérifié par UFC comptage sur plaques de gélose au sang de Mueller-Hinton), ce qui correspond à une OD600 (densité optique) de 0,65. Garder les lampes dans l’obscurité sur la glace avant d’expériences de perfusion. Remarque. N’oubliez pas que OD600 mesures reflètent le nombre approximatif de bactéries. Pour compter la dose efficace de l’inoculation, la méthode de dilution en série est une étape supplémentaire nécessaire pour vérifier la division d’opposition selon nombres tel que décrit dans l’article 3.8.</li>
</ol>3. in vitro expériences de Perfusion à l’aide d’une chambre d’ionisation de plaques parallèles
<ol><li>Monter des biopsies tissulaires de 10 mm de diamètre et la même épaisseur (préparé dans les étapes de 1,1 à 1,5) dans un système de chambre de flux avec la surface intérieure vers le haut pour entrer en contact avec la suspension bactérienne. Remarque : La même épaisseur de tissu à travers différents greffons fait en sorte que la même hauteur de tissu est atteinte dans le chenal permettant l’écoulement laminaire dans toutes les conditions. Tous les éléments de la chambre de flux sont présentés et décrits à la Figure 1.<ol>
<li>Pour commencer le protocole, placez le morceau de tissu ronde entre une lame de microscope avec une perforation circulaire de 8 mm et un joint de caoutchouc. Remarque : La lame de microscope possède le film ultra-mince bas afin de permettre la génération de l’orifice de 8 mm. Ainsi que la feuille de caoutchouc, il fixe le tissu afin de permettre le contact direct entre l’échantillon et le milieu fluide et empêche également la dislocation de la biopsie au cours de l’expérience. La surface du tissu étudié, qui est exposée à l’écoulement (petit diamètre) ne peuvent pas être manipulée par les pinces.</li>
		<li>Insérez le support avec le tissu dans la feuille de joint qui est incorporée dans la structure métallique du fond de la chambre.</li>
		<li>Fixer le cadre métallique supérieur avec la feuille correspondante de joint d’étanchéité sur la partie inférieure de la chambre avec le support de papier inséré précédemment. Par la suite monter la chambre ensemble avec huit vis et visser les écrous. S’assurer que la hauteur de la chambre est toujours le même à travers des greffes. Remarque : La hauteur de la chambre doit être déterminée toujours sur les vis de serrage. Utilisez une pince ou une règle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Connectez la chambre flow avec une pompe péristaltique et le réservoir de fluide avec les tubes.</li>
	<li>Perfuse les tissus avec des suspensions de 107 UFC/mL (vérifié par UFC comptage et relatives aux mesures de600 OD) fluorescent des bactéries marquées dans du PBS avec une contrainte de cisaillement de 3 dyne/cm2 (dyne par centimètre carré unité de pression) par moyen de la pompe péristaltique (débit de 4 mL/min) pendant 1 h à l’aide d’un réservoir bactérien de 400 mL (conception interne, Figure 1), conditionné à 37 ° C à l’aide d’un thermostat de plaque (Table des matières).</li>
	<li>Recycler en permanence la suspension bactérienne de 100 mL à l’aide du même réservoir collecteur.</li>
	<li>Après la perfusion, démonter la chambre pour libérer la prothèse et laver le morceau de tissu deux fois avec 4 mL de PBS dans une plaque de 12 puits à l’aide de l’agitateur orbital de laboratoire pendant 3 min chaque. Par la suite, couper la partie interne de la prothèse à l’aide d’une biopsie cutanée poinçon d’un diamètre inférieur.</li>
	<li>Placez chaque biopsie de tissu dans un tube séparé 14 mL contenant 1 mL de stérile 0,9 % NaCl. Marquer le tube comme #1.</li>
	<li>Détacher les bactéries provenant du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 min (amplitude = 100 % et la fréquence = à 45 Hz). Remarque : Un détachement complet de bactéries provenant du tissu greffes doivent être évaluées lors de l’incubation des patches pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu liquide du BST suivi de mesures de600 OD par rapport à contrôler les parcelles traitées avec une solution libre de bactéries.</li>
	<li>Utilisez une méthode de dilution en série sur plaques de gélose au sang de Mueller-Hinton pour compter UFC.<ol>
<li>Préparer un tube unique de 14 mL avec 10 mL de sérum physiologique stérile pour faire des dilutions successives de la suspension bactérienne obtenue après sonication. Qualifier ce tube #2. Remarque : Pour chaque expérience un tube de tissu avec 10 mL de 0,9 % NaCl est nécessaire.</li>
		<li>Préparer trois 14 mL tubes 10 ml stérile 0,9 % NaCl pour les dilutions en série de la suspension bactérienne de l’étape 2.7. Identifier les tubes comme suit 3 #, 4 #, 5 #. Remarque : Cette étape est nécessaire de connaître le nombre d’UFC réel dans une suspension bactérienne utilisé pour l’expérience de la perfusion.</li>
		<li>Vortex mélanger chaque tube pendant 15 s. Vortex les tubes avec la biopsie de tissu ainsi que la suspension bactérienne initiale pour faire des dilutions successives.</li>
		<li>Préparer trois boîtes de gélose, deux pour l’expérience de tissu (perfusion de bactéries et contrôle perfusion de PBS) et la troisième pour la suspension bactérienne initiale utilisée pour les perfusions.</li>
		<li>Étiqueter les trois secteurs par plaque pour l’expérience de tissu en le suivant de manière 10-1, 10-3 et 10-4. Pour compter le nombre d’UFC dans les perfusats bactériennes, étiqueter la plaque comme suit : 10-1, 10-3, 10-5 et 10-7. Remarque : Toutes les indications sur la gélose plaques comme 10-1, 10-3 et ainsi de suite se référer au nombre final d’UFC/mL, calculé sur le lendemain. Plaque de commande ne nécessite pas de tous les secteurs. Avant utilisation, géloses au sang devraient être placées sous la hotte laminaire et ouvert pour enlever l’excès d’humidité.</li>
		<li>Pour poursuivre l’élaboration de la série de dilutions, transférer 100 µL du tube #1 sur le tube #2 et mélanger vigoureusement avec vortex.</li>
		<li>Étaler les 100 µL du contenu du tube #1 et #2 sur les correspondants de secteurs 10-1 et 10-3 de la gélose. De même, répandre 10 µL de tube #2 sur le secteur 10-4, répétez cette opération 4 fois pour obtenir 4 crus séparés de chaque volume de 10 µL. Remarque : En raison du faible volume utilisé pour le placage sur le secteur 10-4, il est conseillé d’avoir plusieurs nombre de gouttelettes de faire un nombre moyen d’UFC cultivés.</li>
		<li>Pour préparer les dilutions en série de la culture initiale, transférer 100 µL de la suspension bactérienne de l’étape 2.7 au tube #3 et mélanger vigoureusement avec vortex. Ajouter 100 µL de tube #3 au tube #4 et bien mélanger, répétez la procédure pour tube ultérieure #5.</li>
		<li>Étaler 100 µL du contenu des tubes 3 #, 4 #, 5 # et la suspension bactérienne ajustée (étape 2.7), respectivement, sur les secteurs 10-3, 10-5, 10-7 et 10-1 de la gélose au sang.</li>
		<li>Laissez les géloses au sang dans la hotte laminaire à l’air sec les spreads bactériennes, généralement pendant 10 minutes. Ensuite, placez les plaques à 37 ° C pendant une nuit d’incubation.</li>
		<li>Après incubation pendant la nuit, compter les colonies bactériennes pour obtenir le nombre d’UFC résultant de l’adhésion à des biopsies tissulaires et le CFU/mL dans la suspension bactérienne départ utilisée pour la perfusion. Exprimer les résultats en CFU/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fluorecence de bactéries collés à la greffe de tissus à la Perfusion
<ol><li>Après la perfusion, laver les morceaux de tissus avec du PBS (voir étape 3.5) et couper la partie intérieure d’un greffon à l’aide d’un poinçon d’un diamètre inférieur.</li>
	<li>Préparer une plaque 6 puits et placer les gouttelettes du milieu de montage (Table des matières).</li>
	<li>Placez chaque morceau de tissu avec sa surface perfusé à la baisse sur une seule goutte de milieu de montage.</li>
	<li>Lire une plaque à l’aide d’un scanner de fluorescence (Table des matières). Définir les paramètres de longueur d’onde d’excitation et d’émission selon un fluorophore utilisés pour l’étiquetage bactérienne.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Les observations cliniques récentes donnent spéciale sensibilisation à IE comme complication chez des patients ayant subi un remplacement valvulaire des RVOT6,13. Dysfonctionnement de la valve implantée dans IE est le résultat d’interactions bactériennes avec la prothèse endovasculaire, menant à une vaste inflammatoires et procoagulant réactions1,14. Le modèle présenté roman in vitro nous a permi...

Staphylococcus aureus (S. aureus) emploie une variété de stratégies de virulence de contourner le système de défense immunitaire hôte coloniser les surfaces biologiques ou non biologiques, implantés dans la circulation humaine, ce qui conduit à des infections intravasculaires sévères comme la septicémie et IE1,2,3,4,5. Restes de IE un traitement important associé à complication chez les patients après l’implantation de prothèses valvulaires tandis que les facteurs individuels qui contribuent à l’apparition de IEare ne pas encore pleinement compris6,7. Conditions d’écoulement, bactéries rencontrent les forces de cisaillement, dont ils ont besoin pour surmonter afin de respecter le mur de navire8. Modèles, qui permettent d’étudier l’interaction entre les bactéries et tissu valvulaire prothétique ou endothélium sous flux, sont intéressantes car elles reflètent la situation in vivo plus.
Plusieurs mécanismes spécifiques facilitent l’adhérence des bactéries aux cellules endothéliales (ce) et à la matrice étant exposée (ECM) conduisant à la colonisation des tissus et la maturation des végétations, sont des étapes essentielles au début dans IE9. Diverses protéines de surface staphylococciques ou MSCRAMMs (surfaces composants microbiens en reconnaissant les molécules de la matrice adhésive) ont été décrits comme des médiateurs de l’adhérence aux cellules hôtes et aux protéines ECM en interagissant avec des molécules telles que la fibronectine, facteur de fibrinogène, de collagène et de von Willebrand (VWF)8,10,11. Toutefois, compte tenu de pliage intra moléculaire de certains facteurs de virulence, étudiés pour la plupart dans des conditions statiques, plusieurs de ces interactions peuvent avoir un rapport différent endovasculaire des infections dans le sang circulant.
Par conséquent, nous présentons un interne conçu in vitro plaques parallèles flux chambre modèle, qui permet l’évaluation de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes d’ECM et ECs dans le cadre de greffes de tissus implantés dans la position de RVOT. L’objectif global de la méthode décrite dans le présent travail est d’étudier les mécanismes d’interaction entre les bactéries et les tissus sous-jacents endovasculaire dans des conditions d’écoulement, qui sont étroitement liées à l’environnement en vivo de pathogènes de circulation sanguine tels que S. aureus. Cette nouvelle approche met l’accent sur la sensibilité des surfaces tissus greffés à l’adhérence des bactéries à identifier les facteurs de risque potentiels pour le développement d’Internet Explorer.

<table><tbody><tr><td>Patch de péricarde bovin (BP), Souple Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Surgical Innovations, États-Unis</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Conduits de veine jugulaire bovine (BJV)</td><td>Conduit ; Medtronic Inc, États-Unis</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH Homogreffe cryoconservée</td><td>Banque européenne d’homogreffes (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, États-Unis</td><td>P850 (8 mm) ; P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>albumine humaine</td><td>Flexbumin ; Baxter, Belgique</td><td>BE171464 LOT :16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Allemagne</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon d’infusion cardiaque (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescéine N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique (MODEL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard ; Cole Parmer, Wertheim, Allemagne</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nettoyeur à ultrasons VWR à bain de sonication ; VWR, Radnor, Pennsylvanie</td><td>142-6044</td><td>230 V/50 -60 Hz 60 VA ; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (scanner à fluorescence)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pennsylvanie</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - eau ultrapure - H2O MilliQ</td><td>Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Lames microscopiques - Chambres de culture tissulaire (1 puits)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1 puits sur Lumox détachable</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Acier inoxydable - lames chirurgicales</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone Tygon, 1/8"ID x 1/4"OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Plage de température : &ndash ; 80 à 200&deg ; C Stériliser : Avec de l’oxyde d’éthylène, une irradiation gamma ou un autoclave pendant 30 min, 15 psi de pression</td></tr><tr><td>Tube PharMed BPT</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoclavable 30 min à 121° ; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Tube</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15312022 Thermostat</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

un modèle in vitro d’un système de perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Divers vannées conduites et vannes stent montés sont utilisés pour un remplacement valvulaire ventriculaire droite sortie voies (RVOT) chez les patients présentant une cardiopathie congénitale. Lorsque vous utilisez des matériaux prothétiques, cependant, ces greffes sont sensibles aux infections bactériennes et les différentes réactions de l’hôte.
Identification des facteurs bactériens et hôte qui jouent un rôle essentiel dans le respect du traitement endovasculaire des micro-organismes est d’importance pour mieux comprendre la physiopathologie de l’apparition d’infections telles que l’endocardite infectieuse (IE) et de développer la prévention stratégies. Par conséquent, l’élaboration de modèles compétentes pour enquêter sur l’adhérence bactérienne dans des conditions physiologiques de cisaillement est nécessaire. Nous décrivons ici l’utilisation d’une nouvellement conçu in vitro perfusion chambre basée sur des plaques parallèles qui permet que l’étude de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes des tissus greffés exposés tels que la matrice extracellulaire, les cellules endothéliales et les zones inertes . Cette méthode combinée avec formant colonie (UFC) unité de comptage est suffisante pour évaluer la propension des matériaux de greffe à adhérence bactérienne sous flux. De plus, le système de chambre de flux peut-être servir d’enquêter sur le rôle des composants sanguins dans l’adhésion bactérienne dans des conditions de cisaillement. Nous avons démontré que la source du tissu, leur morphologie de la surface et la spécificité des espèces bactériennes ne sont pas les principaux facteurs déterminants dans l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus à l’aide de notre modèle de perfusion interne conçu in vitro .

Pour mieux comprendre les mécanismes derrière IE développement, ce modèle permet l’évaluation de bactérien et facteurs de tissus associés présent dans la situation in vivo de l’apparition de l’infection.
En détail, l’approche novatrice en vitro permet de quantifier l’adhésion bactérienne dans des conditions d’écoulement aux tissus différents greffons en perfusant les bactéries fluorescent étiquetés sur...

Nous décrivons un interne conçu in vitro chambre modèle d’écoulement, qui permet à l’enquête de l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus.

Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la pathogénie de l’endocardite infectieuse, et les pathobiogrammes à travers des domaines tels que l’interaction entre les bactéries, les cellules sanguines et les cellules endothéliales doublure musculature. Le principal avantage de cette technique est que les greffes de tissus peuvent être directement exposées à des interactions mutuelles avec diverses cibles, telles que les bactéries, les plaquettes et les protéines dans des conditions d’écoulement normalisées. L’implication de cette technique s’étend à notre thérapie de l’endocardite infectieuse, parce qu’elle peut démêler les interactions moléculaires importantes et les facteurs conduisant à l’infectiosité élevée de certains tissus.Cette méthode donne un aperçu de la pathogénie de la formation de végétation. Il peut également être applicable dans les études portant sur la perméabilité vasculaire, la mobilité cellulaire et l’expression des cellules géniques. Pour commencer le protocole, placez une biopsie tissulaire préparée précédemment de 10 millimètres de diamètre, et la même épaisseur entre une lame de microscope et une perforation circulaire de huit millimètres, et un joint en caoutchouc avec la surface intérieure face vers le haut, pour entrer en contact avec la suspension bactérienne.Concentrez-vous sur l’orientation de greffe de tissu tout en étant placé dans le support. Assurez-vous que la surface interne du tissu est déjà exposée aux faces sanguines jusqu’à contact avec votre milieu expérimental. Ensuite, insérez votre support avec le tissu dans la feuille de joint qui est intégrée dans le cadre métallique inférieur de la chambre.Fixez le cadre métallique supérieur avec la feuille de joint correspondante sur le fond de la chambre avec le support de tissu précédemment inséré. Montez ensuite toute la chambre avec huit vis et visser les écrous. Assurez-vous que la hauteur de la chambre est toujours la même sur les greffons à l’aide d’un étrier ou d’une règle.Ensuite, connectez la chambre d’écoulement avec une pompe périssaliste. Connectez ensuite le réservoir de liquide de 400 millilitres avec les tubes. Imprènuer les tissus avec des suspensions de 100 millilitres de dix à la colonie de sept étiquettes fluorescentes formant des unités en saline tamponnée de phosphate avec le stress de trois dîners par centimètre carré et le débit correspondant de quatre millilitres par minute pendant une heure en utilisant la pompe périssaltique et le réservoir bactérien.Recirculez continuellement la suspension bactérienne de 100 millilitres à l’aide du même réservoir de collecte. Après la perfusion, démonter la chambre pour libérer la greffe. Lavez le morceau de tissu deux fois avec quatre millilitres de PBS dans une plaque de 12 puits à l’aide d’un shaker orbital pendant trois minutes.Ensuite, coupez la partie interne de la greffe à l’aide d’un poinçon de biopsie de la peau avec un diamètre plus petit. Placez chaque biopsie tissulaire dans un tube séparé de 14 millilitres contenant un millilitre de chlorure stérile de sodium de 0,9 %. Détachez les bactéries du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 minutes.Préparer un seul tube de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour faire des dilutions périodiques de la suspension bactérienne obtenues après sonication. Étiquetez le tube numéro deux. Préparer trois tubes de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour les dilutions périodiques de la suspension bactérienne initiale prise à l’expérience de profusion.Étiquetez les tubes numéro trois, numéro quatre et numéro cinq. Ensuite, fixez trois plaques d’agar, une pour la perfusion bactérienne, une pour la perfusion de contrôle de PBS, et la troisième pour la suspension bactérienne initiale utilisée pour les perfusions. Étiquetez trois secteurs par plaque pour l’expérience tissulaire de la manière suivante : 10-1, 10-3 et 10-4.Pour compter le nombre d’unités formant des colonies dans le perfusage bactérien, étiquetez la plaque comme suit : 10-1, 10-3, 10-5 et 10-7. Vortex les tubes contenant la biopsie tissulaire pendant 15 secondes chacun, pour faire des dilutions en série. Pour préparer les dilutions en série, transférez 100 microlitres du tube numéro un au tube numéro deux, et vortexez le tube pour bien mélanger la solution.Répartir 100 microlitres du contenu du tube numéro un et numéro deux sur les secteurs correspondants, 10-1 et 10-3 de la plaque d’agar. Ensuite, répartir 10 microlitres de tube numéro deux sur le secteur 10 quatre. Répétez cette étape quatre fois pour obtenir quatre croissances distinctes de chaque volume de 10 microlitres.Pour préparer les dilutions en série de la culture initiale, vortex d’abord la dilution pendant 15 secondes et transférer 100 microlitres de suspension bactérienne au tube numéro trois, et mélanger vigoureusement par vortex. Ajouter 100 microlitres de tube numéro trois au tube numéro quatre et mélanger à nouveau. Répétez la procédure pour le tube numéro cinq à partir du tube numéro quatre.Répartir 100 microlitres du contenu des tubes numéro trois, numéro quatre, numéro cinq, et la culture initiale étiquetée respectivement sur les secteurs 10-3, 10-5, 10-7, et 10-1 de la plaque d’agar de sang. Laissez les plaques d’agar de sang sous le capot laminaire sécher à l’air les tartinades bactériennes, généralement pendant 10 minutes. Ensuite, placez les plaques à 37 degrés Celsius pour l’incubation pendant la nuit.Après l’incubation d’une nuit, comptez les colonies bactériennes pour obtenir le nombre d’FC. Dans des conditions de stress, l’attachement bactérien semblable à travers les divers tissus de greffe a été observé pour l’infection de staphylococcus aureus et d’epidermidis de staphylocoque. Suivant les procédures, le streptocoque sanguinis a montré la réduction significative de l’adhérence à la paroi jugulaire bovine de veine, par rapport au patch bovin de péricardium.En comparant les trois espèces de bactéries, streptococcus sanguinis présente une adhérence significativement plus faible à la paroi veineuse jugulaire bovine par rapport au staphylocoque aureus et au staphylocoque epidermidis. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir préparé les tissus corrects de la même tête. Il assurera des conditions similaires pour tous les spécimens expérimentaux et minimisera la variabilité des données entre les différentes séries d’expériences.Après son développement, cette technique permet aux chercheurs d’explorer les systèmes de troubles complexes étape par étape en enrichissant leurs approches modèles in vitro avec différents éléments pour accumuler toute la complexité proche de l’état médical.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Procédé pour la culture d'une monocouche de cellules endothéliales sur toute la surface intérieure 3D d'un dispositif microfluidique avec microvasculaire taille canaux (&lt;30 um) est décrite.

Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

Source : Ditkowski, B., et al. Un modèle in vitro d’un système de perfusion à plaques parallèles pour étudier l’adhésion bactérienne aux tissus greffés. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo démontre la méthode d’utilisation d’une chambre de flux à plaques parallèles pour perfuser des bactéries marquées fluorescentement sur les tissus de greffe vasculaire, permettant une analyse contrôlée de l’adhésion bactérienne et de la pathogénie précoce en conditions de cisaillement.

Modèle in vitro à flux parallèle de plaques pour étudier l’adhésion bactérienne lors d’une biopsie tissulaire

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et...

Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis est un agent pathogène humain spécifique qui infecte les vaisseaux sanguins. Dans ce protocole, les microvaisseaux humains sont introduites dans une souris par greffage de peau humaine sur les souris immunodéprimées. Les bactéries adhèrent largement aux navires humains, entraînant des dommages et le développement vasculaire du purpura généralement observée dans des cas humains.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Pour étudier l’interaction des bactéries avec les vaisseaux sanguins sous contrainte de cisaillement, une chambre d’écoulement et un modèle de microscopie intravitale mésentérique in vivo sont décrits qui permettent de disséquer les facteurs bactériens et hôtes contribuant à l’adhésion vasculaire.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Ce protocole présente la mise en place et le fonctionnement d’un bioréacteur nouvellement développé, imprimé en 3D, pour la culture ex vivo de vaisseaux sanguins en perfusion. Le système est conçu pour être facilement adopté par d’autres utilisateurs, pratique, abordable et adaptable à différentes applications expérimentales, telles que la biologie fondamentale et les études pharmacologiques.

Ex Vivo Culture de perfusion de gros vaisseaux sanguins dans un bioréacteur imprimé en 3D

Découvrez une chambre d'écoulement in vitro pour étudier l'adhérence bactérienne aux greffes tissulaires et la pathogenèse de l'endocardite infectieuse. Cette méthode standardisée révèle les interactions moléculaires clés.

Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

Explorer plus de vidéos