Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la pathogénie de l’endocardite infectieuse, et les pathobiogrammes à travers des domaines tels que l’interaction entre les bactéries, les cellules sanguines et les cellules endothéliales doublure musculature. Le principal avantage de cette technique est que les greffes de tissus peuvent être directement exposées à des interactions mutuelles avec diverses cibles, telles que les bactéries, les plaquettes et les protéines dans des conditions d’écoulement normalisées. L’implication de cette technique s’étend à notre thérapie de l’endocardite infectieuse, parce qu’elle peut démêler les interactions moléculaires importantes et les facteurs conduisant à l’infectiosité élevée de certains tissus.

Cette méthode donne un aperçu de la pathogénie de la formation de végétation. Il peut également être applicable dans les études portant sur la perméabilité vasculaire, la mobilité cellulaire et l’expression des cellules géniques. Pour commencer le protocole, placez une biopsie tissulaire préparée précédemment de 10 millimètres de diamètre, et la même épaisseur entre une lame de microscope et une perforation circulaire de huit millimètres, et un joint en caoutchouc avec la surface intérieure face vers le haut, pour entrer en contact avec la suspension bactérienne.

Concentrez-vous sur l’orientation de greffe de tissu tout en étant placé dans le support. Assurez-vous que la surface interne du tissu est déjà exposée aux faces sanguines jusqu’à contact avec votre milieu expérimental. Ensuite, insérez votre support avec le tissu dans la feuille de joint qui est intégrée dans le cadre métallique inférieur de la chambre.

Fixez le cadre métallique supérieur avec la feuille de joint correspondante sur le fond de la chambre avec le support de tissu précédemment inséré. Montez ensuite toute la chambre avec huit vis et visser les écrous. Assurez-vous que la hauteur de la chambre est toujours la même sur les greffons à l’aide d’un étrier ou d’une règle.

Ensuite, connectez la chambre d’écoulement avec une pompe périssaliste. Connectez ensuite le réservoir de liquide de 400 millilitres avec les tubes. Imprènuer les tissus avec des suspensions de 100 millilitres de dix à la colonie de sept étiquettes fluorescentes formant des unités en saline tamponnée de phosphate avec le stress de trois dîners par centimètre carré et le débit correspondant de quatre millilitres par minute pendant une heure en utilisant la pompe périssaltique et le réservoir bactérien.

Recirculez continuellement la suspension bactérienne de 100 millilitres à l’aide du même réservoir de collecte. Après la perfusion, démonter la chambre pour libérer la greffe. Lavez le morceau de tissu deux fois avec quatre millilitres de PBS dans une plaque de 12 puits à l’aide d’un shaker orbital pendant trois minutes.

Ensuite, coupez la partie interne de la greffe à l’aide d’un poinçon de biopsie de la peau avec un diamètre plus petit. Placez chaque biopsie tissulaire dans un tube séparé de 14 millilitres contenant un millilitre de chlorure stérile de sodium de 0,9 %. Détachez les bactéries du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 minutes.

Préparer un seul tube de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour faire des dilutions périodiques de la suspension bactérienne obtenues après sonication. Étiquetez le tube numéro deux. Préparer trois tubes de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour les dilutions périodiques de la suspension bactérienne initiale prise à l’expérience de profusion.

Étiquetez les tubes numéro trois, numéro quatre et numéro cinq. Ensuite, fixez trois plaques d’agar, une pour la perfusion bactérienne, une pour la perfusion de contrôle de PBS, et la troisième pour la suspension bactérienne initiale utilisée pour les perfusions. Étiquetez trois secteurs par plaque pour l’expérience tissulaire de la manière suivante : 10-1, 10-3 et 10-4.

Pour compter le nombre d’unités formant des colonies dans le perfusage bactérien, étiquetez la plaque comme suit : 10-1, 10-3, 10-5 et 10-7. Vortex les tubes contenant la biopsie tissulaire pendant 15 secondes chacun, pour faire des dilutions en série. Pour préparer les dilutions en série, transférez 100 microlitres du tube numéro un au tube numéro deux, et vortexez le tube pour bien mélanger la solution.

Répartir 100 microlitres du contenu du tube numéro un et numéro deux sur les secteurs correspondants, 10-1 et 10-3 de la plaque d’agar. Ensuite, répartir 10 microlitres de tube numéro deux sur le secteur 10 quatre. Répétez cette étape quatre fois pour obtenir quatre croissances distinctes de chaque volume de 10 microlitres.

Pour préparer les dilutions en série de la culture initiale, vortex d’abord la dilution pendant 15 secondes et transférer 100 microlitres de suspension bactérienne au tube numéro trois, et mélanger vigoureusement par vortex. Ajouter 100 microlitres de tube numéro trois au tube numéro quatre et mélanger à nouveau. Répétez la procédure pour le tube numéro cinq à partir du tube numéro quatre.

Répartir 100 microlitres du contenu des tubes numéro trois, numéro quatre, numéro cinq, et la culture initiale étiquetée respectivement sur les secteurs 10-3, 10-5, 10-7, et 10-1 de la plaque d’agar de sang. Laissez les plaques d’agar de sang sous le capot laminaire sécher à l’air les tartinades bactériennes, généralement pendant 10 minutes. Ensuite, placez les plaques à 37 degrés Celsius pour l’incubation pendant la nuit.

Après l’incubation d’une nuit, comptez les colonies bactériennes pour obtenir le nombre d’FC. Dans des conditions de stress, l’attachement bactérien semblable à travers les divers tissus de greffe a été observé pour l’infection de staphylococcus aureus et d’epidermidis de staphylocoque. Suivant les procédures, le streptocoque sanguinis a montré la réduction significative de l’adhérence à la paroi jugulaire bovine de veine, par rapport au patch bovin de péricardium.

En comparant les trois espèces de bactéries, streptococcus sanguinis présente une adhérence significativement plus faible à la paroi veineuse jugulaire bovine par rapport au staphylocoque aureus et au staphylocoque epidermidis. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir préparé les tissus corrects de la même tête. Il assurera des conditions similaires pour tous les spécimens expérimentaux et minimisera la variabilité des données entre les différentes séries d’expériences.

Après son développement, cette technique permet aux chercheurs d’explorer les systèmes de troubles complexes étape par étape en enrichissant leurs approches modèles in vitro avec différents éléments pour accumuler toute la complexité proche de l’état médical.