Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie endothéliale, comme pourquoi les vaisseaux sanguins ont-ils des différences régionales dans le développement de l’athérosclérose? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude simultanée de plusieurs conditions dans des conditions de cisaillement ou de multiples conditions de stress de cisaillement. Les implications de cette technique s’étendent vers la compréhension de la régulation des gènes endothéliales dans les systèmes artériel et veineux parce que divers taux et modèles de débit peuvent être utilisés.

Eh bien ici, nous démontrons un système qui utilise un flux laminaire régulier. La configuration peut être adaptée à d’autres modèles d’écoulement, y compris le débit perturbé. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal à maintenir un monocouche continu de cellules tout au long de la durée de l’expérience et d’obtenir des résultats cohérents entre les expériences.

24 heures avant l’analyse, compter les cellules endothéliales humaines à un passage précoce et semer environ une fois 10 à la sixième cellule dans un millilitre de milieu sur une glissière de verre enduit de fibronectine par puits d’une plaque de culture cellulaire à quatre puits. Laissez les cellules adhérer à la lame pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Couvrez ensuite chaque toboggan de trois millilitres de milieu et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2 pendant 24 heures.

Le jour de l’expérience, remplissez le plateau d’eau d’un grand environnement chauffé et intégré de CO2 réglable et de chaleur, ou incubateur de plage, avec plusieurs étagères, accès à l’électricité interne et portes vitrées, et confirmez qu’un dioxyde de carbone adéquat est disponible pour l’expérience, et que le moniteur de CO2 est fonctionnel. Pour installer la chambre d’écoulement, insérez un leurre femelle de 1/8 pouce dans une extrémité d’un tube mou numéro 16, et fixez un robinet d’arrêt à quatre sens au leurre. Fixez l’extrémité libre du tube sur le côté d’entrée de la plaque supérieure et insérez un leurre mâle de 1/8e pouce dans une extrémité d’un deuxième tube mou numéro 16.

Fixez un robinet d’arrêt à quatre sens au leurre masculin et fixez l’extrémité libre du tube au côté sortant de la plaque supérieure. Insérez un leurre mâle de 1/8e pouce et un leurre femelle de 1/8e pouce dans chaque extrémité d’un troisième tube mou numéro 16, et attachez le tube à un piège à bulles par l’intermédiaire du leurre mâle de 1/8e pouce. Attachez ensuite un robinet d’arrêt à quatre à l’autre extrémité du tube par l’intermédiaire du leurre femelle.

À l’aide d’une pince stérile, transférer une glissière en verre ensemencé à cellule à l’évidement sur la plaque inférieure, côté cellulaire ensemencé vers le haut. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour ajouter 10 millilitres de milieu chaud à la plaque inférieure dans la ligne de joint rouge autour de la plaque. Permettant au milieu de circuler à travers la lame et de couvrir les cellules.

Placez délicatement la plaque supérieure sur la plaque inférieure en prenant soin d’aligner les côtés et visser les plaques ensemble étroitement. Pour éliminer les bulles d’air du piège à bulles, ouvrez d’abord les robinets d’arrêt de l’entrée et du piège à bulles et fermez le robinet d’arrêt sortant. Ensuite, utilisez une seringue de 30 millilitres pour rincer doucement 20 millilitres de milieu chaud à travers la plaque.

Pour enlever les bulles de la chambre, fermez le robinet d’arrêt du piège à bulles et ouvrez le robinet d’arrêt sortant. Élever le côté sortant de la chambre à un angle de 45 degrés et utiliser la seringue de 30 millilitres pour rincer doucement 20 millilitres de milieu chaud du côté de l’afflux de la chambre. Il est important de rincer à un rythme approprié dans le sens du flux et d’utiliser le microscope pour confirmer qu’un monocouche confluent de cellules reste avant d’exposer les cellules au flux laminaire.

Fermez ensuite les robinets d’arrêt des deux côtés de la chambre et du capuchon et confirmez que les cellules sont toujours fixées à la glissière sous un microscope léger. Placez la chambre d’écoulement et un système de boucle d’écoulement précédemment assemblé dans la plage et diminuez lentement la vitesse de la pompe de l’assemblage de la boucle d’écoulement avant de suspendre complètement la pompe. Fermez les robinets d’arrêt sur le système de boucle d’écoulement pour éviter les fuites et reliez le système de chambre et de boucle ensemble via des robinets d’arrêt.

Lorsque toutes les boucles ont été raccordées, rouvrir tous les robinets d’arrêt et augmenter lentement la vitesse de la pompe tout en surveillant la configuration pour toute fuite ou blocage. Placez le capteur d’écoulement sur le tube de pont de chambre du côté d’entrée de la chambre avec le capteur orienté dans la direction du flux et ajustez la vitesse de pompe pour obtenir le taux d’écoulement pour le taux d’intérêt de stress de cisaillement. Ensuite, allumez le réservoir de CO2 pour atteindre une concentration de 5%C02.

Une fois la période d’écoulement expérimentale terminée, diminuez lentement la vitesse de la pompe périssaltique à zéro et éteignez la puissance. Fermez rapidement tous les robinets d’arrêt ouverts et transférez la chambre et le tube attaché avec un robinet d’arrêt de chaque côté à un dessus propre de banc. Dévissez soigneusement toutes les vis pour enlever la plaque supérieure et utilisez des pinces à épiler pour transférer la glissière de verre de la plaque inférieure à un plat de 100 millimètres de diamètre.

Lavez la lame en 10 millilitres de PBS froid et vérifiez les cellules au microscope pour confirmer l’adhérence et l’alignement cellulaires dans le sens de l’écoulement. Après avoir aspiré le PBS, transférer la diapositive dans un plat propre de 100 millimètres de diamètre et ajouter 350 microlitres de tampon de lyse complétés par 1/100e de bêta-mercaptoéthanol à partir d’un kit d’extraction d’ARN à la diapositive. Utilisez un grattoir à cellules à lame de polyéthylène pour gratter les cellules de la lame et incliner le plat de culture tissulaire pour permettre au tampon de se mettre en commun au fond.

Utilisez des forceps pour enlever la glissière et pipette la cellule lysate dans un tube de 1,5 millilitre sur la glace. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’ARN de luciferase dilué au lysate cellulaire pour l’isolement et l’analyse de l’ARN en aval selon les protocoles standard. Une linéarisation réussie du plasmide de luciferase utilisant des enzymes de restriction peut être confirmée en exécutant les produits digérés sur un gel d’agarose et la taille du produit linéarisé peut être confirmée avec des échelles d’ADN et par rapport à un plasmide non coupé.

Les procédés de fabrication peuvent entraîner de petites variations de la hauteur de la chambre, de même que le débit doit être calculé pour chaque chambre afin d’atteindre le même stress de cisaillement. Pour des expériences incorporant le stress laminaire de cisaillement dans les cellules endothéliales mammifères, l’ARN luciferase de luciferase de lucifère de firefly peut être employé comme arrne exogène spike-in. La normalisation du gène de référence endogène, du gène de référence exogène et des gènes de référence endogènes et exogènes donne ensemble des résultats similaires.

Fait à noter, dans ces expériences représentatives utilisant deux chambres d’écoulement simultanément en cours d’exécution avec un stress de cisaillement à un Pascal pour chaque expérience, Kruppel comme facteur deux knockdown via SI-ARN a donné une efficacité knockdown similaire entre les échantillons biologiques testés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’établir un monocouche même des cellules sur la diapositive et de profuser le système de boucle d’écoulement avant d’attacher la chambre d’écoulement. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme le séquençage de l’ARN, peuvent être utilisées pour évaluer l’expression de l’ARN à l’échelle du génome et d’autres réédages, tels que l’ADN et les protéines, peuvent être utilisés pour une analyse moléculaire plus poussée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie endothéliale pour explorer la relation entre le stress de cisaillement et le potentiel angiogénique dans les cellules endothéliales humaines.