Name: Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Apprenez la préparation de tranches médullaires aiguës pour l'enregistrement patch-clamp de cellules entières dans les neurones de la Substantia Gelatinosa. Cette technique permet d'étudier les propriétés électrophysiologiques et la transmission synaptique impliquées dans la régulation de la douleur.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81560198, 31660289).

Tous les protocoles expérimentaux décrits ont été approuvées par l’Animal Ethics Committee de Nanchang University (Nanchang, Chine, éthiques No.2017-010). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le stress et la douleur des animaux expérimentaux. Les enregistrements électrophysiologiques interprétés ici ont été réalisées à température ambiante (RT, 22 – 25 ° C).
1. les animaux
<ol><li>Utiliser des rats Sprague-Dawley (âgés de 3 à 5 semaines) des deux sexes. Loger les animaux sous un cycle lumière-obscurité de 12 h et de leur donner accès ad libitum à l’eau et de nourriture suffisante.</li>
</ol>2. préparation des Solutions et matériaux
<ol><li>Solutions<ol>
<li>Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (en mM) : 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucose, acide ascorbique 0,4 et 2 pyruvate de sodium. Voir le tableau 1.</li>
		<li>Préparer le saccharose-ACSF (en mM) : 240 saccharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, l’acide ascorbique 0,4 et pyruvate de sodium 2. Voir le tableau 2.</li>
		<li>Préparer K+-base de solution intracellulaire (en mM) : 130 K-gluconate, 5 KCl, 10 Na2-phosphocréatine, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP et 0,3 Li-GTP. Voir le tableau 3.</li>
		<li>Préparer Cs+-basé solution intracellulaire (en mM) : 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocréatine, 5 tétraéthylammonium (TEA) - Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP et 0,3 Li-GTP. Voir le tableau 4. Remarque : Toutes les solutions doivent être préparées à l’aide d’eau distillée. ACSF et saccharose-FSCA devraient être carbogenated (95 % O2 et 5 % CO2 mélange) avant usage afin de maintenir un pH optimal d’environ 7,4 et l’osmolalité de ces deux solutions doit être réglée à 300-310 mOsm. Parce que l’acide ascorbique susceptibles d’affecter les canaux calciques, cet agent doit être omis si l'on souhaite enregistrer les courants calcium. L’osmolalité et pH des solutions intracellulaires doivent être mesurés et ajustés à 290 à 300 mOsm et 7.2, 7.3, respectivement. Il est recommandé de filtrer les solutions intracellulaires à 0,2 µm filtres et stocker les solutions sous forme de portions de 1 mL à-20 ° C. CS+ et le thé sont appliqués dans Cs+-solution intracellulaire à canal potassique de bloc, qui est favorable à l’utilisation de l’amplificateur pour contenir la membrane potentielle base stable à 0 mV lors de l’enregistrement courant postsynaptique inhibiteur (CISP).</li>
		<li>Préparer la solution de neurobiotin 488 de 0,05 %. Dissoudre 2 mg de neurobiotin 488 dans 4 mL de K+-basé solution intracellulaire et ajuster l’osmolalité de 290 à 300 mOsm en utilisant de l’eau distillée ou saccharose si nécessaire. Remarque : 1 mM de saccharose augmente l’osmolarité de 1 mOsm.</li>
		<li>Préparer 3 % d’agar comme un bloc à la moelle épinière. Dissoudre 7,5 g d’agar dans 250 mL d’eau purifiée dans un bécher en verre et ensuite utiliser un four à micro-ondes pour chauffer jusqu'à ébullition et clair. Agiter la solution et versez le mélange dans un 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm boîte en plastique pour la solidification par la suite. Garder l’agar à 4 ° C avant de les utiliser.</li>
		<li>Préparer paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour le traitement de l’immunohistochimie. Mélanger 40 g de poudre PFA à ~ 800 mL de chauffé (environ 60 ° C) 1 x solution de PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Lentement, ajuster le pH en ajoutant 1 NaOH N gouttes jusqu'à dissolution complète de la poudre de PFA. Une fois que la solution est devenue claire, réglez le volume total à 1 L avec du PBS 1 x. Réajuster le pH à 7,2 – 7,4 avec 1 N HCl, si nécessaire, puis filtrer la solution à 4 % PFA et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : PFA est toxique, donc il est nécessaire de porter des masques, gants ainsi que des lunettes de sécurité. Conduire le processus de préparation de 4 % PFA à l’intérieur d’une hotte ventilée. Poudre PFA peut être complètement dissous à un pH d’environ 9-10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instruments de
	<ol>
<li>Pour un système typique électrophysiologique, utiliser un microscope vertical équipé de contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) et un objectif de haute résolution-immersion dans l’eau, une caméra CCD/CMOS, un amplificateur de patch clamp, un détenteur d’une micropipette et un micromanipulateur permettant un réglage précis de la position de la pipette. Un stade XY est également nécessaire pour déplacer le microscope.</li>
		<li>Monter tout l’équipement sur une table d’isolement de vibration entourée d’une cage de Faraday. Connectez un moniteur vidéo de la caméra vidéo pour observer les neurones et visualiser les micropipettes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micropipettes
	<ol>
<li>Faire des électrodes d’enregistrement de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur d’une micropipette. Les gammes de résistance pipette typique de MΩ 3-6 lorsque rempli de solution intracellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloc de gélose
	<ol>
<li>Préparer un 1,2 x 1,5 cm x 2,0 cm blocs de gélose. Découper le bloc en les formes illustrés à la Figure 1 , comme l’exige.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. préparation de tranches d’aiguë de la moelle épinière
Remarque : Les tranches de moelle épinière Transverse ou parasagittale sont préparés comme précédemment décrit18,19,20.
<ol><li>Avant transcardial la perfusion et l’extraction de la moelle épinière, préparer ~ 500 mL saccharose-FSCA équilibrée avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 et refroidir la solution à glacée (0 – 4 ° C).</li>
	<li>Refroidir tous les outils de dissection (p. ex., dissection pince courbée, pince dentée, ciseaux, pinces fines, ciseaux iris) sur la glace. Le diagramme de la préparation de tranche médullaires aiguës est illustré à la Figure 1.</li>
	<li>Perfusion Transcardial<ol>
<li>Après une seule injection (voie intrapéritonéale, i.p.) d’uréthane (1,5 g/kg), attendre 2 à 3 min et évaluer la profondeur de l’anesthésie des rats en testant les réponses pincée orteil ou queue. Une fois un plan chirurgical de l’anesthésie est maintenu, placez le rat sur la glace pilée en décubitus dorsal. Remarque : Pour produire suffisamment pour la non perception de la douleur profonde anesthésie au cours de la thoracotomie, suivre vos directives IACUC locales.</li>
		<li>Faites une incision (3 à 4 cm) à travers la peau du processus xiphoïde, à la clavicule et ensuite faire une incision transversale sous le niveau du processus xiphoïde.</li>
		<li>Saisir et relancer le processus xiphoïde avec une paire de pinces courbée pour exposer le diaphragme complètement. Faire une incision transversale à travers la membrane et couper à travers la cage thoracique entre le sternum et les côtes sur le plan bilatéral d’ouvrir la cage thoracique. Utilisez la pince courbée pour saisir le processus xiphoïde alors la cage thoracique est fixe, et le cœur est suffisamment exposé.</li>
		<li>Maintenez le cœur avec une autre pince courbe doucement et puis insérer une aiguille de 22 G dans le ventricule gauche à la base de la crosse aortique.</li>
		<li>Couper l’oreillette droite avec des ciseaux fins immédiatement et commencez la perfusion de saccharose-FSCA glacée et oxygénée grâce à un système par gravité. Remarque : Perfusion de transcardial rapide et suffisant avec saccharose-FSCA glacée peut faciliter le refroidissement rapide de la moelle épinière, tandis que la faible concentration de sodium et de calcium peut aider à atténuer la toxicité excitatrice et de protéger la fonction neuronale. En outre, culots globulaires de compensation serait bénéfique pour la réduction de la coloration de fond de la biocytine lorsque vous effectuez une étude morphologique. La perfusion est considéré comme suffisant et satisfait tant que le liquide sortant de l’oreillette droite est clair et la couleur du foie de rat et des pattes est pâle. La pointe de l’aiguille de 22 G doit être franc afin d’éviter une rupture du cœur et la crosse aortique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissection de la moelle épinière et tranchage<ol>
<li>Faire une incision longitudinale (5 cm) sur la peau arrière de caudale à rostral, puis coupée à travers la cage thoracique entre la colonne vertébrale et les côtes de chaque côté dans l’état de la perfusion.</li>
		<li>Faire une incision à l’extrémité caudale de la colonne vertébrale, utiliser des ciseaux pour découper les tissus environnants et isoler le segment lombo-sacrée de la colonne vertébrale rapidement.</li>
		<li>Transférer le segment lombo-sacrée dans un plat en verre contenant glacee FSCA axée sur le saccharose. Avec la face ventrale vers le haut, utiliser des ciseaux pour couper à travers le pédicule vertébral bilatéralement et exposer la moelle épinière soigneusement. Isoler 2 cm long la moelle épinière lombo-sacrée l’élargissement (L1 – S3) et la section de la colonne vertébrale de transfert à un autre plat de verre rempli de saccharose-FSCA froid.</li>
		<li>Retirez les méninges et la membrane de pia-arachnoïde sous un microscope à dissection. Coupez tous les ventrale et dorsale racines aussi rapidement que possible.</li>
		<li>Placez la moelle épinière sur un bloc de gélose précédemment coupé. Pour préparer les tranches transversales, fixez la partie ventrale de la moelle épinière à l’agar et laisser la face dorsale à la lame. Pour préparer les tranches parasagittale, fixez le côté ventral avec colle à l’agar dans le sens vertical comme illustré à la Figure 1. Ensuite, montez le bloc de gélose à une plate-forme d’un vibratome avec superglue. Préparer 300 – 500 µm transversal ou parasagittale tranches avec une vitesse d’avancement de 0,025 mm/s et une fréquence de vibration de 80 Hz.</li>
		<li>Utiliser une pipette garnis de plastique pour transférer les tranches sur la maille en nylon dans une chambre de stockage contenant FSCA continuellement oxygéné à 32 ° C pendant au moins 30 min avant l’enregistrement. Remarque : veiller à éviter toute blessure à la moelle épinière, en particulier dans la corne dorsale, en enlevant les méninges et des racines spinales. La moelle épinière devrait être tranchée dorsale-sur le ventre. Pour de meilleurs résultats, les tranches doivent être préparés rapidement (dans les 15 à 20 min). L’épaisseur d’une tranche de la colonne vertébrale doit être pas plus de 600 µm pour satisfaire la visibilité de la cellule. En outre, la technique décrite ci-dessus pourrait être utilisée pour obtenir des tranches horizontales de la colonne vertébrale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cellule entière Patch-clamp Recordings
<ol><li>Pour effectuer les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière de neurones SG, utiliser K+-basé intracellulaire solution pour la plupart des cas d’enregistrement, tout en appliquant une Cs+-solution uniquement pour l’enregistrement de courants postsynaptiques inhibiteurs à base de.</li>
	<li>Déplacez doucement une tranche de la moelle épinière à la chambre d’enregistrement et maintenir ensuite avec un fil de platine en U attaché avec des fils de nylon fermement pour une stabilité optimale de tranche. Régulièrement perfuse la tranche avec le FSCA propagé à ta grâce à un système par gravité et régler la vitesse de perfusion à 2 à 4 mL/min pour atteindre une oxygénation suffisante.</li>
	<li>Identifier la zone de SG (une bande translucide) en utilisant une lentille microscope basse résolution, choisissez un neurone sain en utilisant l’objectif haute résolution comme la cellule cible et réglez-la au centre de l’écran du moniteur vidéo.</li>
	<li>Remplir une micropipette avec un volume approprié de K+-basé ou Cs+-solution intracellulaire de base si nécessaire, insérez la micropipette dans le porte-électrode et veiller à ce que la solution intracellulaire est en contact avec le fil d’argent à l’intérieur de la titulaire.</li>
	<li>Apporter la micropipette dans le foyer et plongez-le dans le FSCA à l’aide d’un micromanipulateur et puis appliquer une légère pression positive (environ 1 lb/po2 lorsqu’elle est mesurée avec un manomètre) pour forcer la micropipette loin de toute saleté et les débris.</li>
	<li>Déplacer la micropipette vers le neurone cible progressivement. Relâchez la pression positive que la pipette s’approche le neurone et forme une très petite fossette sur la membrane neuronale pour former un gigaseal.</li>
	<li>Modifier l’exploitation potentielle de -70 mV, qui est proche du physiologique au repos potentiel membranaire (RMP) d’une cellule. Ensuite, appliquez une aspiration douce et transitoire à la micropipette pour rupture de la membrane et créer une bonne configuration cellule entière. Remarque : Après le transfert de la tranche dans la chambre d’enregistrement, assurer une perfusion constante pendant au moins 5 min dégager les débris à la surface de la tranche. Il est à noter que la capacité de distinguer entre les neurones sains et malsains/morts est d’une importance primordiale pour la bonne étanchéité et enregistrement stable. Un neurone malsaine/morts a un aspect gonflé et ratatiné, avec un gros noyau visible, alors qu’un neurone sain se caractérise par une forme de 3 dimensions (3D) avec une membrane brillante et lisse, et son noyau est invisible. Pour obtenir une configuration cellule entière, il est essentiel de compenser rapide ou lent capacitance étape par étape, lorsque cela est nécessaire. À la droite, le potentiel de jonction liquid est fixée à 15.1 – 15,2 mV et 4.3-4.4 mV dans K+-basé et Cs+-fonction solution intracellulaire, respectivement. Dans nos études, les données enregistrées n’étaient pas corrigées pour potentiel de jonction liquide.</li>
	<li>Enregistrements de propriétés membranaires intrinsèques<ol>
<li>Enregistrer les propriétés membranaires intrinsèques passive : dossier RMP immédiatement (moins de 20 s) après rodage. Déterminer la résistance d’entrée neuronale en mesurant la tension de réponse à un courant de dépolarisation (10 AP, 500 ms) au RMP en mode courant-clamp.</li>
		<li>Record de propriétés de tir : tester le modèle de mise à feu de chaque neurone en courant-clamp avec une série de 1 s dépolarisant des impulsions de courant (25 – 150 pA avec incrément de 25 pA) à RMP. Mesurer le seuil, l’amplitude et la moitié de la largeur d’un potentiel d’action unique en mode hors connexion.</li>
		<li>Enregistrer une courant : pour évaluer les courants une somatiques, tendez la membrane potentiels à -50 mV en mode voltage clamp. Ensuite, appliquez une série de hyperpolarisant impulsions de tension de 1 s durée de -60 mV à -120 mV, avec une diminution de 10-mV.</li>
		<li>Enregistrer les courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) : EPSCs Record avec le K+-basé solution intracellulaire en mode voltage clamp à un potentiel d’exploitation de -70 mV.</li>
		<li>CISP record : Appliquer Cs+-basé intracellulaire solution pour l’enregistrement de CISP. Une fois la configuration de la cellule entière est établie, tenez la membrane potentiels à -70 mV pendant ~ 5 min et puis changer l’exploitation potentielle à 0 mV progressivement. Attendez quelques minutes pour la stabilisation et ensuite commencer à enregistrer les événements de l’IPSC. Remarque : Seuls les neurones dont un PMR est inférieure à-50 mV et affichage de remise des gaz doivent être sélectionnés pour une étude plus approfondie. Les résistances de la série dans notre étude sont en général 10-30 MΩ, et il convient d’exclure un enregistrement, une fois la résistance série change de plus de 20 %. EPSCs ont pu être confirmées par une application de bain de 50 µM APV et 20 µM CNQX, tandis que le CISP ont pu être confirmées avec 10 µM bicuculline et la strychnine de 1 µM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. morphological study
<ol><li>Pour les expériences morphologiques, utiliser un K+-basé intracellulaire solution contenant 0,05 % neurobiotin 488.</li>
	<li>Après maintien stable pendant au moins 20 min d’enregistrement électrophysiologique, retirez lentement la micropipette vers le haut pour permettre à la membrane cellulaire refermer et transférer la tranche de la moelle épinière à un réservoir rempli de 4 % PFA. Fixez les tranches dans 4 % PFA à RT pendant 1 h puis à 4° C durant la nuit.</li>
	<li>Rincez les tranches dans du PBS et puis les plonger dans l’éthanol à 50 % pendant 30 min. Après un autre trois lavages en PBS, monter les tranches dans leur épaisseur initiale sur glissières avec un milieu de montage.</li>
	<li>Utiliser un microscope confocal (voir Table des matières) pour l’acquisition d’images et de reconstruction 3D neuronale. Scan des neurones à travers une lentille X 20 avec une z-pile de 1,5 µm.</li>
</ol>

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<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Ce protocole détaille les étapes pour la préparation de tranches de moelle épinière, que nous avons utilisée avec succès lors d’expériences de patch-clamp de la cellule entière sur SG neurones18,19,20,21. En appliquant cette méthode, nous avons récemment rapporté que la minocycline, une deuxième génération de tétracycline, pourraient améliorer sensiblement la transmission synaptique inhibitrice...

La substantia gelatinosa (SG, limbe II de la corne dorsale de la colonne vertébrale) est un centre d’indiscutablement important relais de transmission et de régulation de l’information sensorielle. Il est composé des interneurones excitateurs et inhibiteurs, qui reçoivent des entrées des fibres afférentes primaires et le système inhibiteur descendant endogène1interneurones les. Ces dernières décennies, le développement de la préparation de tranches médullaires aiguës et l’avènement de l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière ont permis à diverses études sur les propriétés intrinsèques d’électrophysiologiques et morphologiques des SG neurones2, 3 , 4 ainsi que les études des circuits locaux SG5,6. En outre, grâce à la préparation de tranche in vitro la moelle épinière, chercheurs capables d’interpréter les changements neuronaux excitabilities7,8, la fonction d’ion canaux9,10, et 11,12 , dans diverses conditions pathologiques, activités synaptiques. Ces études ont approfondi notre compréhension du rôle que jouent les neurones de la SG dans le développement et l’entretien de la douleur chronique et neuropathique marginé.
La condition préalable essentielle pour obtenir une visualisation claire de soma neuronale et idéal de rapiéçage cellule entière en utilisant des tranches médullaires aiguës est essentiellement, pour assurer l’excellente qualité des tranches sorte sains et patchables neurones peuvent être obtenus. Cependant, la préparation de tranches de moelle épinière implique plusieurs étapes, par exemple effectuer une laminectomie ventrale et enlever la membrane de pia-arachnoïde, qui peut-être être des obstacles pour obtenir des tranches en bonne santé. Bien qu’il n’est pas facile de préparer des tranches de la moelle épinière, effectuant enregistrements in vitro sur des tranches de la moelle épinière présente plusieurs avantages. Par rapport aux préparations de culture de cellules, tranches de moelle épinière peuvent préserver partiellement des connexions synaptiques inhérentes qui sont dans un état physiologiquement pertinent. En outre, cellule entière patch clamp enregistrement en utilisant des tranches de moelle épinière pourrait être combiné avec d’autres techniques, telles que double patch clamp13,14, études morphologiques15,16 et single-cell RT-PCR 17. par conséquent, cette technique apporte des précisions sur la caractérisation de la diversité anatomique et génétique dans une région spécifique et permettant l’étude de la composition des circuits locaux.
Ici, nous fournissons une description préliminaire et détaillée de notre méthode pour préparer les tranches médullaires aiguës et acquérir des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière des neurones de la SG.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Utilisé pour la préparation d’ACSF et de PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>Utilisé pour la préparation d’ACSF, de saccharose-ACSF et de K+ solution intracellulaire à base de</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot ; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>Utilisé pour la préparation d’ACSF, de saccharose-ACSF et de PBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot ; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Utilisé pour la préparation de l’ACSF</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td>Utilisé pour la préparation d’ACSF et de saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>Utilisé pour la préparation de saccharose-ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>Utilisé pour la préparation de solution intracellulaire à base de K+</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocréatine</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>Utilisé pour la préparation de solution intracellulaire</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+ solution</td></tr><tr><td>Neurobiotine 488</td><td>Vecteur</td><td>SP-1145</td><td>0,05 % de neurobiotine 488 pourrait être utilisé pour des études morphologiques</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td> Un <td>bloc de gélose à 3 % a été utilisé dans notre protocole</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td> Le <td>paraformaldéhyde à 4 % a été utilisé pour le traitement immunohistochimique</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical Réactifs</td><td></td><td>utilisés pour la préparation du</td></tr><tr><td>milieu de lamelle de montage</td> PBS <td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>National Institute for Food and Drug Control</td><td>30191228</td><td>1,5 g/kg, i.p.</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>1,5 mm OD, 1,12 mm ID</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Utilisé pour la préparation de micropipettes</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Table d’isolation des vibrations</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>Caméra</td> <td>CCD infrarougeDage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Platine X-Y</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>Microscope vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre</td><td>Advanced</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH mètre</td><td>Mettler Microscope Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de substantia gelatinosa

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Des études récentes de patch-clamp de la cellule entière de neurones substantia gelatinosa (SG) ont fourni un grand nombre d’informations sur les mécanismes de la colonne vertébrale qui sous-tendent la transmission sensorielle nociceptive règlement et développement de douleur ou de démangeaisons chronique. Implémentations des enregistrements électrophysiologiques ainsi que des études morphologiques basées sur l’utilité des tranches médullaires aiguës ont encore amélioré notre compréhension des propriétés neuronales et la composition des circuits locaux au journal officiel. Nous présentons ici un guide détaillé et pratique pour la préparation de tranches de moelle épinière et d’enregistrement de germes entiers représentant spectacle et résultats morphologiques. Ce protocole permet la préservation neuronale idéale et peut imiter des conditions in vivo dans une certaine mesure. En résumé, la possibilité d’obtenir une préparation in vitro de tranches de moelle épinière permet aux enregistrements de courant et tension-bride stable et pourrait donc faciliter des enquêtes détaillées sur les propriétés membranaires intrinsèques, des circuits locaux et structure neuronale à l’aide de diverses approches expérimentales.

Tranches de médullaires aiguës ont été préparés selon le schéma indiqué à la Figure 1. Après le tranchage et la récupération, une tranche de la moelle épinière a été transférée à la chambre d’enregistrement. Les neurones en bonne santé ont été identifiés basé sur l’apparence de soma à l’aide de la microscopie IR-DIC. Ensuite, les potentiels d’action des neurones SG ont été provoquées par une série de dépolarisation des impulsions de courant (durée de 1 s) qua...

Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Cette méthode peut aider à clarifier les mécanismes rachidiens sous-jacents à la transmission sensorielle, la régulation nociceptive et la douleur chronique ou le développement des douleurs Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut permettre une préservation neuronale idéale et qu’elle peut imiter les conditions in vivo dans une certaine mesure. Commencez par extraire les électrodes d’enregistrement des microcapillaires en verre borosilicate à l’aide d’un pull capillaire. Ensuite, remplissez un moule avec de l’agar fondu pour préparer un bloc d’agar de 1,2 centimètre par 1,5 centimètre par 2,0 centimètres.Coupez le bloc pour avoir un canal central si vous planifiez des sections transversales. Ou une chair de canal avec le bord du bloc pour les sections parasagittal. Avant la profusion transcardique et l’extraction de la moelle épinière, préparez 500 millilitres d’ACSF à base de saccharose.Refroidir la solution au froid glacial et à l’équilibre avec 95% d’O2 et 5% de CO2. Refroidir tous les outils de dissection sur la glace. Faire une incision longitudinale de cinq centimètres sur la peau arrière de caudal à rostral.Ensuite, couper à travers la cage thoracique entre la colonne vertébrale et les côtes de chaque côté. Utilisez des ciseaux pour faire une coupe à l’extrémité caudale de la colonne vertébrale. Coupez ensuite les tissus environnants et isolez rapidement le segment lumbosacral de la colonne vertébrale.Transférer le segment lumbosacral dans un plat en verre contenant du saccharose glacé à base d’ACSF. Avec le côté ventral vers le haut, utilisez de fines ciseaux pour couper à travers le pédule vertébrale bilatéralement et exposer la moelle épinière avec soin. Isoler une section de deux centimètres de long de la moelle épinière avec l’agrandissement lumbosacral et transférer la section vertébrale dans un autre plat en verre rempli de saccharose froid ACSF.Travailler sous un microscope à dissection pour enlever les méninges et la membrane arachnoïdique pia. Coupez toutes les racines ventrales et dorsales le plus rapidement possible. Prenez soin d’éviter les blessures à la moelle épinière, en particulier la corne dorsale lors de l’élimination des méninges et les racines vertébrales.Placez la moelle épinière sur le bloc d’agar préalablement taillé. Pour préparer les tranches transversales, fixez le côté ventral de la moelle épinière à l’agar avec le côté dorsale vers la lame. Pour préparer les tranches parasagittales, fixer le côté ventral avec la superglue à l’agar dans une direction verticale.Ensuite, montez le bloc d’agar sur une plate-forme d’un vibratome avec superglue. Et préparer 300 à 500 microns de tranches transversales ou parasagittales avec une vitesse avancée de 0,025 millimètre par seconde et une fréquence de vibration de 80 Hertz. La moelle épinière doit être tranchée dorso-ventrally.Pour les meilleurs résultats, la tranche doit être préparée dans les 15 à 20 minutes. L’épaisseur de la tranche vertébrale ne doit pas être supérieure à 600 microns pour satisfaire la visibilité cellulaire. Utilisez une pipette garnie de plastique pour transférer les tranches sur du maillage en nylon dans une chambre de stockage contenant de l’ACSF continuellement oxygéné à 32 degrés Celsius.Pour effectuer des enregistrements de pince de correction de cellules entières des neurones gélatineux ou SG de substantia, utilisez des solutions intracellulaires basées sur l’ion de potassium pour l’enregistrement tout en appliquant la solution basée sur la cation de césium seulement pour l’enregistrement des courants post-synaptiques inhibiteurs. Déplacez doucement la tranche de moelle épinière vers la chambre d’enregistrement. Et puis stabilisez-le fermement avec un fil de platine en forme de U avec des fils de nylon pour une stabilité optimale des tranches.Abondamment régulièrement la tranche avec ACSF bouillonné à température ambiante et réglez le taux de profusion à deux à quatre millilitres par minute pour atteindre une oxygénation suffisante. Ensuite, à l’aide d’une lentille microscope à basse résolution, identifier la région des neurones SG comme une bande translucide. Choisissez un neurone sain, caractérisé par une forme tridimensionnelle avec une membrane brillante et lisse comme cellule cible en utilisant l’objectif haute résolution et l’ajuster au centre de l’écran du moniteur vidéo.Remplissez une micro pipette d’un volume approprié de solution intracellulaire à base d’ion de potassium ou de césium ion. Insérez ensuite la micro-pipette dans le support de l’électrode et assurez-vous que la solution intracellulaire entre en contact avec le fil d’argent à l’intérieur du support. Mettre la micro pipette au point et utiliser le micromanipulateur pour l’immerger dans l’ACSF.Appliquez une légère pression positive pour éloigner la saleté et les débris. Déplacez graduellement la micro pipette vers le neurone ciblé. Une fois que la pipette s’approche du neurone et qu’une très petite fossette se forme sur la membrane neuronale, relâchez la pression positive pour former un gigaséal.Modifier le potentiel de détention à moins 70 millivolts, ce qui est proche du potentiel physiologique de membrane de repos d’une cellule. Ensuite, appliquez une aspiration transitoire et douce sur la micro pipette pour rompre la membrane et créer une bonne configuration de cellules entières. Enregistrez les propriétés de tir en testant le modèle de tir de chaque neurone dans la pince actuelle avec une série d’impulsions actuelles dépolarisantes d’une seconde de 25 à 150 picoamps avec 25 incréments picoamp au potentiel de membrane de repos.Pour enregistrer les courants somatiques sous-cales, maintenez le potentiel de la membrane à moins 50 millivolts en mode pince de tension, puis appliquez une série d’impulsions de tension hyperpolarisantes d’une seconde de moins 60 millivolts à moins 120 millivolts avec une décrément de 10 millivolts. Enregistrez les courants post-synaptiques excitatifs avec la solution intracellulaire à base d’ion de potassium en mode pince de tension à un potentiel de détention de moins 70 millivolts. Enregistrez les IPSC à l’aide d’une solution intracellulaire à base d’ion de césium pour l’enregistrement des IPSC.Après avoir tenu le potentiel de la membrane à moins 70 millivolts pendant environ cinq minutes, changer graduellement le potentiel de détention à zéro millivolts. Attendez quelques minutes pour la stabilisation, puis commencez à enregistrer les événements IPSC. Les modèles de tir déterminés en injectant une série d’impulsions actuelles dépolarisantes d’une seconde dans un neurone SG au potentiel de membrane de repos peuvent être classés comme tonique-tir, tir retardé, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike et reluctant-firing.Cette image montre le protocole évocant pour les courants subthreshold dans la pince de tension. Ces traces représentatives montrent la réponse à l’injection actuelle hyperpolarisante classée IH, IA et IT. Il s’agit d’une trace représentative des SEPSC enregistrées à partir des neurones SG à moins 70 millivolts en l’absence et la présence de 50 micromolaires APV et 20 micromolaire CNQX. Cette trace montre les SEPC enregistrés avant l’ajout d’APV et de CNQX sur une échelle de temps élargie.Suivant cette procédure sont les méthodes comme les enregistrements appariés pince patch ou optogénétique peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires comme la caractérisation des microcircuits neuronaux spécifiques dans la gélatine gélatine substantia.

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Cette vidéo montre une technique d’enregistrement par patch-clamp à partir de la surface de la membrane dendritique. Cela permet d’examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux ioniques voltage-dépendants sous-jacents dans les neurones dopaminergiques.

Enregistrements patch-clamp de la dendrite d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

L’enregistrement des courants Ca2+ au niveau de la membrane frontale de libération présynaptique est essentiel à une compréhension précise de l’entrée de Ca2+ et de la libération des neurotransmetteurs. Nous présentons une dissociation aiguë de la moelle épinière de la lamproie qui produit des axones réticulospinaux isolés fonctionnels, permettant l’enregistrement directement à partir de la membrane frontale de libération des terminaisons présynaptiques individuelles.

Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l&#39;enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Ici, une procédure permettant d’activer sélectivement une protéine neuronale avec une courte impulsion de lumière en codant génétiquement un acide aminé non naturel photo-réactif dans une protéine neuronale cible exprimée dans les neurones en culture ou in vivo est présentée.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Ce protocole illustre l’implémentation d’un optimisé N-méthyl-D-glucamine (NMDG) méthode de recouvrement protecteur de préparation de tranches de cerveau. Une formulation unique de médias est utilisée pour obtenir fiable des tranches de cerveau sain provenant d’animaux de tout âge et pour diverses applications expérimentales.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Les enregistrements de patch-clamp subcellulaires offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles des dendrites. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles en raison de leur petit diamètre. Le protocole décrit ici vise à faciliter la collecte d’enregistrements stables et fiables à partir des dendrites des neurones dopaminergiques en tranches in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Nous présentons un protocole pour préparer des tranches aiguës de l’hippocampe dorsale-intermédiaire des souris. Nous comparons cette préparation transversale avec le tranchage coronal en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.

Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes

Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.

Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Apprenez la préparation de tranches médullaires aiguës pour l'enregistrement patch-clamp de cellules entières dans les neurones de la Substantia Gelatinosa. Cette technique permet d'étudier les propriétés électrophysiologiques et la transmission synaptique impliquées dans la régulation de la douleur.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

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