Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Cette méthode peut aider à clarifier les mécanismes rachidiens sous-jacents à la transmission sensorielle, la régulation nociceptive et la douleur chronique ou le développement des douleurs Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut permettre une préservation neuronale idéale et qu’elle peut imiter les conditions in vivo dans une certaine mesure. Commencez par extraire les électrodes d’enregistrement des microcapillaires en verre borosilicate à l’aide d’un pull capillaire. Ensuite, remplissez un moule avec de l’agar fondu pour préparer un bloc d’agar de 1,2 centimètre par 1,5 centimètre par 2,0 centimètres.

Coupez le bloc pour avoir un canal central si vous planifiez des sections transversales. Ou une chair de canal avec le bord du bloc pour les sections parasagittal. Avant la profusion transcardique et l’extraction de la moelle épinière, préparez 500 millilitres d’ACSF à base de saccharose.

Refroidir la solution au froid glacial et à l’équilibre avec 95% d’O2 et 5% de CO2. Refroidir tous les outils de dissection sur la glace. Faire une incision longitudinale de cinq centimètres sur la peau arrière de caudal à rostral.

Ensuite, couper à travers la cage thoracique entre la colonne vertébrale et les côtes de chaque côté. Utilisez des ciseaux pour faire une coupe à l’extrémité caudale de la colonne vertébrale. Coupez ensuite les tissus environnants et isolez rapidement le segment lumbosacral de la colonne vertébrale.

Transférer le segment lumbosacral dans un plat en verre contenant du saccharose glacé à base d’ACSF. Avec le côté ventral vers le haut, utilisez de fines ciseaux pour couper à travers le pédule vertébrale bilatéralement et exposer la moelle épinière avec soin. Isoler une section de deux centimètres de long de la moelle épinière avec l’agrandissement lumbosacral et transférer la section vertébrale dans un autre plat en verre rempli de saccharose froid ACSF.

Travailler sous un microscope à dissection pour enlever les méninges et la membrane arachnoïdique pia. Coupez toutes les racines ventrales et dorsales le plus rapidement possible. Prenez soin d’éviter les blessures à la moelle épinière, en particulier la corne dorsale lors de l’élimination des méninges et les racines vertébrales.

Placez la moelle épinière sur le bloc d’agar préalablement taillé. Pour préparer les tranches transversales, fixez le côté ventral de la moelle épinière à l’agar avec le côté dorsale vers la lame. Pour préparer les tranches parasagittales, fixer le côté ventral avec la superglue à l’agar dans une direction verticale.

Ensuite, montez le bloc d’agar sur une plate-forme d’un vibratome avec superglue. Et préparer 300 à 500 microns de tranches transversales ou parasagittales avec une vitesse avancée de 0,025 millimètre par seconde et une fréquence de vibration de 80 Hertz. La moelle épinière doit être tranchée dorso-ventrally.

Pour les meilleurs résultats, la tranche doit être préparée dans les 15 à 20 minutes. L’épaisseur de la tranche vertébrale ne doit pas être supérieure à 600 microns pour satisfaire la visibilité cellulaire. Utilisez une pipette garnie de plastique pour transférer les tranches sur du maillage en nylon dans une chambre de stockage contenant de l’ACSF continuellement oxygéné à 32 degrés Celsius.

Pour effectuer des enregistrements de pince de correction de cellules entières des neurones gélatineux ou SG de substantia, utilisez des solutions intracellulaires basées sur l’ion de potassium pour l’enregistrement tout en appliquant la solution basée sur la cation de césium seulement pour l’enregistrement des courants post-synaptiques inhibiteurs. Déplacez doucement la tranche de moelle épinière vers la chambre d’enregistrement. Et puis stabilisez-le fermement avec un fil de platine en forme de U avec des fils de nylon pour une stabilité optimale des tranches.

Abondamment régulièrement la tranche avec ACSF bouillonné à température ambiante et réglez le taux de profusion à deux à quatre millilitres par minute pour atteindre une oxygénation suffisante. Ensuite, à l’aide d’une lentille microscope à basse résolution, identifier la région des neurones SG comme une bande translucide. Choisissez un neurone sain, caractérisé par une forme tridimensionnelle avec une membrane brillante et lisse comme cellule cible en utilisant l’objectif haute résolution et l’ajuster au centre de l’écran du moniteur vidéo.

Remplissez une micro pipette d’un volume approprié de solution intracellulaire à base d’ion de potassium ou de césium ion. Insérez ensuite la micro-pipette dans le support de l’électrode et assurez-vous que la solution intracellulaire entre en contact avec le fil d’argent à l’intérieur du support. Mettre la micro pipette au point et utiliser le micromanipulateur pour l’immerger dans l’ACSF.

Appliquez une légère pression positive pour éloigner la saleté et les débris. Déplacez graduellement la micro pipette vers le neurone ciblé. Une fois que la pipette s’approche du neurone et qu’une très petite fossette se forme sur la membrane neuronale, relâchez la pression positive pour former un gigaséal.

Modifier le potentiel de détention à moins 70 millivolts, ce qui est proche du potentiel physiologique de membrane de repos d’une cellule. Ensuite, appliquez une aspiration transitoire et douce sur la micro pipette pour rompre la membrane et créer une bonne configuration de cellules entières. Enregistrez les propriétés de tir en testant le modèle de tir de chaque neurone dans la pince actuelle avec une série d’impulsions actuelles dépolarisantes d’une seconde de 25 à 150 picoamps avec 25 incréments picoamp au potentiel de membrane de repos.

Pour enregistrer les courants somatiques sous-cales, maintenez le potentiel de la membrane à moins 50 millivolts en mode pince de tension, puis appliquez une série d’impulsions de tension hyperpolarisantes d’une seconde de moins 60 millivolts à moins 120 millivolts avec une décrément de 10 millivolts. Enregistrez les courants post-synaptiques excitatifs avec la solution intracellulaire à base d’ion de potassium en mode pince de tension à un potentiel de détention de moins 70 millivolts. Enregistrez les IPSC à l’aide d’une solution intracellulaire à base d’ion de césium pour l’enregistrement des IPSC.

Après avoir tenu le potentiel de la membrane à moins 70 millivolts pendant environ cinq minutes, changer graduellement le potentiel de détention à zéro millivolts. Attendez quelques minutes pour la stabilisation, puis commencez à enregistrer les événements IPSC. Les modèles de tir déterminés en injectant une série d’impulsions actuelles dépolarisantes d’une seconde dans un neurone SG au potentiel de membrane de repos peuvent être classés comme tonique-tir, tir retardé, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike et reluctant-firing.

Cette image montre le protocole évocant pour les courants subthreshold dans la pince de tension. Ces traces représentatives montrent la réponse à l’injection actuelle hyperpolarisante classée IH, IA et IT. Il s’agit d’une trace représentative des SEPSC enregistrées à partir des neurones SG à moins 70 millivolts en l’absence et la présence de 50 micromolaires APV et 20 micromolaire CNQX. Cette trace montre les SEPC enregistrés avant l’ajout d’APV et de CNQX sur une échelle de temps élargie.

Suivant cette procédure sont les méthodes comme les enregistrements appariés pince patch ou optogénétique peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires comme la caractérisation des microcircuits neuronaux spécifiques dans la gélatine gélatine substantia.