Name: Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Apprenez à quantifier les changements du microbiote intestinal murin après traitement antibiotique oral par qPCR. Cette méthode minimise la perte de poids et permet d'étudier la dysbiose microbienne chez Mus musculus.

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Ce travail a été financé par le Conseil de recherches médicales de la UK (subvention de M. P.B./L008157/1) ; R.J. bénéficiait d’une bourse Marie Curie intra-européenne (H2020-ACEM-IF-2015-703639) ; P.m.B. est soutenu par une bourse d’étude par le Medical Research Council du Royaume-Uni et College London partenariat du roi formation doctorale en Sciences biomédicales (MR/N013700/1).

Les expériences décrites ici ont été réalisées à l’aide de 6 à 8 semaines, anciennes souris de type sauvage (C57BL6/J), maintenus dans une usine (SPF) exempte de pathogènes spécifiques. Toutes les expériences animales ont été approuvées par College London le Kings et le bien-être des animaux Institut Francis Crick et organe d’examen éthique, le Home Office du Royaume-Uni. Avant de commencer toute procédure d’animaux, assurez-vous que les autorisations appropriées sont obtenues par le biais de l’institution/organisation locale.
1. l’administration d’antibiotiques
Remarque : Deux méthodes possibles pour un traitement antibiotique sont fournis : gavage oral (étape 1.1) et l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable (étape 1.2).
<ol><li>Gavage oral<ol>
<li>Préparer des stocks d’antibiotiques individuels en les dissolvant dans l’eau stérilisés à l’autoclave pour les concentrations suivantes : ampicilline à 100 mg/mL, gentamicine à 100 mg/mL, néomycine à 100 mg/mL, métronidazole à 10 mg/mL et la vancomycine à 100 mg/mL. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Aliquote et conserver à-20 ° C.</li>
		<li>Préparer un cocktail d’antibiotiques en mélangeant les stocks établis ci-dessus. Pour un volume de 1 mL, mélanger 50 µL d’ampicilline (5 mg/mL en finale), 50 µL de gentamicine (5 mg/mL finale), 50 µL de néomycine (5 mg/mL final), 500 µL de métronidazole (5 mg/mL final), 25 µL de vancomycine (2,5 mg/mL final) et 325 µL d’eau. Préparer le cocktail frais avant utilisation.</li>
		<li>Charger le mélange antibiotique dans une seringue stérile 1 mL et fixer une aiguille de gavage de calibre approprié (20 G pour souris de 15 à 20 g) tout en éliminant les bulles.</li>
		<li>Souris de gavage avec 200 µL du mélange aux antibiotiques.<ol>
<li>Prenez la peau par-dessus l’épaule de souris fermement, étirer la tête et du cou pour redresser le œsophage. Dirigez la boule-la pointe de l’aiguille alimentation le long du toit de la bouche et vers l’arrière du pharynx. Puis, doucement, passez-la vers le bas dans le œsophage et injecter la solution 200 μL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Administrer les antibiotiques autrefois cocktail tous les jours pendant la durée de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antibiotiques dans l’eau potable ATTENTION : Surveiller attentivement le poids de la souris par jour pour les deux premières semaines de l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable.<ol>
<li>Préparer un cocktail d’antibiotiques en dissolvant le suit dans 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave : 1 g d’ampicilline (1 g/L final), 1 g de néomycine (1 g/L final), 1 g de métronidazole (1 g/L final), 0,5 g de vancomycine (0,5 g/L final) et 8 sachets (0,75 g chacun) d’artificiel édulcorant (60 g/L final). Agiter jusqu'à dissolution. Conserver à 4 ° C. NOTE : Édulcorant est ajouté pour masquer la saveur des antibiotiques et de prévenir la déshydratation de la souris. Alors que plusieurs marques édulcorant peuvent fonctionner, la concentration finale requise peut être différente pour chaque marque spécifique.</li>
		<li>Verser le cocktail aux antibiotiques dans une bouteille d’eau (~ 100 mL/bouteille) et placer le flacon sur une cage de la souris. Remarque : Utilisez des bouteilles brunes ou couvrir les bouteilles avec une feuille pour protéger les antibiotiques contre la lumière.</li>
		<li>Remplacer le cocktail antibiotique avec stock frais deux fois par semaine pendant la durée de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la collecte d’échantillons de matières fécales de selles, le contenu de l’iléon et iléon mur
<ol><li>Peser et identifier 2 mL tubes stérilisés à l’autoclave pour prélèvement d’échantillons.</li>
	<li>Pour la collecte d’échantillons de selles fraîches, placez chaque souris dans une drisse et recueillir les pelotes fécales directement de l’anus dans un tube de prélèvement. NOTE : Échantillons peuvent également être obtenus en plaçant la souris dans une cage propre autoclavée et le prélèvement d’échantillons de selles avec une pince stérile propre.</li>
	<li>Euthanasier les souris avec CO2 asphyxie suivie par dislocation cervicale.</li>
	<li>Posez une carcasse de souris avec l’abdomen entièrement exposé et pulvériser la région abdominale avec l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux et pinces stérilisées, pratiquer une incision transversale dans l’abdomen pour exposer le péritoine sans endommager les tissus internes. Soulevez le péritoine et pratiquer une incision pour exposer les intestins.</li>
	<li>Retirez les intestins (du côlon vers l’estomac) avec les pinces et ciseaux et placez-le dans une boîte de Petri stérile.</li>
	<li>Utilisez soigneusement pinces pour taquiner l’intestin grêle (SI) loin des artères mésentériques et du gras. Étendre l’intestin et le placer sur un chiffon propre laboratoire.</li>
	<li>Avec une règle, mesurez et coupez 4 cm de l’iléon distal de l’is (la partie la plus proche pour le caecum). Couper et jeter les 1 cm de l’intestin proximal au caecum. Il y aura une partie de 3 cm d’iléon à gauche qui sera utilisé pour recueillir les bactéries intestinales.</li>
	<li>Placez la partie de l’iléon (3 cm) sur un tube stérile de 2 mL. Recueillir le contenu intestinal en extrudant directement l’intestin et rassemblions l’échantillon dans le tube. Cet exemple aura des bactéries présentes dans le contenu de l’iléon.</li>
	<li>Préparer une seringue de 20 mL avec du sérum physiologique froid tamponnée au phosphate (PBS), puis rincez la partie de l’iléon (jeter le cheminement).</li>
	<li>Placer la partie de l’iléon sur une serviette en papier propre et ouvrez-le longitudinalement avec des ciseaux.</li>
	<li>Gratter l’intérieur de la paroi de l’iléon avec un scalpel.</li>
	<li>Collecter toutes les bactéries sur le scalpel en lavant le scalpel avec 1 mL de PBS dans un tube à centrifuger propre. Tourner à 8 000 × g pendant 5 min pour les bactéries de granule et éliminer le surnageant. Cet exemple contient des bactéries provenant de la paroi de l’iléon. Remarque : Des échantillons de selles, le contenu de l’iléon et mur peuvent être congelées et conservées à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Peser les tubes contenant les échantillons de selles et l’iléon contenu et de soustraire le poids des tubes vides (à l’étape 2.1) pour obtenir le poids fécal dans chaque échantillon.</li>
	<li>Extraire l’ADN bactérien de selles, de contenu de l’iléon et d’iléon mur échantillons utilisant des kits disponibles dans le commerce. Conserver les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>3. quantification du microbiote Intestinal de qPCR
Remarque : Cette procédure inclut la génération d’une norme (étape 3.1) et la méthode de mise en place de qPCR pour les échantillons les et standards (étape 3.2)
<ol><li>Génération d’une norme pour qPCR<ol>
<li>Réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet d’amplifier le gène de l’ARNr 16 s de l’ADN génomique extrait d’une culture bactérienne en utilisant les réactifs13 et les conditions PCR détaillés dans le tableau 1.</li>
		<li>Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % et purifier la bande d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce.</li>
		<li>Ligaturer le purifiée fragment d’ADN utilisant un clonage kit (voir la Table des matières, utilisez un vecteur contenant les marqueurs de résistance aux antibiotiques et fusion de gènes β-galactosidase (LacZ) pour la sélection de la colonie de bleu/blanc) et transformer DH10 compétente E. coli suivant les instructions du fabricant. Plaque de transformation sur l’ampicilline (100 µg/mL), des plaques de gélose Luria Bertani (LB) X-gal (20 µg/mL) (10 g/L Tryptone, 5 g/L, extrait de levure, 10 g/L de NaCl, 15 g/L Agar). Incuber pendant la nuit (O/N) à 37 ° C.</li>
		<li>Choisir une colonie seul positifs (blanc) de la plaque. Il inoculer dans 5 mL de bouillon de LB contenant 100 µg/mL d’ampicilline et incuber O/N à 37 ° C, agitation à 250 tr/min.</li>
		<li>De la culture O/N, isoler et purifier le plasmide à l’aide d’une trousse commerciale miniprep conformément aux instructions du fabricant. Remarque : Il est important de la séquence de l’insert de plasmide à ce stade, pour s’assurer que le plasmide ne contienne qu’une seule copie du gène de l’ARNr 16 s et déterminer sa longueur en paires de bases (bp).</li>
		<li>Linéariser le plasmide avec une enzyme de restriction qui coupe le plasmide qu’une seule fois.</li>
		<li>Purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.</li>
		<li>Déterminer la concentration du plasmide par mesurer l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>Calculer le nombre de copies de plasmide/µL de l’échantillon à l’aide de la formule suivante14: nombre d’exemplaires = (quantité * 6.022 × 1023) / (longueur * 1 × 109 * 650) Lorsque le montant est la concentration d’ADN obtenue à l’étape 3.1.8 (en ng/µL) ; et la longueur est la longueur totale du plasmide (avec l’insert) dans bp. Le nombre d’exemplaires sera obtenue comme copies/µL. Remarque : Il existe des outils en ligne basés sur la formule ci-dessus qui permettent le calcul simple du nombre de copies de plasmide.</li>
		<li>Aliquote et magasin la norme au besoin à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR Set-up pour Standard et des échantillons de matières fécales<ol>
<li>Décongeler le qPCR standard (de l’étape 3.1.10), les échantillons de matières fécales ADN (de l’étape 2.15) et les réactifs de qPCR (partir d’un kit disponible dans le commerce) sur la glace. Remarque : qPCR réactifs utilisés dans cet exemple comprennent le mélange de réaction de qPCR SYBR Green et les amorces et inverses (tableau 2).</li>
		<li>Diluer la norme dans l’eau stérile sans ADN dans une gamme de 107 à 102 copies/µL (p. ex., 1/5 des dilutions de 107 à 6,4 x 102 copies/µL). Diluer les échantillons fécaux ADN à 1/2, 1/5, 1/10.
</li>
		<li>Faire une réaction mélange principal pour le nombre total de réactions plus 1 (tableau 2).</li>
		<li>Mix 30 µL du mélange maître et 5 µL de modèle (standard, échantillon ou eau pour contrôle négatif)</li>
		<li>Ajouter 10 µL de ce mélange dans chaque puits dans une plaque 384 puits optique qPCR. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires.</li>
		<li>Sceller l’endroit qPCR, centrifuger brièvement et charger la plaque sur la machine de qPCR programmée dans les conditions suivantes de cyclisme : 95 ° C pendant 20 min suivi de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 1 min.</li>
		<li>Obtenir les valeurs de CT pour standard et échantillons.</li>
		<li>Générer une courbe d’étalonnage en traçant les valeurs de CT pour les normes contre le logarithme du nombre copie du plasmide (tel que calculé à l’étape 3.1.9). Effectuer une régression linéaire de la courbe standard.</li>
		<li>Calculer le nombre de copies des ADNr 16 s pour les échantillons de matières fécales en interpolant les valeurs de CT (obtenus à l’étape 3.2.2) dans la courbe d’étalonnage. NOTE : nombre de copies ADNr 16 s pour chaque échantillon doit être corrigé en tenant compte du facteur de dilution de l’échantillon (tel qu’établi à l’étape 3.2.2), les volume final des acides nucléiques qui sont éluées (à l’étape 2.15) et la quantité d’échantillon fécal (calculée en étape 2.14) pour obtenir copies du gène par gramme de fèces.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici nous fournissons protocoles expérimentaux pour l’administration orale d’antibiotiques à des souris et de quantification des bactéries fécales de qPCR. La combinaison d’antibiotiques utilisés dans les cibles de ce protocole (contenant l’ampicilline, gentamicine, néomycine, métronidazole et vancomycine) des bactéries Gram-positives et Gram-négatives, offrant une activité bactéricide contre un éventail de bactéries. Gavage oral et l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable grandement diminuent les bactéries fécales charger5,6,12. En outre, les deux traitements ont un effet profond sur le phénotype des souris qu’ils développent plusieurs caractéristiques typiques des souris axéniques, y compris la taille de la rate réduite et le caecum élargi. La sélection d’une méthode particulière pour l’administration d’antibiotiques peut éventuellement dépendre de la durée de l’expérience comme la méthode de gavage oral exige une administration quotidienne d’antibiotiques, étant beaucoup plus de travail et éventuellement plus gênants pour la animaux dans le long terme.
Pour l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable, mise en garde s’imposent avec l’ajout de l’édulcorant au mélange antibiotique car il s’agit d’un facteur crucial pour empêcher la souris de déshydratation. Plusieurs groupes ont montré comment l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable (sans ajout de sucre) entraîne très sévère et rapide perte de poids avec toutes les souris perdre plus de 20 % du poids corporel initial dans les premiers jours de l' expérience5 , 6. dans notre protocole, l’utilisation de l’édulcorant à base de saccharine semblait suffisante masquer le goût antibiotiques dans l’eau et les souris ont perdu du poids dans les premiers jours après l’administration d’antibiotiques, mais récupéré leurs poids rapidement après cette ( Figure 1). Néanmoins, dans nos expériences 5 à 10 % des souris encore atteindre l’objectif humain, soit de > 20 % de perte de ligne de base du poids corporel et devaient être euthanasiés. Nous avons aussi testé les édulcorants axée sur le sucralose qui a complètement omis de prévenir la déshydratation de la souris (100 % des souris perdues > 20 % du poids) tandis que d’autres auteurs ont publié des défaillances semblables pour les édulcorants aspartame basée sur5,6. Ajouté à cela, l’âge, la génétique et l’état de santé général des souris utilisées pour les expériences devraient considérer, comme elles peuvent influencer la perte de poids et de bien-être des animaux pendant un traitement antibiotique. Ainsi, un suivi attentif du poids de la souris et l’état de santé général doit être effectué tous les jours pendant les deux premières semaines de l’administration d’antibiotiques par voie orale.
les méthodes de qPCR fournissent une approche rapide et rentable pour la quantification des ARNr 16 s dans les fèces. Toutefois, certaines limitations sont à considérer au sujet de cette technique, y compris : i) la nécessité d’une norme de qualité fiable ; II) la conception et l’efficacité des amorces qPCR ; III) le fait que les micro-organismes peuvent avoir le nombre de copies différentes du gène de l’ARNr 16 s, donc copies du gène ne peuvent pas directement égale à cell compte15. Néanmoins, qPCR est une méthode robuste et sensible qui permet l’analyse rapide des échantillons de matières fécales. Cette méthode peut être particulièrement utile pour valider rapidement l’effet de divers traitements (y compris les antibiotiques) charge bactérienne fécale comme détaillé ici. En outre, même si nous fournissons un protocole de quantification du total 16 s ARNr, cette méthode peut être facilement adaptée (en concevant des amorces spécifiques16) à permettre l’identification des taxons bactériens individuels, fournissant ainsi les deux quantitative et informations qualitatives sur microbiome taille et la composition.
En résumé, nous avons fourni deux protocoles d’antibiothérapie orale de souris et une méthode pour quantifier les changements induits par antibiotiques chez les bactéries fécales qPCR. Bien que ces protocoles peuvent être optimisés et combinées avec d’autres approches selon les différents besoins expérimentaux, ils peuvent servir d’outils rapides, rentables et fiables pour manipuler la microflore intestinale murine et étudier des effets d’un traitement antibiotique dans l’homéostasie intestinale et la maladie.

La muqueuse gastro-intestinale chez les mammifères est un environnement unique colonisé par un mélange très complexe de micro-organismes qui établissent une relation mutualiste avec l’hôte. Le système de défense de la muqueuse intestinale comprend une couche épithéliale et une pléthore de cellules immunitaires qui restreignent les commensaux dans l’intestin tout en préservant leur nombre et leur diversité. À l’inverse, des organismes commensaux sont nécessaires pour le développement d’un système immunitaire complètement fonctionnel. Tandis que les interactions entre l’hôte et les bactéries commensales sont normalement bénéfiques, il devient de plus en plus évident que dysrégulation immunitaire-microbiote diaphonie peut favoriser le développement de maladies inflammatoires chroniques, telle l’intestin asinflammatory la maladie, l’arthrite ou l’asthme1,2.
Le microbiote intestinal peut être modifié par divers facteurs, mais peut-être les changements plus radicaux sont induits par un traitement antibiotique qui altère gravement la taille et la composition des communautés bactériennes3,4. Tandis que les avantages des antibiotiques pour traiter les infections sont indiscutables, les microbiote les changements induits par l’exposition aux antibiotique chez les humains peuvent également modifier les défenses immunitaires qui peuvent conduire à des effets néfastes sur la santé. Par exemple, un traitement antibiotique chez l’être humain a été associé à un risque accru de Clostridium difficile-induite par la diarrhée, l’asthme et certains types de cancer3. Antibiothérapie chez les souris récapitule l’impact et les modifications à long terme dans les communautés intestinale des patients traités par antibiotiques et a permis l’étude des liens entre les changements dans les communautés microbiennes et la fonction des cellules immunitaires mécanistes. Cependant, plusieurs rapports ont montré que l’administration des antibiotiques sur l' eau potable ad libitum entraîne perte de poids très perceptible comme souris s’abstenir de l’eau potable, probablement en raison de son goût fétide5,6. Ainsi, dans ces modèles, la déshydratation sévère concomitante à l’administration d’antibiotiques par voie orale peut compliquer l’interprétation d’expériences visant à déterminer l’effet d’un traitement antibiotique en fonction des cellules immunitaires.
Plusieurs approches permet d’explorer la taille et la composition des communautés microbiennes dans le compartiment intestinale7. Prochaine génération des technologies de séquençage ont fourni des données précieuses sur cette question8, cependant, ces méthodes sont relativement coûteux et nécessitent des analyses bioinformatiques expert pour l’interprétation des données. En revanche, les méthodes traditionnelles de culture microbiologique de faire une détection des espèces bactériennes, mais ils ont une sensibilité faible et une grande partie des bactéries commensales (en particulier les bactéries anaérobies) sont très difficiles voire impossibles à cultiver avec méthodes actuellement disponibles8. Techniques (qPCR) réaction en chaîne de polymérase quantitative sont plus en plus utilisées pour la quantification et l’identification des espèces de bactéries fécales, puisqu’elles fournissent une mesure indépendante de la culture rapide et fiable de la charge microbienne totale. Par conséquent, les méthodes qPCR sont sont révélés utiles pour étudier les changements de la microflore associée avec l’âge ou avec une progression de plusieurs maladies inflammatoires de l’intestin maladies9,10comprise. Dans cette optique, les méthodes de qPCR fournissent une approche rapide et rentable afin de valider l’effet de divers traitements (y compris les antibiotiques) charges bactériennes fécales et microbiote composition10,11,12.
Nous présentons ici un compte-rendu détaillé étape par étape des deux protocoles distincts pour l’administration d’antibiotiques par voie orale à la souris, prélèvement d’échantillons fécaux, extraction de l’ADN, élaboration de normes et de quantification des bactéries dans les fèces par qPCR. Ces protocoles prévoient une méthode fiable pour manipuler le microbiote intestinal chez les souris et étudier les effets d’un traitement antibiotique dans l’homéostasie intestinale et la maladie.

<table><tbody><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Sel de trisulfate de néomycnine hydraté</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>Métronidazole</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vancomycine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sulfate de gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Édulcorant Sweet’n</td><td>Low Sweet’N Low</td><td></td><td>Disponible au Royaume-Uni chez Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside)</td><td>Fisher scientifique</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapure</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Désoxynucléotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>avec ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA cloningTM pour le séquençage</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp fast DNA Stool mini kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp ; kit d’extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0.45 &micro ; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM Lames de scalpel stériles en acier au carbone</td><td>Fisher scientific</td><td>11792724</td><td></td></tr><tr><td>seringue (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>seringue (20 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tube microcentrique transparent en cristal</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Ultra élevé tube de microcentrifugation de récupération</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de dosage oral 20 G x 38 mm courbées (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri stérile 50 mm&nbsp ;</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR plate scellings</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM plaque optique 384 puits&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>système de PCR en temps réel ViiA7TM 7 avec bloc de 384 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotomètre (Nanodrop 1000)</td><td>Microcentrifugeuse Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism Thermocycleur</td><td></td><td></td> Labnet C2500 <td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Le microbiote intestinal a une influence centrale sur la santé humaine. Dysbiose microbienne est associé à plusieurs immunopathologies communs tels que les maladies inflammatoires de l’intestin, l’asthme et l’arthrite. Ainsi, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la diaphonie microbiote-défenses immunitaires est d’une importance cruciale. Administration d’antibiotiques, tout en aidant l’autorisation de l’agent pathogène, induit également des changements drastiques dans la taille et la composition des communautés de bactéries intestinales qui peuvent avoir un impact sur la santé humaine. Antibiothérapie chez les souris récapitule l’impact et les changements à long terme dans la microflore humaine de patients traités aux antibiotiques et permet l’étude des liens entre les changements dans les communautés microbiennes et la fonction des cellules immunitaires mécanistes. Alors que plusieurs méthodes pour un traitement antibiotique de souris ont été décrites, certains d'entre eux provoquent une déshydratation sévère et perte de poids ce qui complique l’interprétation des données. Ici, nous fournissons deux protocoles pour l’administration d’antibiotiques par voie orale qui peut être utilisée pour le traitement à long terme de souris sans provoquer de perte de poids importante. Ces protocoles utilisent une combinaison d’antibiotiques qui ciblent tant Gram-positive et Gram-bactéries et peuvent être fournis soit ad libitum dans l’eau potable ou par gavage. De plus, on décrit une méthode pour la quantification de densité microbienne dans les fèces par qPCR qui peut être utilisé pour valider l’efficacité du traitement antibiotique. La combinaison de ces méthodes fournit une méthodologie fiable pour la manipulation de la microflore intestinale et l’étude des effets d’un traitement antibiotique chez les souris.

Ici, nous fournissons deux protocoles alternatifs pour un traitement antibiotique oral de souris. La figure 1 montre le pourcentage de poids corporel (lié au poids initial de ligne de base pour chaque animal) chez les souris traitées avec des antibiotiques par gavage oral (rouge) ou dans l’eau potable (bleu) pendant 10 jours consécutifs. Aucune perte de poids notable ne se trouve chez des souris qui reçoivent des antibiotiques par gavage. Cependant, lorsque les souris sont traitées avec des antibiotiques, ad libitum , dans l’eau potable, ils perdent du poids (environ 10 %) dans les premiers jours de l’administration d’antibiotiques, mais récupérer le gain de poids normal par la suite (Figure 1). Néanmoins, environ 5 à 10 % des souris ayant reçu des antibiotiques dans l’eau potable peut atteindre &gt; 20 % la perte de poids au sein de la première semaine de traitement, auquel cas ils sont euthanasiés.
La quantification des bactéries dans des échantillons les nécessite l’utilisation d’une courbe d’étalonnage adéquate qui est obtenue en traçant le log du nombre de copies pour le standard (tel que calculé à l’étape 3.2.2) contre les valeurs de CT provenant de qPCR (étape 3.2.7). Figure 2 a montre un exemple représentatif d’une courbe standard qui répond aux critères de performance de courbe d’étalonnage avec une valeur de2 R de 0.99827, une pente de-3.09 et d’une efficacité ((-1 + 10^(-1/slope))*100) de 110 %. R2 valeurs de 0,99 et efficacité PCR au sein de l’ordre de 90 à 110 % sont préférés. Dans la gamme linéaire, l’équation d’analyse de régression permet de quantifier l’abondance d’ADNr 16 s dans les échantillons de matières fécales. Figure 2 b indique le nombre de copies d’ADNr 16 s en tabouret fécal, teneur en SI et mur SI. Figure 2 b, les données apparaissent comme 16 s rDNA copies/g d’échantillon fécal pour tabouret fécal et le contenu de SI. Pour le mur SI, les données sont présentées sous forme de nombre total d’exemplaires d’ADNr 16 s provenant de bactéries provenant de la 3 cm du mur SI (comme la quantité de matériel de départ est trop petite pour obtenir un poids précis).
Pour évaluer l’effet des antibiotiques sur la densité des bactéries dans des échantillons les, souris ont été traitées avec des antibiotiques par gavage tous les jours pendant 10 jours (jours 1 à 10) et les échantillons de selles ont été recueillies avant (jour 0), à différents moments au cours d’un traitement antibiotique ( 5 et 10 jours) et 7 jours après l’arrêt de l’administration antibiotique (jour 17 ; Figure 3 a). Comme le montre la Figure 3 b, un traitement antibiotique induit une forte diminution du nombre de 16 s rDNA copies/g de fèces détecté aux jours 5 et 10, alors que la densité des bactéries dans les matières fécales récupérées à des niveaux normaux (comparables au prétraitement) 1 semaine après administration d’antibiotiques a été arrêtée (17 jours).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> Figure 1 : Administration d’antibiotiques. Des souris ont reçu des antibiotiques par gavage oral (rouge) ou dans l’eau potable (bleu) pendant 10 jours consécutifs. Graphique montre le poids des souris pendant toute la durée des expériences par rapport au poids initial avant l’administration d’antibiotiques (jour 0). Les données apparaissent comme moyenne ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> Figure 2 : amplification de qPCR gène ARNr 16 s des normes et des échantillons fécaux. (A) régression linéaire de la courbe d’étalonnage avec les descripteurs de la courbe d’étalonnage. (B) calcul des abondances de gène d’échantillons de matières fécales. Les données apparaissent comme moyenne ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> Figure 3 : les bactéries fécales au cours d’un traitement antibiotique. Schéma (A) de l’annexe pour l’administration d’antibiotiques par gavage oral (Ab) et prélèvement tel que représenté avec *. (B) 16 s rDNA copie par gramme de fèces dans les échantillons de selles provenant de souris prélevés aux jours indiqués. Les données apparaissent comme moyenne ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN</td>
			<td>8 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon 10 X</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10mM)</td>
			<td>0,4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - apprêt F (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - primer R (10 mM)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Amplification de la Taq</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7,4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Séquences d’amorces</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - apprêt F</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - primer R</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conditions de cyclisme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Température</td>
			<td>Temps</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>10 :</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>10 :</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>10 :</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : PCR réactifs et conditions de. Ce tableau fournit les réactifs et les conditions de cyclisme de PCR pour amplifier le gène ARNr 16 s de culture bactérienne pour la production d’une norme à utiliser dans les essais de qPCR. Séquences d’amorces ont été initialement publiés par Kruglov et al. 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix master SYBR Green (2 x)</td>
			<td>17.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - apprêt F (10 mM)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactéries - primer R (10 mM)</td>
			<td>0.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : mélange maître qPCR. Les volumes illustrés (volume final 35 µL) sont pour un seul échantillon exécutera trois exemplaires (10 µL de chaque) sur une plaque 384 puits qPCR (représentant supplémentaire pour pipetage erreur 5 µL). Le montant peut être ajustée vers le haut selon le nombre d’échantillons à analyser.

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour l’administration orale d’antibiotiques aux souris, collection d’échantillons de matières fécales, l’extraction d’ADN et la quantification des bactéries fécales de qPCR.

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Ce protocole fournit une méthode fiable pour quantifier les changements est le microbiote intestinal des souris suivant l’administration orale d’antibiotiques. Ceci peut aider la recherche sur les interactions croisées de microbiote fournissant la perspicacité dans les pathologies liées à la dysbiose microbienne telle que la maladie intestinale inflammatoire. Le principal avantage de ces régimes de traitement antibiotique est qu’ils empêchent la perte de poids caractéristique normalement associée à l’administration orale d’antibiotiques aux souris.Pour préformer le traitement antibiotique par gavage oral préparer un cocktail d’antibiotiques en mélangeant les solutions de stock qui ont été préparé comme décrit dans le protocole technique. Pour un volume de millilitre mélanger 50 microlitres d’ampicilline, 50 microlitres de gentamicine, 50 microlitres de néomycine, 500 microlitres de métronidazole, 25 microlitres de vancomycine et 325 microlitres d’eau. Chargez le mélange antibiotique sur une seringue d’un millilitre tout en éliminant les bulles et fixez une aiguille de gavage de gage appropriée.Prenez la peau sur l’épaule de la souris fermement et étirez la tête et le cou pour redresser l’œsophage. Dirigez la pointe de boule de l’aiguille d’alimentation le long du toit de la bouche et vers l’arrière du pharynx. Puis passez-le doucement dans l’œsophage et injectez les 200 microlitres de solution.Administrer le cocktail antibiotique une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience. Alternativement pour administrer des antibiotiques à travers l’eau potable, préparer un cocktail d’antibiotiques tel que décrit dans le protocole technique. Il est important d’inclure l’édulcorant dans le mélange antibiotique car il s’agit d’un facteur crucial pour prévenir la déshydratation des souris.Remplissez le cocktail antibiotique dans une bouteille d’eau à environ 100 millilitres par bouteille. Protégez la bouteille de la lumière et placez-la dans une cage à souris. Remplacez le cocktail antibiotique par du bouillon frais deux fois par semaine pendant toute la durée de l’expérience.Une surveillance attentive du poids des souris et de l’état de santé général doit être préformée quotidiennement tout au long de l’administration d’antibiotiques. Pesez et étiquetez deux tubes autoclavés millilimétriques pour la collecte d’échantillons. Pour la collecte d’échantillons de selles fraîches placer chaque souris dans un restrainer.Puis recueillir des granulés fécaux directement à partir de l’anus dans un tube de collecte. Après avoir effectué l’euthanasie telle que décrite dans le protocole technique jeter une carcasse de souris avec l’abdomen entièrement exposé et pulvériser la zone abdominale avec 70% d’éthanol. En utilisant des forceps stérilisés et des ciseaux faire une incision transversale dans l’abdomen pour exposer le peratenium sans endommager les tissus internes.Soulevez le peratenium et faites une incision pour exposer les intestins. Retirer les intestins avec les forceps et les ciseaux et les placer dans une boîte de Pétri stérilisation. Utilisez soigneusement des forceps pour taquiner l’intestin grêle loin des artères mésentériques et de la graisse.Étendre l’intestin et le placer sur un lingette de laboratoire propre. Avec une mesure de règle et couper quatre centimètres de l’iléum distal de l’intestin grêle. Couper et jeter le centimètre d’intestin proximal au cécu.Il restera une portion de trois centimètres d’iléum qui sera utilisée pour recueillir les bactéries intestinales. Maintenez la partie iléum sur un tube stérile de deux millilitres. Recueillir la teneur intestinale en extrtruant directement l’intestin et en recueillant l’échantillon dans le tube.Cet échantillon aura des bactéries de la teneur en iléum. Préparer une seringue de 20 millilitres avec de la solution saline tamponnée de phosphate froid et rincer la partie iléum en jetant le flux à travers. Déposer la portion d’iléum sur une boîte de Pétri stérile et l’ouvrir longitudicilement avec des ciseaux.Gratter l’intérieur de la paroi de l’iléum avec un scalpel. Recueillir toutes les bactéries sur le scalpel en le lavant avec un millilitre de PBS sur un tube de centrifugeuse propre. Tourner à huit mille fois G pendant cinq minutes pour granuler les bactéries.Après centrifugation jeter le supernatant. Cet échantillon contiendra des bactéries de la paroi de l’iléum. Peser les tubes contenant les échantillons de selles et d’iléum.Soustrayez le poids des tubes vides pour obtenir le poids fécal dans chaque échantillon. Extraire l’ADN bactérien des selles, de la teneur en iléum et des échantillons de paroi d’iléum à l’aide de kits disponibles dans le commerce. Conserver les échantillons d’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation.Décongeler la norme qPCR, l’ADN de l’échantillon fécal et les reagents qPCR à partir d’une trousse disponible dans le commerce sur la glace. Diluer la norme dans l’eau libre stérile d’ADN dans une gamme de 10 à sept à 10 aux deux copies par microlitre. Diluer l’ADN de l’échantillon fécal à une moitié, un cinquième et un dixième de concentrations.Ensuite, faites une réaction de mélange maître pour le nombre total de réactions plus une. Mélangez 30 microlitres du mélange principal et 5 microlitres du modèle, qui est soit la norme, l’échantillon ou l’eau pour le contrôle négatif. Ajoutez ensuite 10 microlitres de ce mélange à chaque puits dans une plaque qPCR optique de 384 puits.Effectuez chaque réaction en triplicate. Sceller brièvement la plaque qPCR et la centrifugeuse. Chargez ensuite la plaque sur la machine qPCR qui est répertoriée comme indiqué dans le protocole technique.Enfin obtenir les valeurs de seuil de cycle pour la norme et les échantillons avant de calculer les numéros de copie 16S rDNA pour les échantillons fécaux. Les résultats représentatifs montrent une perte de poids chez la souris après l’administration d’antibiotiques par gavage oral ou par l’eau potable. Aucune perte de poids notable n’est détectée chez les souris qui reçoivent des antibiotiques par gavage oral.Lorsque les souris sont traitées avec des antibiotiques dans l’eau potable, elles perdent environ 10% de leur poids corporel dans les premiers jours du traitement, mais récupèrent le gain de poids normal par la suite. La quantification des bactéries dans les échantillons fécaux nécessite l’utilisation d’une courbe standard obtenue en traçant le logarithme du numéro de copie pour la norme par rapport aux valeurs C-T obtenues dans le QPCR. Dans la plage linéaire, l’équation d’analyse de régression permet la quantification de l’abondance de 16S rDNA dans les échantillons fécaux.Comme indiqué ici pour les selles, la teneur en intestin grêle et les échantillons de paroi de l’intestin grêle. Après cinq ou dix jours d’administration orale d’antibiotiques, il y a une forte diminution de la densité des bactéries dans les échantillons de selles provenant de souris traitées aux antibiotiques. Cependant, la densité des bactéries dans les excréments récupéré à des niveaux normaux une semaine après l’administration d’antibiotiques est arrêté.Le gavage oral et l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable diminuent brièvement la charge bactérienne fécale chez les souris traitées. Les chercheurs qui choisissent la méthode individuelle qui correspond le mieux aux exigences expérimentales en tenant compte de facteurs tels que la durée du traitement. La méthode qPCR pour quantifier les bactéries peut être modifiée pour quantifier les taxons bactériens individuels à l’aide d’amorces spécifiques.Cela fournira des informations quantitatives et qualitives sur la taille et la composition du microbiome.

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Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

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