Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Ce protocole fournit une méthode fiable pour quantifier les changements est le microbiote intestinal des souris suivant l’administration orale d’antibiotiques. Ceci peut aider la recherche sur les interactions croisées de microbiote fournissant la perspicacité dans les pathologies liées à la dysbiose microbienne telle que la maladie intestinale inflammatoire. Le principal avantage de ces régimes de traitement antibiotique est qu’ils empêchent la perte de poids caractéristique normalement associée à l’administration orale d’antibiotiques aux souris.

Pour préformer le traitement antibiotique par gavage oral préparer un cocktail d’antibiotiques en mélangeant les solutions de stock qui ont été préparé comme décrit dans le protocole technique. Pour un volume de millilitre mélanger 50 microlitres d’ampicilline, 50 microlitres de gentamicine, 50 microlitres de néomycine, 500 microlitres de métronidazole, 25 microlitres de vancomycine et 325 microlitres d’eau. Chargez le mélange antibiotique sur une seringue d’un millilitre tout en éliminant les bulles et fixez une aiguille de gavage de gage appropriée.

Prenez la peau sur l’épaule de la souris fermement et étirez la tête et le cou pour redresser l’œsophage. Dirigez la pointe de boule de l’aiguille d’alimentation le long du toit de la bouche et vers l’arrière du pharynx. Puis passez-le doucement dans l’œsophage et injectez les 200 microlitres de solution.

Administrer le cocktail antibiotique une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience. Alternativement pour administrer des antibiotiques à travers l’eau potable, préparer un cocktail d’antibiotiques tel que décrit dans le protocole technique. Il est important d’inclure l’édulcorant dans le mélange antibiotique car il s’agit d’un facteur crucial pour prévenir la déshydratation des souris.

Remplissez le cocktail antibiotique dans une bouteille d’eau à environ 100 millilitres par bouteille. Protégez la bouteille de la lumière et placez-la dans une cage à souris. Remplacez le cocktail antibiotique par du bouillon frais deux fois par semaine pendant toute la durée de l’expérience.

Une surveillance attentive du poids des souris et de l’état de santé général doit être préformée quotidiennement tout au long de l’administration d’antibiotiques. Pesez et étiquetez deux tubes autoclavés millilimétriques pour la collecte d’échantillons. Pour la collecte d’échantillons de selles fraîches placer chaque souris dans un restrainer.

Puis recueillir des granulés fécaux directement à partir de l’anus dans un tube de collecte. Après avoir effectué l’euthanasie telle que décrite dans le protocole technique jeter une carcasse de souris avec l’abdomen entièrement exposé et pulvériser la zone abdominale avec 70% d’éthanol. En utilisant des forceps stérilisés et des ciseaux faire une incision transversale dans l’abdomen pour exposer le peratenium sans endommager les tissus internes.

Soulevez le peratenium et faites une incision pour exposer les intestins. Retirer les intestins avec les forceps et les ciseaux et les placer dans une boîte de Pétri stérilisation. Utilisez soigneusement des forceps pour taquiner l’intestin grêle loin des artères mésentériques et de la graisse.

Étendre l’intestin et le placer sur un lingette de laboratoire propre. Avec une mesure de règle et couper quatre centimètres de l’iléum distal de l’intestin grêle. Couper et jeter le centimètre d’intestin proximal au cécu.

Il restera une portion de trois centimètres d’iléum qui sera utilisée pour recueillir les bactéries intestinales. Maintenez la partie iléum sur un tube stérile de deux millilitres. Recueillir la teneur intestinale en extrtruant directement l’intestin et en recueillant l’échantillon dans le tube.

Cet échantillon aura des bactéries de la teneur en iléum. Préparer une seringue de 20 millilitres avec de la solution saline tamponnée de phosphate froid et rincer la partie iléum en jetant le flux à travers. Déposer la portion d’iléum sur une boîte de Pétri stérile et l’ouvrir longitudicilement avec des ciseaux.

Gratter l’intérieur de la paroi de l’iléum avec un scalpel. Recueillir toutes les bactéries sur le scalpel en le lavant avec un millilitre de PBS sur un tube de centrifugeuse propre. Tourner à huit mille fois G pendant cinq minutes pour granuler les bactéries.

Après centrifugation jeter le supernatant. Cet échantillon contiendra des bactéries de la paroi de l’iléum. Peser les tubes contenant les échantillons de selles et d’iléum.

Soustrayez le poids des tubes vides pour obtenir le poids fécal dans chaque échantillon. Extraire l’ADN bactérien des selles, de la teneur en iléum et des échantillons de paroi d’iléum à l’aide de kits disponibles dans le commerce. Conserver les échantillons d’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Décongeler la norme qPCR, l’ADN de l’échantillon fécal et les reagents qPCR à partir d’une trousse disponible dans le commerce sur la glace. Diluer la norme dans l’eau libre stérile d’ADN dans une gamme de 10 à sept à 10 aux deux copies par microlitre. Diluer l’ADN de l’échantillon fécal à une moitié, un cinquième et un dixième de concentrations.

Ensuite, faites une réaction de mélange maître pour le nombre total de réactions plus une. Mélangez 30 microlitres du mélange principal et 5 microlitres du modèle, qui est soit la norme, l’échantillon ou l’eau pour le contrôle négatif. Ajoutez ensuite 10 microlitres de ce mélange à chaque puits dans une plaque qPCR optique de 384 puits.

Effectuez chaque réaction en triplicate. Sceller brièvement la plaque qPCR et la centrifugeuse. Chargez ensuite la plaque sur la machine qPCR qui est répertoriée comme indiqué dans le protocole technique.

Enfin obtenir les valeurs de seuil de cycle pour la norme et les échantillons avant de calculer les numéros de copie 16S rDNA pour les échantillons fécaux. Les résultats représentatifs montrent une perte de poids chez la souris après l’administration d’antibiotiques par gavage oral ou par l’eau potable. Aucune perte de poids notable n’est détectée chez les souris qui reçoivent des antibiotiques par gavage oral.

Lorsque les souris sont traitées avec des antibiotiques dans l’eau potable, elles perdent environ 10% de leur poids corporel dans les premiers jours du traitement, mais récupèrent le gain de poids normal par la suite. La quantification des bactéries dans les échantillons fécaux nécessite l’utilisation d’une courbe standard obtenue en traçant le logarithme du numéro de copie pour la norme par rapport aux valeurs C-T obtenues dans le QPCR. Dans la plage linéaire, l’équation d’analyse de régression permet la quantification de l’abondance de 16S rDNA dans les échantillons fécaux.

Comme indiqué ici pour les selles, la teneur en intestin grêle et les échantillons de paroi de l’intestin grêle. Après cinq ou dix jours d’administration orale d’antibiotiques, il y a une forte diminution de la densité des bactéries dans les échantillons de selles provenant de souris traitées aux antibiotiques. Cependant, la densité des bactéries dans les excréments récupéré à des niveaux normaux une semaine après l’administration d’antibiotiques est arrêté.

Le gavage oral et l’administration d’antibiotiques dans l’eau potable diminuent brièvement la charge bactérienne fécale chez les souris traitées. Les chercheurs qui choisissent la méthode individuelle qui correspond le mieux aux exigences expérimentales en tenant compte de facteurs tels que la durée du traitement. La méthode qPCR pour quantifier les bactéries peut être modifiée pour quantifier les taxons bactériens individuels à l’aide d’amorces spécifiques.

Cela fournira des informations quantitatives et qualitives sur la taille et la composition du microbiome.