Visualisation en temps réel et l’analyse des chondrocytes blessures résultant d’un chargement mécanique des explants de Cartilage Murine Intact

Cette méthode permet d’étude des effets des différents régimes de chargement mécanique, des conditions environnementales ou des stades de dégénérescence du cartilage sur la vulnérabilité des chondrocytes articulaires in situ. Les forces physiques. Contrairement à d’autres techniques, ces mesures sont effectuées en temps réel et dans un cartilage entièrement intact sans compromettre les conditions limites indigènes.

Un autre avantage de cette technique est qu’il utilise un modèle de souris, permettant de tester comment des gènes spécifiques affectent la susceptibilité des chondrocytes in situ dans les dommages mécaniques. Pour la dissection du fémur distal, placez la souris dans la position supine et faites une incision cutanée de cinq millimètres sur la partie antérieure du genou. Étendre l’incision tout autour du genou.

Et retirez la peau pour exposer les muscles de l’articulation du genou et des jambes. À partir de l’extrémité proximale du fémur, utilisez une lame de scalpel numéro onze pour couper le long de l’os dans la direction distale. Positionnement de la lame entre l’unité du tendon musculaire quadriceps et le côté antérieur de l’arbre fémoral.

Étendre l’incision au-delà de la rotule. Couper à travers le milieu du tendon rotulien pour enlever l’unité de tendon musculaire quadriceps. Ensuite, à partir de l’extrémité proximale du fémur, placez la lame du scalpel entre l’unité du tendon musculaire ischio-jambier et le côté postérieur de l’arbre fémoral et coupez le long de l’os dans la direction distale.

Lorsque l’incision s’approche de l’articulation du genou, couper à travers le tissu mou, et terminer la coupe passé l’articulation du genou. Retirez les quadriceps et les muscles ischio-jambiers pour exposer le fémur. Et couper tout excès de muscle sur les côtés laraux et médiaux de l’os.

Couper le muscle du mollet sur le côté postérieur du tibia proximal. Et retournez la jambe pour visualiser le côté postérieur du fémur. Enlever l’excès de tissu autour de l’articulation du genou pour exposer les condyles distal du fémur et la surface postérieure du tibia proximal.

Coupez les ligaments croisés antérieurs et postérieurs loin des condyles fémoraux. Et tirez le tibia loin du fémur, en coupant tous les ligaments pour séparer la jambe inférieure du fémur. À l’aide de ciseaux de dissection standard, couper le fémur à l’extrémité proximale de l’os à environ huit millimètres au-dessus de l’articulation tibiofemorale du côté latéral.

Et utilisez les forceps du bijoutier pour enlever les tissus mous environnants du fémur. Ensuite, exposer le cartilage sur les deux condyles à l’extrémité distale du fémur. Hydratez périodiquement la surface articulaire avec HBSS.

Pour la dissection de l’humérus, placez la souris dans la position supine. Et utilisez des micro ciseaux pour faire une incision de cinq millimètres sur le côté postérieur du coude. Étendre l’incision autour du coude et retirer la peau pour exposer les muscles sur le bras et l’épaule.

À partir de l’extrémité proximale de l’humérus, placez la lame d’un scalpel numéro onze entre l’unité du tendon musculaire du triceps et le côté postérieur de l’humérus. Et couper le long de l’os dans la direction distale. Étendre l’incision vers l’extrémité distale de l’humérus, à travers le tendon du triceps et retirer les triceps vers l’extrémité proximale de l’humérus jusqu’à ce que la tête humérale soit exposée.

Couper le tissu conjonctif autour de la tête humérale sans toucher la surface articulaire. Et retirez le membre du corps. Hydrater la surface articulaire de la tête humérale avec HBSS.

Pour déconnecter l’humérus du bras, utilisez des forceps pour briser l’extrémité proximale de l’ulna sur le côté postérieur du bras. Et couper le tissu conjonctif autour de l’extrémité distale de l’humérus, en enlevant tout excès de tissu sur l’os. Ensuite, utilisez des ciseaux dissecting standard pour enlever la tubérosité deltoïde sur le côté postérieur de l’humérus.

Et placez le spécimen disséqué dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant du HBSS. Pour la coloration calcéine AM des échantillons, transférer les os dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de 10,05 micro molaires Calcéine dans HBSS. Et placez le tube dans un thermo-mélangeur à 37 degrés Celsius à 800 rpm, à l’abri de la lumière.

Après trente minutes, laver le spécimen dans le HBSS frais pendant dix minutes. Et transférer le spécimen sur la glissière de verre d’un microscope personnalisé monté dispositif d’essai mécanique, de sorte que la surface articulaire des condyles fémoraux postérieurs ou la tête humérale est assis sur le verre. Hydratez le spécimen avec HBSS et placez l’appareil avec le spécimen sur un stade de microscope de fluorescence.

Image les chondrocytes articulaires tachés avec Calcein AM avant l’application de charge sous un grossissement 4x. Ajustez les paramètres d’acquisition pour optimiser la qualité de l’image. Pour appliquer une charge mécanique statique, maintenez une charge statique prescrite sur le dessus de l’échantillon de sorte que le cartilage articulaire soit comprimé contre le verre de couverture pendant cinq minutes avant d’enlever la charge.

Pour appliquer une charge mécanique d’impact, déposez un impacteur cylindrique de poids connu sur l’échantillon à partir d’une hauteur prescrite, libérant la charge cinq secondes après l’impact. Immédiatement après que l’une ou l’autre charge a été enlevée, incubez le spécimen dans 60 iodure de propridium de molaire fraîchement préparée dans un millilitre de HBSS. Pendant cinq minutes à température ambiante, puis re-image des chondrocytes articulaires par microscopie de fluorescence comme vient de le démontrer.

Pour quantifier la zone des cellules blessées et mortes en raison du régime de chargement mécanique appliqué, ouvrez d’abord les micrographes de la surface articulaire acquise avant et après l’application de la charge mécanique dans ImageJ. Combinez les images dans une pile. Définissez l’échelle des images en fonction de la résolution de l’image.

Ensuite, définissez la zone où les cellules sont devenues négatives calcéine et PI positif. Ces cellules sont considérées comme blessées ou mortes. Déterminez ensuite la zone des cellules mortes blessées à l’aide de l’outil de mesure.

Au moins six tests ont appliqué les protocoles de chargement reproductiblement induits des zones localisées quantifiables de lésions cellulaires dans les cartilages fémoraux et humérals obtenus à partir de souris valvules C âgées de huit à dix semaines. Dans tous les protocoles de chargement testés, des magnitudes de charge plus élevées et des intensités d’impact plus élevées ont considérablement exacerbé l’étendue spaciale des lésions cellulaires chez les fémurs et les humeri. Lors de l’exécution des dissections, il est important de se rappeler de ne pas contacter le cartilage articulaire avec les outils chirurgicaux, car cela peut compromettre la ligne de base par la capacité des spécimens.

L’utilisation de ce modèle miroir peut faciliter la recherche sur l’arthrose, car la maladie est facilement induite chez la souris par des manipulations génétiques, diététiques ou chirurgicales. Notre plateforme fournit également un outil pour interroger les questions scientifiques fondamentales et pour le dépistage des interventions thérapeutiques ciblant la vulnérabilité mécanique des chondrocytes.