Name: Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des cellules bursales primaires de poulet pour étudier la pathogenèse du virus de la bursite infectieuse (IBDV) ex vivo. Cette méthode réduit l'utilisation animale et améliore la viabilité cellulaire avec le ligand CD40.

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Les auteurs tiennent à remercier l’équipe des Services de l’Animal à l’Institut de Pirbright pour leur expertise dans l’éclosion, l’élevage et abattage des oiseaux et l’expertise de Caroline Holt dans aseptiquement supprimant la bourse de Fabricius. A.B. est financé par le biais de la biotechnologie et Biological Sciences Research Council (BBSRC) via accorde BBS/E/I/00001845, K.D. est financé par le BBSRC via stagiaire BBS/E/I/00002115, et A.A. est financé par le Centre National pour la Remplacement, de raffinement et de réduction des animaux en recherche (NC3Rs) via accordent NC/R001138/1.

Toutes les procédures avec les animaux doivent être éthiquement approuvés à l’avance. Dans notre institution, toutes les procédures sont effectuées conformément à la loi animale UK (procédures scientifiques) 1986 sous licences création du ministère de l’intérieur, de personnels et de projet, après l’approbation de l’interne le bien-être Animal et éthique Review Board (AWERB).
1. préparation du chCD40L
<ol><li>Cellules en culture HEK 293-msCD8-CD40L stablement exprimant un chCD40L soluble construire dans 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné avec 10 % inactivés par la chaleur (Salut), sérum de veau foetal (FCS) et 1 µg/mL la puromycine à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5 % CO 2. Remarque : Ces cellules sont disponibles auprès de l’Institut de Pirbright après la signature de l’accord de transfert de matériel approprié.</li>
	<li>Fractionner les cellules à une densité de 1:5 lorsque confluentes. Recueillir le liquide surnageant (contenant la construction de chCD40L soluble) chaque fois que les cellules se divisent, il centrifuger à 400 x g pendant 5 min supprimer les débris cellulaires et conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Lorsque 500 mL du surnageant ont été collecté, le liquide de piscine et filtre-stériliser il à travers un 0,2 µm.</li>
	<li>Concentrer le surnageant à l’aide de concentrateurs centrifuges de protéine avec un seuil de poids moléculaire de 10 K selon les instructions du fabricant. Extraire le surnageant concentré de chaque colonne, mettre en commun et filtre-stériliser en la faisant passer à travers un filtre de seringue de 0,22 µm.</li>
	<li>Déterminer la concentration finale pour être utilisé dans des expériences de dilution en série de la solution de chCD40L dans 1 x Iscove modifié de Dulbecco moyen (IMDM) (décrit dans étape 2.4) et culture primaire de cellules bursite en présence des dilutions. Déterminer le nombre et le pourcentage la viabilité des cellules par jour pendant une semaine. NOTE : La plus faible concentration où la prolifération cellulaire et la viabilité sont adéquats est la concentration à utiliser lors de l’essai. Il s’agit probablement de 01:20 à 01:50.</li>
</ol>2. préparation des Solutions pour l’Isolation de cellules bursite primaire de poulet
<ol><li>Préparer 1 x solution saline équilibrée de Hanks (HBBS) avec le calcium (Ca) en ajoutant 10 mL de 10 x HBBS avec Ca à 90 mL stérile H2O et 0,47 µL de 7,5 % NaHCO3.</li>
	<li>Préparer la collagénase D solution à 8 mg/mL en 1 x HBBS avec filtre Ca.-stériliser la solution à travers un filtre de 0,2 µM. Remarque : Il est conseillé de préparer des aliquotes de 5 mL et congeler à-20 ° C.</li>
	<li>Préparer 1 x RPMI milieu additionné 5 % Salut FCS. Stocker les médias à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer 1 x 500 mL de IMDM additionné de 8 % Salut FCS, 2 % Salut poulet sérum, β-mercaptoéthanol de 50 mM, 50 µL de l’insuline-transferrine-sélénite de sodium et 1 % la pénicilline/streptomycine. Stocker les médias à 4 ° C. NOTE : Préparer toutes les solutions mentionnées ci-dessus à l’avance.</li>
	<li>Préparer 1 x HBBS avec Ca. Store la solution sur la glace.</li>
	<li>Préparer 1 x HBBS sans Ca en ajoutant 10 mL de 10 x HBBS sans Ca à 90 mL stérile H2O, 0,47 µL de 7,5 % NaHCO3et l’EDTA à une concentration finale de 10 mM. Conserver la solution sur la glace.</li>
	<li>Préparer 1 x collagénase D solution en ajoutant 5 mL de solution mère de collagénase D à 13 mL de HBBS avec Ca pour faire un total de 18 mL. Conserver la solution sur la glace. NOTE : Préparer les solutions mentionnées en étapes 2,5 – 2,7 le jour de l’expérience.</li>
</ol>3. suppression de la bourse de Fabricius (BF)
<ol><li>Arrière et la trappe de poulets dans un établissement approprié, approuvé et humainement leur abattage à 2 – 3 semaines d’âge. Remarque : Utilisez les méthodes approuvées par l’Institut pour l’abattage.</li>
	<li>
Recueillir le BF de chaque poulet stérilement. Remarque : Utilisez les protocoles en place dans l’établissement.<ol>
<li>Placez la carcasse en décubitus dorsal et stériliser la peau et les plumes recouvrant l’abdomen et le thorax avec une solution d’éthanol à 70 %, dilué dans l’eau.</li>
		<li>Faire une incision médiane ventrale dans le bas ventre à l’aide d’un scalpel stérilisé ou des ciseaux.</li>
		<li>Localiser la bourse de Fabricius, qui est relié à la partie caudale du côlon, crânienne pour le cloaque.</li>
		<li>À l’aide de forceps stérilisé et ciseaux, couper la bourse de Fabricius libre du colon. Veiller à ne pas perforer l’intestin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer l’orgue au froid PBS et transférez-le au laboratoire sur la glace. Remarque : les cellules primaires devraient être isolés dès que possible après la récolte de l’orgue.</li>
</ol>4. isolement de cellules primaires bursite de poulet
<ol><li>Travailler dans un poste de sécurité microbiologique, laver le BF au moins 3 x dans 30 mL de PBS froid.</li>
	<li>Transférer le tissu dans une boîte de Pétri (92 mm de diamètre, 21 mm en hauteur) et ajouter 5 mL de solution de collagénase D 1 x.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux stériles ou une lame de bistouri Swann-Morton, couper la BF en morceaux de moins de 5 mm de diamètre.</li>
	<li>Incuber le tissu à 37 ° C avec agitation douce périodique pendant 30 min. Remarque : La solution de collagènase commence à digérer le tissu.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, aspirer à plusieurs reprises le mélange afin d’encourager la désintégration du tissu. Si nécessaire, couper le tissu en petits morceaux.</li>
	<li>Ajouter un autre 5 mL de solution de D 1 x collagénase au tissu et il incuber à 37 ° C avec agitation douce périodique pendant 30 min.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.6 et 4.7 jusqu'à ce que le tissu est complètement digéré. Remarque : Il y aura de petits granules qui ne se dissolvent pas davantage.</li>
	<li>Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 100 µm dans 20 mL de 1 x HBBS sans Ca.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de 1 x RPMI avec 5 % FCS.</li>
	<li>10 mL de la suspension cellulaire sur le dessus de 5 mL de média de gradient de densité contenant du sodium et polysucrose diatrizoate de superposition ou sous-couche 5 mL de média gradient de densité sous la suspension cellulaire de 10 mL. Ce qu'il y a une interface claire entre les deux.</li>
	<li>Centrifuger la superposition à 900 x g pendant 20 min à 4 ° C. Réduire ou supprimer la pause de la centrifugeuse. Remarque : Les cellules devraient former un groupe à l’interface entre les médias de la cellule et les médias de gradient de densité.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, enlever les cellules et placez-les dans du PBS froid. Laver les cellules 3 x par centrifugation eux à 400 x g pendant 5 min et les resuspendant dans du PBS froid.</li>
</ol>5. culture de cellules primaires bursite de poulet
<ol><li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min et les remettre en suspension dans 1 x IMDM complet.</li>
	<li>Prélever une partie aliquote de la suspension cellulaire, ajoutez-le à une solution de bleu de Trypan et compter le nombre de cellules viables qui excluent le bleu de Trypan. Déterminer le nombre de cellules et le pourcentage de viabilité.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min et il resuspendre dans complet IMDM additionné d’un 01:20 dilution de poulet CD40L à une densité de 1 x 107 cellules/mL. Titrer le surnageant concentré contenant le chCD40L pour déterminer la dilution optimale, qui sont susceptible de se trouver dans la gamme de 01:10 à 01:50.</li>
	<li>La culture des cellules dans deux plaques de 24 ou 96 puits à 37 ° C pour les plaques à 96 puits à fond U 48 – 72 h sont préférables aux plaques à fond plat. Remarque : Les cellules peuvent également être cultivées à 40 ° C</li>
</ol>6. l’infection de cellules primaires bursite poulet IBDV
<ol><li>isolement après 48 à 72 h, décongeler une partie aliquote du virus, vortex l’échantillon et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules primaires de bursite, prendre un 10 µL aliquote de la suspension cellulaire, ajoutez-le à 10 µL d’une solution de bleu de Trypan et déterminer le nombre de cellules et de pourcentage de viabilité.</li>
	<li>Diluer le virus dans 1 x IMDM complète à la multiplicité appropriée d’infection (MOI) pour faire le virus inoculum et vortex.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules de l’inoculum de virus.</li>
	<li>Incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 1 h avec agitation périodique.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min, retirez l’inoculum de virus et laver les cellules en 1 x support de IMDM complet.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans les médias IMDM complets additionnés de poulet CD40L à une densité de 1 x 107 cellules / mL.</li>
	<li>La culture de cellules de deux plaques de 24 ou 96 puits à 37 ° C. Remarque : Les cellules peuvent également être cultivées à 40 ° C</li>
</ol>7. quantification des IBDV réplication dans les cellules bursite primaire de poulet
<ol><li>La désirée-point dans le temps après l’infection, remettre les cellules en suspension, transférez-les sur un tube approprié, les centrifuger à 400 x g pendant 5 min et récolter le surnageant pour le titrage de virus par un essai de plaque ou sur test de TCID50 selon le Reed-Muench méthode15.</li>
	<li>Laver les cellules dans 1 mL de PBS et préparez-les pour l’immunomarquage avec un anticorps spécifique à IBDV, ou extraire l’ARN utilisant un kit approprié (suivant les instructions du fabricant) et exécuter chaîne de polymérase quantitative de transcription inverse réaction (RT-qPCR) en utilisant des amorces spécifiques pour un gène IBDV (avancer, GAGGTGGCCGACCTCAACT ; Revers, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Cultures de cellules infectées par le Mock devraient servir d’un contrôle.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous décrire la culture réussie de poulet des cellules primaires de bursite ex vivo en présence de chCD40L soluble et démontrer que ces cellules peuvent prendre en charge la réplication d’une souche atténuée et une souche très virulente de IBDV. Ce modèle ex vivo peut être utilisé pour déterminer la façon dont les cellules réagissent à une IBDV infection13, qui a des avantages distincts sur des études in vivo et in vitro .
Lorsqu’ils pêchent la BF, il est essentiel de ne pas perforer l’intestin afin d’éviter la contamination bactérienne de cellules isolées des bursite. En outre, il est important d’isoler les cellules primaires dès que possible après la récolte de l’orgue pour limiter la mort cellulaire. La nécessité d’utiliser des chCD40L est une limitation de la technique ; Toutefois, les travaux menés par Soubies et coll. montre que l’utilisation de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour prolonger la viabilité cellulaire bursite au lieu de chCD40L14 peut activer le modèle à adopter par un plus grand nombre de laboratoires. Le protocole décrit ci-dessus détermine la concentration optimale de chCD40L empiriquement, en cultivant des cellules de B primaires dans des concentrations en série diluées de la molécule et observation la prolifération cellulaire et la viabilité. Une modification éventuelle du protocole pourrait être de purifier la molécule de chCD40L et d’ajouter une concentration spécifique pour les milieux de culture cellulaire afin d’éviter la variabilité à lot.
Des études in vivo ont montré que l’infection IBDV suivante, qu'il y a une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans des cytokines pro-inflammatoires, les réponses de Type I IFN et l’apoptose dans le BF5,9,10 . Cependant, suite à une infection, il y a un afflux de cellules inflammatoires et des cellules effectrices T dans le BF, qui diffèrent dans les gènes qu’ils expriment par rapport à la population de cellules B infectées9. Par conséquent, il est difficile à interpréter comment infecté les cellules réagissent à IBDV. Pour y remédier, certains groupes de chercheurs ont caractérisé la réponse transcriptionnelle de cellules infectées par IBDV dans culture16,17,18,19,20. Ces études in vitro ont l’avantage de month bien définis et -points dans le temps après l’infection. Toutefois, des études in vitro ont généralement été caractérisés dans des fibroblastes cellules16,17,20 ou cellules dendritiques18. Tout en donnant un aperçu des interactions cellule-IBDV hôte, la croyance actuelle est que l’infection des cellules B est cruciale à la pathogenèse de la IBDV et, par conséquent, la pertinence des données ne peut pas être overinterpreted. Avant notre ex vivo bursite modèle de culture cellulaire, une seule étude a qualifié la réaction cellulaire des cellules B à IBDV infection19; Cependant, cette étude a utilisé une lignée de cellules de B immortalisées qui a été transformée en raison de l’infection par ALV, limitant les conclusions qui pourraient être apportées. En revanche, le modèle ex vivo de l’infection IBDV décrite ici permet aux chercheurs de conserver les avantages des études in vitro , tels que définis month et points dans le temps, tout en étudiant les interactions du virus avec la cellule hôte pertinentes. Comme les cellules primaires de bursite sont obtenus à partir des tissus sains de BF, il n’y a aucun inflammatoire ou cellules T présentes et nous avons démontré par cytométrie en flux (en utilisant les conditions standard) qui, après la stimulation chCD40L, 97 % de la population cellulaire est positif pour le marqueur de cellules B Bu-1 (données non présentées). Étant donné que 3 % des cellules sont Bu-1 négatif, il sera intéressant de déterminer si ces cellules deviennent infectées avec IBDV et explorent leur expression des gènes et leur contribution à la pathogénèse.
Nous prévoyons que le modèle de culture cellulaire bursite primaire ex vivo poulet peut aussi être étendu afin d’étudier les interactions virus-cellules hôte d’autres virus tropiques de B-cellule infectant les poulets, comme ALV ou REV et pourrait également être étendu aux autres espèces aviaires ( par exemple, des canards ou dindes). La capacité à la culture des cellules primaires de bursite ex vivo aussi ouvre la possibilité d’étudier divers aspects de la pathogénie et l’immunosuppression provoquée par ces virus sans avoir besoin d’infecter les oiseaux. Des études in vivo provoquer une morbidité importante, cela aura un impact considérable sur le remplacement, le raffinement et la réduction de l’utilisation des animaux dans la recherche.
En résumé, l’ex vivo poulet primaire bursite modèle de culture cellulaire décrit ici a le potentiel pour approfondir la connaissance de B-cellule comment aviaire virus tropiques interagissent avec les cellules de l’hôte tout en réduisant le nombre d’oiseaux utilisés dans in vivo études d’infection. Les techniques peuvent s’appliquer à plusieurs organes lymphoïdes, plusieurs virus et, éventuellement, plusieurs espèces d’oiseaux, ce qui en fait un modèle attrayant qui peut contribuer aux champs de virologie et d’immunologie aviaires.

L’industrie avicole mondiale est essentielle pour garantir suffisamment de nourriture pour une population humaine en expansion. Toutefois, l’immunosuppression est la menace à la sécurité alimentaire et le bien-être des oiseaux touchés et représente un défi économique majeur à l’industrie. La majorité des cas d’immunosuppression chez les poulets est causée par l’infection avec le virus immunosuppresseurs, avec les plus responsables de l’immunité acquise ayant un tropisme pour de lymphocytes T et B1une atteinte. Chez les oiseaux, la majorité des cellules B est située dans un organe appelé la bourse de Fabricius (BF). Les cellules B sont susceptibles d’être infectées par plusieurs virus immunosuppresseurs, y compris ceux qui provoquent la lyse, comme le virus de la maladie IBDV et de Marek (MDV) et ceux qui causent la transformation, telles que les virus de la leucose aviaire (ALV) et (Réticuloendothéliose) virus REV).
Afin de développer les meilleures stratégies pour contrôler ces infections, il est essentiel pour caractériser l’interaction des virus avec des cellules de poulet B. Toutefois, lorsque les cellules B sont supprimés d’un oiseau, ils ne survivent pas bien l’ex vivo culture2, rendant difficile d’effectuer une analyse approfondie des interactions entre les IBDV avec des cellules de poulet B, ou les événements tôt après l’infection ALV ou REV. En conséquence, beaucoup d’interactions virus-cellules hôte ont été étudiés en vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Bien que ces études sont informatifs, ils impliquent l’utilisation d’oiseaux infectés qui souffrent de maladies qui peuvent être graves.
Le ligand de CD40 est une molécule qui induit la prolifération de lymphocytes B11. Après identification de la poule de codage de gène CD40L (chCD40L), une protéine de fusion soluble a été conçue que, lorsqu’on ajoute les milieux de culture, induit la prolifération de poulet primaire B cellules ex vivo12. En 2015, les cellules B cultivées de cette façon ont été trouvés pour soutenir la réplication de MDV2 et en 2017, nous et autres découvre que des cellules primaires de bursite stimulées avec chCD40L peuvent être utilisés comme modèle pour étudier IBDV réplication13,14. Ici, nous décrivons l’isolement et de culture de cellules primaires bursite de poulet, l’infection des cellules avec IBDV et la quantification de la réplication virale. Bien que nous décrire la méthode dans le contexte de la BF, cela pourrait s’appliquer aux cellules de souche et de la culture de différents organes lymphoïdes.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco par Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>inactivé à 56 &deg ; C pendant 1 h</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de puromycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtre jetable stérile à débit rapide avec membrane PES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur de protéines Pierce PES (10K MWCO, 20 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88528</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Millex-GP Filtre à seringue</td><td>Merck</td><td>F7648</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hanks (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td><td>gibco de Life Technologies</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBBS) - CaCl22 - MgCl2</td><td>gibco de Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Éthylènediaminetétraacétique solution acide (EDTA)</td><td>Merck</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td><td>gibco de Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de poulet</td><td>Merck</td><td>C5405-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol 50 mM</td><td>gibco de Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-transfertrine-sodium-sélénite</td><td>gibco de Life Technologies</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; m Filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Merck</td><td>10831-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>163320</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated TC-treatment Multiwell Cell Culture Plate, avec couvercle, Corning</td><td></td> <td>stérile</td><td></td>353047</tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de culture primaire de cellules bursite de poulet ex vivo pour étudier la bursite infectieuse virus pathogenèse

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Virus de la bursite infectieuse (IBDV) est un virus d’importance économique pour l’industrie de la volaille. Le virus infecte les lymphocytes B, causant de la morbidité, la mortalité et l’immunosuppression chez les oiseaux infectés. Dans cette étude, nous décrivons l’isolement de cellules bursite primaires de poulet de la bourse de Fabricius, la culture et l’infection des cellules avec IBDV et la quantification de la réplication virale. L’ajout du ligand CD40 poulet a augmenté significativement la prolifération cellulaire quatre fois plus de six jours de culture et de la viabilité cellulaire nettement améliorée. Deux souches de IBDV, une culture cellulaire adapté de souche, D78 et une souche très virulente, UK661, reproduit bien dans les cultures de cellules ex vivo . Ce modèle sera d’utilité pour déterminer comment les cellules répondent à l’infection IBDV et permettront une réduction du nombre d’oiseaux infectés utilisés dans les études de pathogenèse IBDV. Le modèle peut également être étendu aux autres virus et pourrait être appliqué à différentes espèces d’oiseaux.

Poulet des cellules primaires bursite peuvent être cultivées en présence de poulet CD40L
Lorsque les cellules bursite primaire poulet ont été cultivées en présence de chCD40L soluble, le nombre de cellules a quadruplé de 9,02 x 105 à 3,63 x 106 / mL sur une période de 6 jours, contrairement à quand il était absent (p &lt; 0,05) ( Figure 1 a). La viabilité cellulaire a été également significativement améliorée, par exemple de 25 % à la culture après jour 3 en l’absence de chCD40L à 48 % en présence de chCD40L (p &lt; 0,05) (Figure 1 b)13.
Poulet des cellules primaires bursite peuvent prendre en charge la réplication de ces deux cultures cellulaires adaptés et les souches très virulentes de IBDV
Cultures de cellules infectées par le Mock et infectés ont été fixés à 18 h postinfection, étiquetée avec un anticorps monoclonal contre IBDV VP2 et un anticorps secondaire conjugué à l’Alexa Fluor 488 et Eosine au DAPI. Les cellules infectées présentaient des signes d’une fluorescence verte autour du noyau (Figure 2 a), compatible avec la présence de IBDV dans le cytoplasme. C’était évident pour les deux souches de IBDV, une culture de cellules souche, D78 et une souche très virulente, UK661 adaptés (Figure 2 a). À 5, 18, 24 et 48 h après l’infection, l’ARN a été extraite de cultures infectées et soumis à la RT-qPCR avec des amorces spécifiques à une région conservée du gène IBDV VP4. L’expression de VP4 a été tout d’abord normalisée au gène ménager TBP et puis exprimée en variation de pli par rapport aux échantillons simulés dans une analyse ΔΔCt. L’expression IBDV VP4 augmentée à 16 603 exemplaires 48 h après l’infection avec D78 et 38 632 exemplaires 48 h après l’infection avec UK661. Pris ensemble, ces résultats démontrent que les cellules primaires bursite de poulet pourraient soutenir la réplication des cellules-culture-adaptées et très virulente de souches IBDV13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Figure 1 : cellules bursite primaires de poulet peuvent être cultivées en présence de poulet CD40L. Poulet primaire bursite cellules sont cultivées en présence ou en absence de chCD40L (black barres et barres blanches, respectivement). (A) le nombre de cellules vivantes et (B) le pourcentage de cellules viables ont été déterminées à la fois-points indiqués après l’infection. Les données présentées sont représentatifs au moins trois expériences répétées, les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne et la signification statistique a été déterminée à l’aide d' une paire de l’étudiant t-test à chaque moment, * p &lt; 0,05. ce chiffre a été modifié avec la permission de Dulwich et al. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Figure 2 : cellules bursite primaires de poulet peuvent prendre en charge la réplication des fois culture cellulaire adaptée et des souches très virulentes de IBDV. (A) cellules bursite primaires de poulet ont été infectés par le simulacre ou infectés avec D78 ou UK661 et un échantillon de chaque culture a été fixé, étiqueté et imagé : IBDV VP2, vert ; noyaux, bleus. Echelle = 7 µm. (B) l’ARN a été extrait le temps-points indiqués après l’infection, revers-transcription de l’acte, et une région conservée du gène IBDV VP4 a été amplifiée par PCR quantitative. Le pli de10 Journal modification VP4 nombre de copies a été normalisée pour le gène de ménage TBP et calculée par rapport aux échantillons infectés par le mock selon la méthodeΔΔCT –2. Les données présentées sont représentatifs au moins trois expériences répétées, et les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Dulwich et al. 13.

Ici, nous décrivons l’isolement de cellules bursite primaires de poulet de la bourse de Fabricius, la culture et l’infection des cellules par le virus de la bursite infectieuse et la quantification de la réplication virale.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie aviaire, telles que la façon dont les virus immunosuppresseurs interagissent avec les cellules B. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont plus pertinentes que les lignées cellulaires immortalisées actuellement utilisées en laboratoire. Bien que cette méthode donne un aperçu de la façon dont les cellules de poulet réagissent à l’IBDV, elle peut également être appliquée à ALV et REV.Cette méthode réduit le nombre d’oiseaux dans notre recherche, et il est bénéfique pour les trois R, qui signifie le remplacement, la réduction et le raffinement de l’utilisation de l’animal dans la recherche. Dans une armoire de sécurité microbiologique, laver le BF en 30 millilitres de PBS froid au moins trois fois. Transférer le tissu lavé dans une boîte de Pétri et ajouter cinq millilitres d’une solution 1X collagène D.Utilisez des ciseaux stériles ou une lame de scalpel pour couper le BF en morceaux de moins de cinq millimètres de diamètre. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation périodique douce pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une pipette pasteur stérile pour aspirer à plusieurs reprises le mélange pour encourager la désintégration du tissu.Ajouter un autre cinq millilitres de 1X collagène D solution au tissu, et l’incuber à 37 degrés Celsius avec agitation périodique douce pendant encore 30 minutes. Répétez ce processus, en aspirant le mélange, en ajoutant la solution fraîche de collagène D, et en couveant jusqu’à ce que le tissu soit complètement digéré. Notez qu’il y aura de petits granules qui ne se dissoudront pas davantage.Passez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire de 100 microns en 20 millilitres de 1X HBBS sans calcium. Centrifugeuse à 400 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant, resuspendre la pastille en 10 millilitres de 1X RPMI avec 5%FBS.Ensuite, superposer 10 millilitres de la suspension cellulaire sur le dessus de cinq millilitres de densité gradient de médias qui contient du polysucrose et du diatrizoate de sodium. Assurez-vous qu’il existe une interface claire entre les deux couches. Centrifugeuse à 900 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Les cellules doivent former une bande à l’interface entre le média cellulaire et les supports de gradient de densité. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur stérile pour enlever les cellules et les transférer dans un tube contenant du PBS froid. Lavez les cellules en les centrifugant à 400 fois g pendant cinq minutes, puis en les réutilisant dans du PBS froid.Répétez ce lavage trois fois. Tout d’abord, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en 30 millilitres de 1X IMDM complet.Prenez un aliquot de la suspension cellulaire, et l’ajouter à une solution bleue Trypan. Comptez le nombre de cellules viables qui excluent le bleu Trypan et déterminez le nombre de cellules et la viabilité en pourcentage. Après cela, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes.Resuspendre les cellules dans imdm complet complété par une dilution d’un à 20 de poulet CD40 ligand à une densité de 10 millions de cellules par millilitre. Culture des cellules en plaques de 96 ou 24 puits pendant 48 à 72 heures. 48 à 72 heures après l’isolement, décongeler un aliquot du virus.Vortex l’échantillon, et le stocker sur la glace. Resuspendez les cellules de bourses primaires dans le milieu IMDM. Prenez un aliquot de 10 microlitres de la suspension cellulaire, et ajoutez-le à 10 microlitres d’une solution bleue Trypan.Ensuite, déterminez le nombre de cellules et la viabilité en pourcentage. Diluer le virus en 1X imdm complet à la multiplicité appropriée de l’infection pour rendre le virus inoculum. Mélanger cette dilution par vortex.Centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supernatant, et resuspendez les cellules dans l’inoculum de virus. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure avec agitation périodique.Après cela, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Enlevez l’inoculum de virus, et lavez les cellules dans 1X médias complets d’IMDM. Culture des cellules dans des plaques de 96 ou 24 puits.Dans cette étude, les cellules primaires de bursal de poulet sont successivement cultivés ex vivo en présence du ligand soluble de CD40 de poulet. Les cellules cultivés en présence de poulet soluble CD40 ligand sont vus pour augmenter de quatre fois de 902.000 à 3,63 millions par millilitre sur une période de six jours. La viabilité cellulaire est également considérablement améliorée en présence de poulet CD40 ligand.Dans les images représentatives de microscopie confoccale, les cellules infectées sont considérées comme ayant une fluorescence verte autour du noyau, ce qui est compatible avec la présence d’IBDV dans le cytoplasme. Ceci est évident pour deux souches d’IBDV, une souche adaptée à la culture cellulaire, D78, et une souche très virulente, UK661. L’ARN est ensuite extrait à cinq, 18, 24 et 48 heures après l’infection et soumis à rt-qPCR avec des amorces spécifiques à une région conservée du gène IBDV VP4.IBDV VP4 expression est vu pour augmenter à 16,603 exemplaires à 48 heures après l’infection avec D78 et à 38, 632 exemplaires à 48 heures postinfection avec UK661. Ces données démontrent que les cellules primaires de bursal de poulet peuvent soutenir la réplication des souches d’IBDV adaptées à la culture cellulaire et très virulentes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme rt-qPCR, microarray, ou ARN-Seq peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la façon dont les cellules réagissent à l’infection.Nous avons comparé la façon dont les cellules réagissent à l’infection par une souche atténuée et une souche très virulente de L’IBDV et notre étude actuelle de la façon dont elles réagissent à d’autres infections virales. La capacité de culture de ces cellules nous permet d’étudier des aspects de la pathogénie virale et de l’immunosuppression sans avoir besoin d’infecter les oiseaux. Cela aura un impact substantiel sur les trois R, le remplacement, le raffinement et la réduction de l’utilisation des animaux dans la recherche.

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