Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

La mesure des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales peut retracer la réponse du cerveau aux changements à long terme tels que se produisent pendant le développement et la neuroplasticité. Notre méthode a les avantages que les mesures sont entièrement quantitatives, et elles sont faites dans l’animal éveillé se comportant. La technique autoradiographique quantitative permet des mesures dans toutes les régions du cerveau simultanément.

Anita Torossian, boursier post-baccalauréat dans mon laboratoire, et Tianjian Huang, notre chirurgien animalier, démontreront l’intervention. Commencez cette procédure par la préparation à la chirurgie telle que détaillée dans le protocole de texte. Une fois sur le stade de la chirurgie, utiliser des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision d’un centimètre de la partie médiane supérieure de la cuisse gauche rostrally vers la ligne médiane révélant l’artère fémorale et la veine.

Rétractez la peau lâche avec des crochets chirurgicaux de peau au-dessus et de chaque côté de l’incision. Sécurisez les crochets de la peau en les scotchant à l’étape de la chirurgie. Appliquer du chlorure stérile de sodium de 0,9 % sur la zone exposée pour maintenir une humidité adéquate.

Utilisez des forceps pour émousser la dissect, séparant le tissu conjonctif autour d’une petite section de l’artère fémorale et de la veine. Séparer soigneusement l’artère et la veine. Maintenant, utilisez des forceps pour enfiler un brin de suture absorbable sous la veine fémorale et l’artère au point le plus latéral de l’incision.

Tirez la suture à mi-chemin afin que les extrémités soient même. À un point plus proximal de l’aine, utilisez des forceps pour enfiler une deuxième suture sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un demi-nœud qui sera utilisé pour limiter la circulation sanguine.

À un point entre le brin A et le brin B, utilisez des forceps pour enfiler une troisième suture sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un nœud complet qui sera utilisé pour limiter le flux sanguin. Veillez à ne pas déchirer la veine.

Tirez doucement sur le brin B pour limiter la circulation sanguine. Utilisez un hémostat pour tirer doucement le brin B pour maintenir la restriction de sang. Maintenant, connectez l’extrémité non coupée du tube PE à une aiguille de calibre 32 et une seringue d’un millimètre remplie de solution saline héparinée.

Rincer le cathéter pour enlever les bulles d’air. Couper un petit trou dans la zone restreinte de la veine fémorale à l’aide de micro ciseaux et insérer soigneusement l’extrémité inclinée du tube PE huit rincé vers le brin B.Une fois inséré, relâchez la tension du brin B et guidez le cathéter plus haut dans la veine. Serrer le brin B autour de la veine contenant le cathéter.

À l’aide du brin C, attacher un nœud supplémentaire autour du cathéter. Assurez-vous que ce nœud ne capture pas l’artère fémorale. Tirez doucement en arrière sur le canon de seringue pour remplir partiellement le tube avec du sang pour s’assurer que le cathéter a été implanté correctement avant d’insérer un cathéter PE 10 dans l’artère fémorale gauche en utilisant la même procédure.

Une fois que la veine fémorale et les cathéters d’artère ont été fixés, attachez le brin A dans un noeud autour des deux cathéters. Après avoir coupé tous les excès de sutures et enlevé les crochets de la peau, rincer le cathéter artélial avec de la solution saline héparinée pour éviter la coagulation. Cautériser les extrémités des deux cathéters pour créer un joint.

Placez la souris en position couchée et faites une petite incision à la base du cou en appliquant salin à la zone exposée. Insérez une tige métallique creuse sous-dermally de l’incision du cou à l’incision fémorale. Serpentez les cathéters à travers la tige creuse et hors de l’incision du cou.

Après avoir enlevé la tige creuse, fermez l’incision fémorale avec la suture suivie de l’analgésie post-chirurgicale. Serpentez les cathéters à travers un tube creux flexible de 30 centimètres pour faire l’attache de ressort avant de suturer le bouton de l’attache de ressort sous la peau suivie de l’analgésie post-chirurgicale. Déplacez la souris dans un récipient cylindrique transparent avec une monture pivotante et un bras pour loger la souris pendant la période de récupération.

Placez un chauffe-mains sous le récipient pour garder la souris au chaud. Assurez-vous que la souris est dans un état physiologique normal au début de l’expérience en prélevant des échantillons tels que détaillés dans le protocole de texte. Pour administrer le traceur par voie intraveineuse, utilisez un connecteur Y avec une seringue tenant le traceur de leucine étiqueté C 14 relié à un bras, et une seringue avec 100 à 200 microlitres de solution saline stérile pour rincer la ligne veineuse reliée à l’autre bras.

Connectez le connecteur Y à la ligne veineuse. Lancez l’étude en commençant simultanément une montre d’arrêt, en injectant le traceur et en recueillant des échantillons de sang artériel. Rincer la ligne veineuse avec de la solution saline immédiatement après l’injection.

Recueillir des échantillons de sang un à sept en continu tout au long des deux premières minutes de l’expérience de la même manière. Après avoir recueilli les sept échantillons, recueillir 30 microlitres de sang de l’espace mort avant chaque échantillon restant. Les échantillons de huit à 14 sont prélevés à trois, cinq, dix, 15, 30, 45 et 60 minutes respectivement.

À un moment donné au cours de l’expérience, traiter trois tubes pour les normes internes contenant de la leucine tritiated et de la norleucine comme détaillé dans le protocole de texte. Pour quantifier les concentrations de leucine plasmatique, utilisez un système HPLC avec une colonne d’échange de cation de sodium et une dérivation post-colonne avec détection orthophthalaldéhyde et flourométrique. La zone sous la courbe de leucine est proportionnelle à la concentration de leucine dans l’échantillon.

Utilisez la comparaison avec les normes pour quantifier les concentrations de leucine dans les échantillons. Utilisez ensuite un compteur de scintillation liquide pour quantifier les désintégrations par minute de tritium et de C 14 dans les échantillons de plasma. Utilisez ces concentrations pour construire la courbe de dégagement de la leucine étiquetée C 14 à partir de la circulation et le cours du temps de son activité spécifique dans le plasma artélial.

À partir du graphique, calculer l’activité intégrée C 14 labellisé leucine spécifique dans le plasma artélial. Pour effectuer une autoradiographie quantitative, préparer des sections cérébrales de 20 microns d’épaisseur. Section du cerveau au moyen d’un cryostat à moins 20 degrés Celsius.

Décongeler les sections de montage sur des glissières enduites de gélatine. Après fixation des diapositives, disposer les diapositives dans une cassette de film à rayons X ainsi qu’un ensemble de normes de méthacrylate méthyle précédemment calibrées C 14. Dans une pièce sombre et sous une lumière sûre, placez un morceau de film à rayons X, côté émulsion vers le bas sur les côtés et les normes.

Sceller la cassette et la placer dans un sac à la fois noir. Développez les films selon les instructions du fabricant. Le développement automatisé de films n’est pas recommandé parce que l’arrière-plan peut être inégal et peut affecter la quantification.

Construire une courbe d’étalonnage de la densité optique par rapport à la concentration du tissu C 14 en fonction des valeurs de densité optique de l’ensemble des normes calibrées sur le film. Adaptent ces données à une équation polynomiale. Une équation polynomiale au deuxième ou au troisième degré s’adapte très bien.

Pour analyser des régions spécifiques du cerveau, localisez la région d’intérêt ou le retour sur investissement en six à huit sections par rapport à un atlas cérébral. Enregistrez la densité optique des pixels dans un retour sur investissement dans toutes les sections. Basé sur la courbe d’étalonnage, calculer la concentration de tissu C 14 dans chaque pixel.

Enfin, calculer les taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales à partir de la concentration moyenne de tissu C 14 dans le roi dans l’intégrale des ratios de concentrations plasmatiques artérielles de leucine non étiquetée et étiquetée parfois t et lamba. La fraction de leucine dans la piscine précurseur tissulaire qui provient du plasma. On y voit des images représentatives d’un animal traité par véhicule par rapport à un animal traité à l’anisomycine, un inhibiteur de la synthèse des protéines.

Les taux de synthèse des protéines sont proportionnels au niveau d’obscurité dans l’image. L’anisomycine réduit considérablement les taux mesurés de synthèse des protéines cérébrales indiquant la spécificité de cette méthode. Ici, les autoradiogrammes numérisés sont montrés à partir d’une souris éveillée se comportant au niveau de l’hippocampe et de l’hypothalamus.

Les régions les plus sombres ont des taux régionaux plus élevés de synthèse des protéines cérébrales. Il est indiqué ici un autoradiogramme numérisé d’une souris de contrôle éveillée se comportant au niveau de l’hippocampe dorsal. Les taux de synthèse des protéines cérébrales sont enduits de couleurs dans les images selon la barre de couleur.

Tout en essayant cette procédure, il est important de s’assurer que les animaux sont dans un état physiologique normal pendant les mesures. Notre méthodologie a déjà démontré la déréglementation de la synthèse des protéines dans les troubles neurodéveloppementaux comme le syndrome de l’X fragile. Il peut également être un marqueur utile pour les changements dégénératifs et des conditions comme la maladie d’Alzheimer.

La méthode de synthèse des protéines peut être utilisée conjointement avec l’histochimie immunitaire en sections alternées pour corréler les changements dans la synthèse des protéines avec les changements régionaux dans des protéines spécifiques. En résumé, la méthode quantitative autoradiographique L-1 C 14 leucine est idéale pour la détermination précise des taux régionaux de synthèse des protéines in vivo. Il offre des avantages considérables en termes de précision et d’applicabilité aux conditions in vivo.