Name: Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Découvrez une méthode in vivo pour évaluer l'intégrité de la barrière sang-testicule chez la souris C57Black/6 en utilisant l'inuline-FITC. Cette technique permet d'étudier les effets des toxines environnementales sur la fertilité masculine.

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Ce travail a été soutenu par le National clé de R & D programme de la Chine (2016YFA0500902), la Fondation National sciences naturelles de Chine (31471228, 31771653), le Jiangsu Science Foundation for Distinguished Young Scholars (BK20150047), sciences naturelles Fondation de la Province du Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) et le programme d’innovation et de la Province du Jiangsu à K.Z.

Toutes les expériences animales effectuées ont été approuvés par le Comité de l’Université médicale de Nanjing. Les souris C57BL/6 mâles ont été détenus dans des conditions contrôlées de photopériode et étaient approvisionnées en nourriture et en eau.
1. les préparatifs
<ol><li>
Capillaires de microinjection
	<ol>
<li>Utilisez les capillaires microinjection avec un diamètre extérieur et intérieur dimeter longueur de 1,0 mm, 0,8 mm et 10,0 cm, respectivement.</li>
		<li>Tirez des capillaires en verre avec un extracteur capillaire (Figure 1 a). Tester et ajuster les paramètres selon la machine extracteur capillaire qui est utilisé.</li>
		<li>Briser les pointes de pipette avec une pince à utiliser pour obtenir des capillaires d’un diamètre de 50 µm à la pointe. Remarque : Les conseils peuvent être trop longues à pénétrer dans le testicule.</li>
		<li>Aiguiser la pointe dans un angle de 30° à l’aide d’un chaflanador d’une micropipette (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Réactifs
	<ol>
<li>Préparer 1 % pentobarbital sodique : dissoudre pentobarbital sodique 100 mg dans 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (étape 2.3.3).</li>
		<li>Préparer 10 mg/mL d’inuline-FITC : dissoudre inuline-FITC 1 mg dans 100 μl de PBS (étape 2.1.6).</li>
		<li>Préparer 4 % paraformaldéhyde : dissoudre paraformaldéhyde (PFA) 4 g dans 100 mL de PBS (étape 2.3.3).</li>
		<li>Préparer 30 % de saccharose : dissoudre 3 g dans 10 mL de PBS (étape 2.3.4) de sucrose.</li>
		<li>Préparer les 0,1 % de chlorure de cadmium : dissoudre 10 mg dans 10 mL de PBS (étape 2.1.1) de chlorure de cadmium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. méthodes
<ol><li>
Préparation de l’anesthésie et presurgery
	<ol>
<li>Peser les souris mâles C57BL/6 8 semaines et calculer la dose nécessaire de CdCl2. Traiter un groupe de souris (n = 3) avec CdCl2 (5 mg/kg de poids corporel, i.p.) pendant 3 jours avant la chirurgie. Traiter un autre groupe de souris mâles de 8 semaines C57BL/6 (n = 3) avec du PBS comme contrôle.</li>
		<li>Opérer dans des conditions aseptiques à l’aide de pinces, aiguilles, ciseaux et seringue stérile.</li>
		<li>Préparer la solution d’anesthésie fraîchement. La dose nécessaire de l’anesthésie est de 70 mg de pentobarbital sodique/kg de poids corporel. En moyenne, une souris C57BL/6 adulte à l’âge de 8 semaines pèse environ 25 g, ce qui correspond à 175 μL de 1 % pentobarbital sodique (1,75 mg / souris). Remarque : Le pentobarbital sodique est dissous dans stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La solution est filtrée par 0.22 um unité de filtration avant d’être utilisé.</li>
		<li>Nettoyez la zone pour la chirurgie avec 75 % d’éthanol et couvre la zone avec une serviette de tissu propre.</li>
		<li>Allumez le chauffage thermostatique et ajuster la température à 37 ° C.</li>
		<li>Préparer la solution de travail inuline-FITC (10 mg/mL) le jour de la chirurgie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intervention chirurgicale
	<ol>
<li>Peser les souris mâles C57BL/6 8 semaines et calculer la dose nécessaire de l’anesthésie.</li>
		<li>Effectuer une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à l’aide de la seringue stérile 1 mL. Maintenez la souris dans une cage propre.</li>
		<li>Observer la réponse réflexe œil et la respiration de la souris pour confirmer qu’il est sous anesthésie complète. Remarque : Généralement, 10-15 min sont nécessaires jusqu'à ce que la souris est profondément anesthésiée, avec une absence totale de réponse de pincement orteil et l’entretien de la respiration lente et régulière.</li>
		<li>Déplacez la souris vers la zone d’opération et couvrir sa zone de le œil avec un papier de soie humide pour éviter la sécheresse pendant l’anesthésie (Figure 2 a).</li>
		<li>Ses cheveux abdominaux vous raser avec un rasoir et désinfecter la zone de chirurgie avec 75 % d’éthanol.</li>
		<li>Avec des ciseaux pointus, faire une incision de 1 cm de peau au-dessus les glandes préputiales pour exposer la paroi abdominale. Soulevez la paroi abdominale à l’aide de petites pinces et pratiquer une incision de 0,5 cm pour exposer la cavité péritonéale (Figure 2 b).</li>
		<li>Utiliser les pinces pour rechercher des coussinets adipeux autour de l’épididyme et les testicules. Retirez soigneusement les coussinets adipeux pour exposer les testicules attachées clairement (Figure 2 et 2D). Ordinairement, pour effet sur un testicule à la fois. Remarque : Ne pas toucher les coussinets adipeux et les testicules avec les mains.</li>
		<li>Placer un papier (9 cm de diamètre) sous les coussinets adipeux et les testicules (Figure 2).</li>
		<li>Injecter une pipette de micro-injection d’inuline-FITC et connectez-le à l’unité micromanipulateur (Figure 1). Doucement, insérer la pipette de micro-injection sous l’albuginée et charger un total de 20 μL d’inuline-FITC dans l’interstitium du testicule (Figure 2E et 2F). NOTE : Enfoncer soigneusement la pipette de micro-injection pour éviter de le déplacer.</li>
		<li>Surveiller les mouvements de l’inuline-FITC dans le testicule (Figure 2).</li>
		<li>Immédiatement remettre les testicules dans la cavité abdominale après l’achèvement de l’injection.</li>
		<li>Répétez la procédure sur le testicule controlatéral. Ce testicule est injecté avec 20 μl de PBS comme un contrôle.</li>
		<li>Fermer la peau avec une suture chirurgicale et déplacez la souris à un pad thermique d’un radiateur thermostatique (Figure 1 b). Administrer une dose de 1 mg d’analgésiques (buprénorphine) par 1 kg de poids corporel par injection sous-cutanée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Récolte les testicules et la préparation des coupes congelées
	<ol>
<li>40 min après l’injection, euthanasier la souris bénéficiaire par dislocation cervicale selon les soins aux animaux et l’utilisation des lignes directrices.</li>
		<li>Utiliser une paire de ciseaux pointus pour recueillir les testicules. Placez les testicules dans 1 mL de PBS glacée pour éliminer toute contamination du sang.</li>
		<li>Difficulté les testicules à la paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 ° C pendant 12 à 24 h. jeter les 4 % PFA et laver le tissu 3 x 1,5 ml de PBS 1 % à la température ambiante.</li>
		<li>Déshydrater le tissu en saccharose 30 % du jour au lendemain. Mettre les testicules dans le cadre d’encastrement et couvrir le tissu avec la température de coupe optimale composé (OCT). Après que l’OPO est gelé, remplir le cadre encastrement avec OCT afin que le testicule entier peut être recouvert d’OCT.</li>
		<li>Couper 5-μm d’épaisseur, gelées les sections efficaces des testicules dans un cryostat à-20 ° C et qu’ils adhèrent aux lames de microscope. Remarque : Regel tissus incorporés dans la glace sèche peut augmenter la rigidité pour la coupe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Demande d’image
	<ol>
<li>Déposer les lames dans une boîte humidifiée. Réchauffer les diapositives à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Laver les sections 3 x avec tampon Tris salin (SCT) à température ambiante.</li>
		<li>Sécher à l’air pendant 5 min dans le noir. Essuyez tout TBS résiduelle avec poussière de papier.</li>
		<li>Couvrir les coupes avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Placer la lamelle inversée sur une lame de microscope.</li>
		<li>Acquisition d’images à l’aide d’un microscope confocal. Un total de 20 X grossissement est généralement suffisant pour détecter le signal brillamment fluorescent.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
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<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La spermatogenèse se déroule dans l’épithélium séminifère et est un processus dynamique et hautement ordonné qui est régi par les cellules germinales et les cellules somatiques (par exemple, les cellules de Sertoli)13. La structure BTB, ce qui est construite par les cellules de Sertoli, divise l’épithélium séminifère en une basale et un compartiment apical. Le développement des cellules germinales méiotiques et haploïdes se produit dans le compartiment apical qui forme une barriè...

La spermatogénèse chez les mammifères est considéré comme un processus hautement structuré qui englobe les spermatogonies autorenouvellement et différenciation par le biais de spermatocytes en spermatozoïdes haploïdes par mitose et méiose spermiogenèse, au cours de laquelle dramatique modifications morphologiques et biochimiques se produisent. Développement des cellules germinales sont progressivement transportés de la base de la tube séminifère vers la lumière. Ce processus est réglé par contacts cellules entre les cellules germinales et les cellules de Sertoli1,2. Les cellules de Sertoli adjacentes forment le BTB qui se trouve près de la base du tube séminifère. BTB divise physiquement l’épithélium en une basale et un compartiment adluminales. Stades VIII - IX du cycle épithélial, preleptotene/leptotène spermatocytes des compartiments basales qui traversent le BTB, entrant dans les compartiments d’adluminales3. Par conséquent, la fonction de BTB est de fournir un microenvironnement immunoprivileged pour l’achèvement de la méiose et la spermiogenèse4,5,6. Contrairement à d’autres obstacles de la sang-tissus (p. ex., barrière hémato - encéphalique) qui sont composées uniquement de jonctions serrées (TJs), le BTB est formé par quatre jonctions différentes (TJs, spécialisations ectoplasmique, jonctions lacunaires et intermédiaire axée sur le filament desmosomes) entre Sertoli, cellules de1,7.
De nombreuses études ont utilisé des souris génétiquement modifiées, infections virales et substances toxiques environnementales pour étudier les mécanismes de BTB intégrité7,8,9. La perturbation de BTB induit une déficience de la spermatogenèse et hypofertilité ou d’infertilité. Depuis la formation de BTB et l’intégrité ont été confirmés d’être affectés par des contacts entre les cellules de Sertoli8, un modèle in vitro basé sur des cultures primaires de cellules de Sertoli isolées a été utilisé pour l’étude BTB. Toutefois, ce modèle ne peut pas imiter avec précision BTB dynamics in vivo. En outre, aucune telle co-culture de cellules germinales avec les cellules de Sertoli n’a été établie comme capables de refléter tous les éléments pertinents de structurelles et fonctionnelles du BTB10,11.
En général, en vivo BTB intégrité tests reposent généralement sur petites molécules, telles que EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine et inuline conjugué FITC (inuline-FITC). Normalement, la diffusion de la biotine ou inuline-FITC du compartiment basal est bloquée par la structure de BTB. Par conséquent, nous sommes en mesure d’utiliser cette méthode pour évaluer l’étendue des dégâts BTB comparée aux groupes témoins. BTB peut être compromise avec certains types de stimulations, telles que le traitement avec cadmium chlorure (CdCl2)12, BTB devient accessible aux petites molécules, qui finit par pénétrer dans le compartiment d’adluminales comme indicateurs.
Un début essai in vivo BTB intégrité avec consiste à injecter de la biotine ou inuline-FITC dans la veine jugulaire, qui implique une chirurgie et est envahissante, compliqué et chronophage. En outre, comme les substances journaliste diffusent à travers tout le corps par l’intermédiaire de la circulation, la concentration locale de biotine ou inuline-FITC dans les tubules séminifères est limitée. En outre, l’exposition systémique peut induire des réactions immunitaires. Nous présentons ici un simple et efficace essai in vivo BTB intégrité avec permettant une injection directe d’une petite aliquote d’inuline-FITC dans l’interstitium d’un testicule. En utilisant la fluorescence méthode d’étiquetage, le processus de coloration est commode, comme anticorps secondaires ne sont pas nécessaires. Ici, le processus de colorant fluorescent entrant dans le testicule est visualisé.

<table><tbody><tr><td>Extracteur capillaire&nbsp ;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (USA)</td><td>SH30258.01</td><td>dilution à 1&times ; in ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope à adhérence</td><td>CITOGLAS (Chine)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de cadmium</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss (Allemagne)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Papier sans poussière</td><td>Kimberly-Clark (États-Unis)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma (États-Unis)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires de micro-injection</td><td>Zhengtianyi (Chine)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm &nbsp ; 0,8 mm &nbsp ; &times ; 100 mm</td></tr><tr><td>Biseauteur de micropipette</td><td>NARISHIGE (JAPON)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPON)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma (États-Unis)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Merck (Allemagne)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir&nbsp ;</td><td>Yashen (Chine)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon (JAPON)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Sangon Biotech (Chine)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Instruments chirurgicaux</td><td>Stronger (Chine)</td><td></td><td>ciseaux, pinces, porte-aiguille</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>KDL (Chine)</td><td>20163150518</td><td>0,45 mm &times ; 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>chauffage thermostatique</td><td>KELL (Nanjing, Chine)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7,6</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (Chine)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech (Chine)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode in vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

La spermatogenèse est le développement de spermatogonies en spermatozoïdes matures dans les tubules séminifères des testicules. Ce processus est soutenu par des jonctions de cellules de Sertoli à la barrière sang-testicule (BTB), qui est la barrière de tissu plus serrée dans l’organisme chez les mammifères et sépare l’épithélium séminifère en deux compartiments, une base et un adluminales. BTB crée un micro-environnement unique pour les cellules germinales de la méiose I / II et pour le développement de post-méiotique spermatides en spermatozoïdes par l’intermédiaire de la spermiogenèse. Nous décrivons ici une méthode fiable pour surveiller l’intégrité BTB de souris testicule in vivo. Un BTB intact bloque la diffusion d’inuline conjugué FITC de la basale au compartiment apical des tubes séminifères. Cette technique est adaptée pour l’étude des candidats de gène, de virus ou des substances toxiques environnementales qui peuvent affecter la fonction BTB ou intégrité, avec une procédure simple et une exigence minimale de compétences chirurgicales par rapport à d’autres méthodes.

Le montage expérimental pour la réalisation de l’essai d’intégrité BTB est illustré à la Figure 1. Tirez et aiguiser les capillaires de microinjection avec un extracteur capillaire et chaflanador d’une micropipette, respectivement (Figure 1 a et 1C). Le radiateur thermostatique Materiel pour microinjection sont illustrées dans la Figure 1 b et 1D.
<p class="jove_...

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’intégrité de barrière de sang-testicule en injectant d’inuline-FITC dans les testicules. Il s’agit d’une méthode efficace in vivo pour étudier l’intégrité de barrière de sang-testicule qui peut être compromise par des éléments génétiques et environnementaux.

Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la barrière de testicules sanguins des champs de biologie sur les candidats génétiques, les virus ou les toxines environnementales qui peuvent affecter la fonction ou l’intégrité de barrière de testicules sanguins. Trois jours avant la chirurgie, traiter au moins trois souris mâles C57Black/6 de huit semaines par jour avec un chlorure de cadmium de poids corporel de cinq milligrammes par kilogramme par injection intraperitoneal. Le jour de la chirurgie, placez un tissu propre sur une zone chirurgicale stérilisée à 75 % d’éthanol et réglez un chauffe-eau thermostatique à 37 degrés Celsius.Placez une souris anesthésiée sur le tissu, puis confirmez un manque de réponse au pincement des pieds. Raser les poils abdominaux avec un rasoir, et désinfecter la peau exposée avec 75% d’éthanol. Faire une incision cutanée d’un centimètre au-dessus des glandes préputiales pour exposer la paroi abdominale, et utiliser de petits forceps pour soulever la peau pour faire une incision de 0,5 centimètre dans le péritoine.Utilisez les forceps pour rechercher des tampons de graisse autour de l’épididyme et des testicules, tirant soigneusement les tampons de graisse dehors pour exposer un testicules attaché. Placez un morceau de papier de neuf centimètres sous les tampons gras et les testicules, et chargez une pipette de microinjection avec la solution inuline-FITC fraîchement préparée. Connectez la pipette à une unité de micromanipulateur, et utilisez un microscope disséquant pour insérer doucement la pointe de pipette de microinjection sous l’albuginea de tunica.Faites pivoter lentement le levier de fonctionnement pour livrer 20 microlitres de l’inuline-FITC dans l’interstitium du testicules. Si la livraison est réussie, les testicules tourneront une couleur vert-jaune vif. Retourner immédiatement les testicules dans la cavité abdominale, et injecter le testicules contralatéraux avec 20 microlitres de PBS, puis fermer la peau avec une suture chirurgicale.Et placez la souris sur le coussin chauffant d’un radiateur thermostatique. 40 minutes après l’injection, utilisez des ciseaux pointus pour recueillir les testicules de chaque souris et lavez les tissus en un millilitre de PBS glacé. Ensuite, fixez les testicules en paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures, suivis de trois lavages en 1,5 millilitres de 1 % de PBS par lavage.Après une déshydratation de 30 % du saccharose pendant la nuit, transférez les échantillons dans des cadres d’intégration individuels et couvrez les tissus d’un composé optimal de température de coupe. Réglez la température d’un cryostat à 20 degrés Celsius négatif et placez les cadres dans le cryostat pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que l’OCT soit gelé. Ensuite, remplissez chaque cadre d’intégration avec oct frais jusqu’à ce que l’ensemble des testicules est couvert dans chaque moule.Lorsque la deuxième couche d’OCT est gelée, acquérir une section transversale de cinq micromètres d’épaisseur de chaque testicules, capturant les sections tissulaires sur des diapositives de microscope en verre au fur et à mesure qu’elles sont obtenues. Pour l’image des échantillons, réchauffez d’abord les glissières dans une boîte humidifiée à température ambiante. Après 10 minutes, laver les glissières trois fois dans une solution saline fraîche tamponnée par lavage et laisser sécher les sections pendant cinq minutes à l’abri de la lumière.Utilisez du papier sans poussière pour enlever toute solution saline résiduelle et montez les échantillons à l’aide d’un support de montage complété par dapi. Ensuite, couvrez chaque échantillon d’un glissement de couverture inversé et imagez les échantillons sous l’objectif 20X d’un microscope confocal. Trois jours de traitement au chlorure de cadmium causent des dommages à la barrière de testicules sanguins permettant la diffusion de l’inuline-FITC du compartiment basal au compartiment apical de l’épithélium séminifère.En revanche, cette diffusion est bloquée dans le contrôle des testicules traités par PBS. L’étendue des dommages causés par la barrière de testicule sanguin est déterminée en calculant le rapport entre la distance de diffusion inuline-FITC et le rayon du même tubule séminifère. En outre, la barrière intacte de blood-testis dans les souris floxed hétérozygous Rictor de KO bloque la diffusion d’inuline à travers la barrière dans le compartiment apical, alors que les souris conditionnelles de KO de Rictor possèdent une barrière compromise de blood-testis qui permet la diffusion d’inuline.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de livrer inulin-FITC préparé le jour de l’expérience et de garder le tissu protégé de la lumière puisque fitc est une molécule sensible à la lumière. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de spermatogenèse altérée parce que la fonction de la barrière de blood-testis est de fournir un microenvironnement immunisé-privilégié pour l’accomplissement de la méiose dans le spermatogenèse. Après son développement, cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la médecine de la reproduction d’explorer la sous-fertilité et l’infertilité chez la souris.N’oubliez pas que le travail avec des paraformaldéhydes peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de vêtements et de masques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

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Biologie du développement

Un<em&gt; In vivo</emTest&gt; Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Ici, nous présentons un protocole eCLIP pour déterminer les principales cibles d’ARN des candidats du RBP dans les testicules.

Méthode améliorée d’Immunopréprécipitation de réticulation (eCLIP) pour l’identification efficace de l’ARN lié aux protéines dans les testicules de souris

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

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Dissection assistée par transillumination d’étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de la souris pour les analyses d’immunostaining en aval

Cet article rapporte une inhibition in vivo de la CENP-E par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295, un modèle précieux pour la division méiotique masculine. En utilisant les tests d’immunofluorescence, de cytométrie en flux et de microscopie électronique à transmission, nous montrons que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et une instabilité du génome dans les spermatocytes de souris.

Évaluation fonctionnelle de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes à l’aide de l’inhibition in vivo , de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux

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In vivo Détection de perméabilité vasculaire dans la glande sous-maxillaire de souris

Dans la présente étude, le dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) est administré à des souris par gavage oral pour évaluer la perméabilité intestinale à la fois in vivo et dans des échantillons plasmatiques et fécaux. Comme la fonction de barrière intestinale est affectée dans de nombreux processus pathologiques, ce test direct et quantitatif peut être utilisé dans divers domaines de recherche.

Évaluation de l’intégrité de la barrière intestinale chez la souris à l’aide de dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate

Découvrez une méthode in vivo pour évaluer l'intégrité de la barrière sang-testicule chez la souris C57Black/6 en utilisant l'inuline-FITC. Cette technique permet d'étudier les effets des toxines environnementales sur la fertilité masculine.

Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

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