Combinant la coloration histochimique et analyse d’images pour quantifier l’amidon dans les primordiums ovaire de cerises douces pendant la dormance hivernale

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la dormance dans la plante ligneuse, comme pourquoi les boutons floraux ont besoin d’accumuler froid pendant l’hiver pour fleurir correctement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la quantification de l’amidon dans de très petits échantillons de primordium floral. Cette approche est très utile pour détecter l’activité physiologique du primordium de fleur pendant la dormance et peut également être appliquée à d’autres espèces d’arbres comme l’abricot ou la prune.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du bourgeon de fleur dormant, elle peut également être appliquée à d’autres processus tels que la phase de reproduction de la pollinisation au début de la fructification. Pour commencer, recueillir cinq pousses sur le terrain. Puis peser et fixer 10 boutons floraux dans un tube de verre de 10 millilitres avec solution fixative pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius.

Après cela, jetez le fixatif et ajoutez suffisamment d’éthanol à 75 % pour couvrir les échantillons. Obtenez trois pousses de 15 à 30 centimètres de longueur et cinq millimètres de diamètre avec 10 boutons floraux chacun. Placez ensuite les pousses sur de la mousse de fleuriste imbibé d’eau dans une chambre de croissance.

Après 10 jours dans la chambre de croissance, retirer les boutons floraux des pousses et les peser. Chaque semaine, du début de l’automne jusqu’au printemps, évaluez la croissance des boutons floraux. Retirez les écailles externes de chaque échantillon, puis placez chaque bourgeon dans le verre d’un horloger contenant 75 % d’éthanol.

Utilisez des forceps de précision et un scalpel ophtalmologique pour disséquer les bourgeons et obtenir au moins un primordium de fleur de chaque bourgeon. Intégrer les échantillons individuellement dans de la cire de paraffine pour former un bloc et les sectionne sur une microtome rotative. Après avoir sectionner les échantillons, appliquer une goutte d’iode frais de Lugol sur une section.

Après cinq minutes, retirer l’excès de tache avec du papier buvard. Appliquez ensuite une petite goutte de supports de montage synthétiques, placez un petit verre de couverture sur l’échantillon et appuyez fort. Une fois que le support de montage est sec, observez la section tachée sous un microscope à champ lumineux.

Ajustez d’abord le diaphragme d’ouverture et le contrôle de luminosité selon le protocole de texte. Ensuite, assurez-vous qu’il n’y a pas de filtres dans le porte-filtre et sélectionnez une condition de champ lumineux dans le microscope. Après cela, réglez les paramètres de la caméra pour la préparation tachée sans tissu.

Fixez la luminosité à 50%Suivant activer la fonction de surexposition / sous-exposition et ajuster le temps d’exposition à la limite de la surexposition. Appliquez la fonction balance des blancs et la correction de l’ombrage. Mesurez le niveau gris de l’image en noir et blanc résultante de la préparation tachée sans tissu.

Appliquez ensuite un filtre 4N, acquérez une autre image en noir et blanc de la préparation et mesurez le niveau gris. Ensuite, acquérir une image de la même préparation sans lumière et mesurer le niveau gris de l’image résultante et étalonner. Après cela, acquérir une image couleur d’une section d’échantillon dans le format TIFF avec une résolution d’au moins 300 dpi.

Créez une image binaire correspondant à la zone tachée, puis définissez les trois seuils de couleur jusqu’à ce que l’image binaire reflète exactement les granules d’amidon tachés. Répétez ce processus avec d’autres préparations et tissus pour affiner les niveaux de détection finaux. À l’aide du système d’analyse d’image, mesurez la somme de la densité optique de chaque pixel sous le masque pour quantifier la teneur en amidon sur le terrain.

Dans ce protocole, la croissance de bourgeon de fleur et le statut de dormance ont été évalués en mesurant l’augmentation du poids de bourgeon après 10 jours dans des conditions appropriées. Pendant la dormance, aucun changement n’a été observé après 10 jours dans des conditions appropriées. Une fois la dormance surmontée, les bourgeons ont gonflé et ont éclaté dans la chambre de croissance.

La teneur en amidon dans le primordium de l’ovaire a été quantifiée par l’analyse d’images dans chaque section microtomed. De façon constante, la quantité d’amidon au début de l’hiver présentait une valeur de densité optique inférieure à 40 000 et la quantité maximale atteignait une valeur comprise entre 120 000 et 140 000 pendant les deux années de l’étude. En tenant compte de la dormance, la quantité maximale d’amidon s’est produite en même temps que l’accomplissement de refroidissement pendant les deux années.

Il est important de se rappeler que les niveaux de détection utilisés par l’analyseur d’images dépendent directement de l’étalonnage du système. Ceci inclut l’état léger, l’intensité de tache, et le grossissement du microscope. Cette condition doit être fixée pour toutes les préparations.

La combinaison des techniques histochimiques avec l’analyse d’image a résulté très utile pour examiner la réserve de hydrate de carbone du primordium de fleur pendant les différentes phases de la dormance. Il peut également être appliqué à d’autres espèces et tissus. La relation entre la libération de dormance et l’accumulation d’amidon dans la primordie des ovaires dévoilée par l’utilisation de cette méthode fournit une base solide pour comprendre la base biologique de la dormance et des exigences de refroidissement.

Les efforts futurs doivent être axés sur l’étude d’indicateurs biologiques fiables qui pourraient facilement indiquer l’état de dormance de l’arbre. Pendant ce temps, le modèle des variations d’amidon le long de la dormance peut être employé pour encadrer d’autres études physiologiques et génétiques.