Name: Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Apprenez l'isolation, la fixation et l'immunofluorescence des glandes surrénales de souris. Cette technique permet d'étudier la zonation surrénale et l'identité cellulaire tout en préservant la morphologie tissulaire.

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Nous remercions le Dr Mohamad Zubair pour ses suggestions utiles et assistance technique dans la mise en place du présent protocole. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases, instituts nationaux de santé recherche Grant 2R01-DK062027 (à Gadio).

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement des glandes surrénales de souris ainsi que de la préparation et la coloration des glandes surrénales de souris de paraffine sectionnés.
Comparé à d’autres protocoles que nous avons testé, ce protocole immunofluorescence s’est avéré convenant à la plupart des anticorps utilisés dans notre laboratoire. Toutefois, dans certains cas, il peut exiger des ajustements pour améliorer les résultats de coloration. Une variable qui peut facilement être modi...

Immunohistochemistry est une technique de détection de composants tissulaires avec l’utilisation d’anticorps dirigés contre des molécules cellulaires spécifiques et des techniques de coloration ultérieures pour détecter les anticorps conjugués1. Cette procédure d’immunohistochemical nécessite une fixation spécifique et traitement des tissus qui sont souvent empiriquement déterminées pour l’antigène spécifique, les tissus et les anticorps utilisés2. La fixation est essentielle préserver l’état « original » du tissu et ainsi maintenir intact cellulaires et des structures subcellulaires et profils d’expression. Plus de traitement et d’incorporation des procédures sont tenus de préparer le tissu pour la coupe en tranches fines qui sont utilisés pour les études histologiques concernant l’immunohistochimie.
Immunomarquage peut être effectuée avec détection chromogénique ou fluorescente. Détection chromogénique nécessite l’utilisation d’une enzyme pour convertir un substrat soluble en un produit coloré insoluble. Alors que cette enzyme peut se conjuguer à l’anticorps reconnaissant l’antigène (anticorps primaire), il est plus souvent conjugué à l’anticorps reconnaissant l’anticorps primaire (c.-à-d., l’anticorps secondaire). Cette technique est très sensible ; le produit coloré résultant de la réaction enzymatique est photostable et nécessite seulement un microscope à fond clair pour l’imagerie. Cependant, immunomarquage chromogène peut ne pas convenir lorsque vous essayez de visualiser deux protéines qui co localiser, étant donné que la déposition d’une couleur peut masquer la déposition de l’autre. Dans le cas des taches, immunofluorescence s’est avéré pour être plus avantageux. L’avènement de l’immunofluorescence est attribuée à Albert Coons et ses collègues, qui a mis au point un système permettant d’identifier les antigènes de tissu avec des anticorps marqués à la fluorescéine et les visualiser dans les tissus sectionnés sous lumière ultraviolette3. Détection de fluorescence est issue d’un anticorps conjugué avec un fluorophore qui émet de la lumière après excitation. Parce qu’il y a plusieurs fluorophores avec des émissions aux longueurs d’onde différentes (avec peu ou pas de chevauchement), cette méthode de détection est idéale pour l’étude des protéines multiples.
La glande surrénale est un organe jumelé situé au-dessus du rein et se caractérise par deux éléments Embryologiquement distinctes, entourés par une capsule mésenchymateuse. Le cortex surrénalien externe, dérivé du mésoderme intermédiaire mésonéphriques, sécrète des hormones stéroïdes alors que la médullaire interne, dérivée de la crête neurale, produit des catécholamines dont l’adrénaline, la noradrénaline et la dopamine. Le cortex surrénalien est histologiquement et fonctionnellement divisé en trois zones concentriques, chaque zone sécrétant des différentes classes d’hormones stéroïdes : la zone extérieure glomérulée (zG) produit des minéralocorticoïdes qui régulent l’homéostasie de l’électrolyte et volume intravasculaire ; le milieu zona fasciculata (zF), directement sous le zG, sécrète des glucocorticoïdes médiateurs de la réponse au stress par la mobilisation des réserves énergétiques pour augmenter le taux de glucose plasmatique ; et les reticularis de zona interne (zR), qui synthétise le sexe précurseurs stéroïdes (c.-à-d., la déhydroépiandrostérone (SDHEA))4.
Certaines variations dans la corticosurrénale zonation sont présente entre les espèces : par exemple, Mus musculus manque le zR. L’unique zone X postnatale de M. musculus est un vestige du cortex foetal caractérisé par des petites cellules pauvres en lipides avec cytoplasmes acidophiles5. La zone X disparaît à la puberté chez les souris mâles et après la première grossesse chez les souris femelles, ou dégénère progressivement dans les femelles de race n’est pas6,7. En outre, la tortuosité et l’épaisseur des pièces zG marqué la variation entre les espèces comme le fait l’Organisation des cellules souches et progénitrices périphériques dans et à côté de la zG. Le rat, à la différence des autres rongeurs, dispose d’une zone visible indifférenciée (zU) entre le zG et zF qui fonctionne comme une zone de cellules souches et/ou une zone transitoire amplifier les progéniteurs. Si la zone d’incertitude est unique à des rats ou simplement plus organisés en évidence amas de cellules sont inconnue8,9.
Les cellules du cortex surrénal contiennent des gouttelettes de lipides qui stockent des esters de cholestérol qui servent comme le précurseur de toutes les hormones stéroïdes10,11.  Le terme « stéroïdogenèse » définit le processus de production des hormones stéroïdes de cholestérol via une série de réactions enzymatiques qui impliquent l’activité du facteur stéroïdogénique 1 (SF1), dont l’expression est un marqueur potentiel stéroïdogènes. Dans la glande surrénale, expression Sf1 est présente uniquement dans les cellules du cortex12. Une étude intéressante a trouvé l’expression de la biotine endogène dans les cellules corticosurrénales avec potentiel stéroïdogène13. Tandis que cela peut être la cause d’une formation supérieure en méthodes de coloration basé/streptavidine-biotine, en raison de la détection de biotine endogène par l’anticorps conjugué avec la Streptavidine, cette caractéristique pourrait être aussi employée pour distinguer le stéroïdogènes cellules des autres populations au sein de la glande surrénale, c.-à-d., endothélial, capsulaire et cellules de la moelle.
Innervé par les neurones préganglionnaires sympathiques, la médullosurrénale est caractérisée par des cellules basophiles avec un cytoplasme granulaire contenant de l’épinéphrine et la norépinéphrine. Cellules de la moelle sont nommés « chromaffines » en raison de la forte teneur des catécholamines qui forment un pigment brun après oxydation14. Tyrosine hydroxylase (TH) est l’enzyme qui catalyse l’étape cinétiquement limitante dans la synthèse des catécholamines et, dans la glande surrénale, s’exprime uniquement dans la médulla15.
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des glandes surrénales de souris, leur traitement pour l’enrobage de paraffine et de sectionnement et une méthode pour exécuter immunofluorescence souillant sur sections surrénales afin d’identifier les types cellulaires qui constituent la cortex surrénal et la moelle. Ce protocole est une norme dans notre laboratoire pour l’immunohistochimie avec des anticorps multiples utilisés couramment dans nos recherches.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 24 puits</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles jetables 25 G x 5/8"</td><td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&nbsp ;</td><td>McCormik scientific</td><td>39502004</td><td>Paraffine pour l’enrobage tissulaire</td></tr><tr><td>Cassettes de biopsie Shandon II avec couvercle attaché</td><td>Thermo scientific</td><td>1001097</td><td>Cassettes pour le traitement</td></tr><tr><td>des tissus Lames microtomes à profil élevé</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>Lames jetables en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Moules d’enrobage de tissus en plastique jetables Peel-a-way</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>Tronquée, carrée de 22 mm en haut effilée à 12 mm en bas</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>200 Proof</td><td>Ethanol Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certi-Pad Compresses de gaze&nbsp ;</td><td>Sécurité certifiée Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3" x 3. Compresses de gaze stériles sans latex</td></tr><tr><td>Kit M.O.M.</td><td>Vector laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>Pour la détection des anticorps primaires de souris sur les tissus</td></tr><tr><td>de souris KimWipes Kimtech</td><td></td><td>34155</td><td>Lingettes 4,4 pouces x 8,4 pouces</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>00-8899</td><td>Stylo pour dessiner sur des lames Verre de</td></tr><tr><td>protection de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>Taille : 22 x 50 x 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp ;</td><td>(Préparé dans une bouteille de 20 mg/mL)</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold</td><td>Sondes moléculaires</td><td>P36930</td><td>Agent de montage pour immunofluorescence</td></tr><tr><td>série X-cite 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>Source lumineuse</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>microtome</td><td>American Optical Tissue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Processeur de tissus&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TH</td><td>de souris Millipore</td><td>MAB318</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Lapin anti-SF1</td><td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td><td>&nbsp ; sur mesure</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Alexa-488 Souris IgG&nbsp ; chèvre élevée</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003&nbsp ;</td><td>Anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Dylight-549 Lapin IgG chèvre élevée</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Citrate acide anhydre</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Recherche fondamentale&nbsp ;</td><td>Logiciel Nikon</td><td></td><td>pour l’imagerie</td></tr></tbody></table>

isolation, fixation et l’immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence est une technique bien établie pour la détection des antigènes dans les tissus avec l’emploi d’anticorps conjugués fluorochrome et dispose d’un large éventail d’applications. Détection d’antigènes permet la caractérisation et l’identification de plusieurs types de cellules. Située au-dessus des reins et encapsulé par une couche de cellules mésenchymateuses, la glande surrénale est un organe endocrine composé de deux tissus différents avec différentes origines embryologiques, le cortex externe mésonéphriques dérivés mesoderm intermédiaire et les neurones medulla interne dérivée de crête. La corticosurrénale sécrète des stéroïdes (c.-à-d., les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes, hormones sexuelles), tandis que la médullosurrénale produit des catécholamines (c.-à-d., adrénaline, noradrénaline). En effectuant une recherche surrénalienne, il est important d’être capable de distinguer les cellules uniques avec des fonctions différentes. Ici, nous fournissons un protocole mis au point dans notre laboratoire qui décrit une série d’étapes séquentielles requises pour l’obtention d’immunofluorescence souillant pour caractériser les types de cellules de la glande surrénale. Nous nous concentrons d’abord sur la dissection des souris les glandes surrénales, l’élimination microscopique des graisses periadrenal suivie de la fixation, le traitement et la paraffine incorporant des tissus. Nous décrivons ensuite la découpe des blocs de tissus avec un microtome rotatif. Enfin, nous détaillons un protocole pour l’immunofluorescence des glandes surrénales que nous avons élaborée pour minimiser les anticorps non-spécifiques et autofluorescence afin d’obtenir un signal optimal.

La figure 1 représente une représentation schématique de l’ensemble du protocole décrit ci-dessus. Les glandes surrénales sont récoltées de souris, adjacent de tissus adipeux est enlevé sous un microscope à dissection et les surrénales sont ensuite fixés à 4 % PFA. Après cette étape, les glandes surrénales sont traitées et incorporés à la paraffine et sectionnés avec un microtome permettant de couper l’orgue en fines tranches qui sont déposés sur lames de mic...

Nous présentons ici une méthode pour isoler les glandes surrénales de souris, difficulté les tissus, leur section et effectuez l’immunofluorescence souillant.

Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

L’immunofluorescence est une méthode de base qui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine surrénalien sur la zonation surrénale, l’identité cellulaire et la fonction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de protéines multiples tout en préservant la morphologie du tissu surrénal. Pour enlever la glande surrénale murine, coupez autour du tissu adipeux environnant et placez la glande dans un puits d’une plaque de 24 multiwell contenant du PBS frais sur la glace.Transférez la glande sur une boîte de Pétri ou un support en verre sous un microscope disséquant et utilisez deux aiguilles de calibre 25 pour enlever le tissu adipeux adjacent. Lorsque toute la graisse a été enlevée, fixer le tissu dans 4%paraformaldéhyde à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures. À la fin de l’incubation, rincer la glande avec trois lavages de 15 minutes à quatre degrés Celsius en un à deux millilitres de PBS frais par lavage.Après le dernier lavage, déshydrater la glande en deux immersions séquentielles d’éthanol à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures par incubation. Pour préparer le tissu surrénalal pour le traitement,

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Surrénales médullaires systèmes de culture de cellules chromaffines sont extrêmement utiles pour l'étude de l'excitation-sécrétion de couplage dans une dans la mise en in vitro. Ce protocole illustre la méthode utilisée pour disséquer les glandes surrénales et ensuite isoler la région médullaire en enlevant le cortex surrénalien. La digestion de la moelle dans les cellules chromaffines unique est alors démontrée.

Souris d&#39;isolement surrénales cellules chromaffines

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer une immunocoloration multiplex à l’aide d’anticorps primaires de la même espèce hôte. Dans cette méthode, une section de tissu surrénalien subit un processus d’immunocoloration en deux étapes. Initialement, la section est colorée avec des anticorps spécifiques des marqueurs du cortex, suivie d’un démantèlement de l’anticorps lié et d’une recoloration avec des anticorps spécifiques des marqueurs de la moelle.

Procédé d’immunomarquage multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Après l’exocytose, la membrane plasmique fusionnée est récupérée par un processus connu sous le nom d’endocytose. Ce mécanisme reforme les nouvelles vésicules synaptiques pour le prochain cycle de libération. Les événements endocytaires individuels sont capturés et analysés à l’aide des enregistrements de capacité attachés aux cellules dans les cellules de chromaffine surrénale de souris.

Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Nous présentons une méthode pour l'isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l'ensemble de l'immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.

Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Nous présentons un protocole pour disséquer les glandes pituitaires et préparer hypophysaires sections coronales des pays en développement de la souris.

Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.

Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Ce protocole décrit l’isolement des progéniteurs fibro-adipogéniques (FAP) du muscle squelettique et cardiaque de la souris épineuse (Acomys) par dissociation enzymatique et tri cellulaire activé par fluorescence. Les FAP obtenues à partir de ce protocole peuvent être efficacement étendues et différenciées en myofibroblastes et adipocytes.

Isolement, expansion et différenciation des progéniteurs fibro-adipogènes à partir du modèle de souris épineuses

Une approche robuste et reproductible pour établir des cultures primaires 2D de cellules enrichies en zones gloméruloses et zones fasciculées a été développée pour le cortex surrénalien de la souris. Ce système préserve les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles clés de chaque zone, permettant une étude ciblée des voies de signalisation, de la production d’hormones et du comportement des cellules corticales surrénales ex vivo.

Établissement de cultures primaires enrichies en zone à partir du cortex surrénalen de la souris

Apprenez l'isolation, la fixation et l'immunofluorescence des glandes surrénales de souris. Cette technique permet d'étudier la zonation surrénale et l'identité cellulaire tout en préservant la morphologie tissulaire.

Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

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