Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

L’immunofluorescence est une méthode de base qui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine surrénalien sur la zonation surrénale, l’identité cellulaire et la fonction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de protéines multiples tout en préservant la morphologie du tissu surrénal. Pour enlever la glande surrénale murine, coupez autour du tissu adipeux environnant et placez la glande dans un puits d’une plaque de 24 multiwell contenant du PBS frais sur la glace.

Transférez la glande sur une boîte de Pétri ou un support en verre sous un microscope disséquant et utilisez deux aiguilles de calibre 25 pour enlever le tissu adipeux adjacent. Lorsque toute la graisse a été enlevée, fixer le tissu dans 4%paraformaldéhyde à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures. À la fin de l’incubation, rincer la glande avec trois lavages de 15 minutes à quatre degrés Celsius en un à deux millilitres de PBS frais par lavage.

Après le dernier lavage, déshydrater la glande en deux immersions séquentielles d’éthanol à quatre degrés Celsius avec basculement pendant deux heures par incubation. Pour préparer le tissu surrénalal pour le traitement, enveloppez la glande dans de la gaze et enfermez l’surrénale dans une cassette d’intégration tissulaire. Ensuite, placez la cassette dans un bocal rempli de 70 % d’éthanol pour un stockage de quatre degrés Celsius jusqu’au traitement.

Pour traiter le tissu, insérez la cassette dans le processeur de tissu pour le traitement tel qu’indiqué dans le tableau. À la fin du programme, transférez la cassette dans une station d’intégration remplie de paraffine fondue à 65 degrés et utilisez une paire de forceps pour déballer la gaze. Transférer délicatement l’surrénale dans la position appropriée au centre de la base du moule d’intégration et verser la paraffine fondue sur la glande.

Ensuite, déplacez soigneusement le moule d’intégration à un plateau de refroidissement pour faciliter le durcissement de la paraffine. Avant de sectionner par microtome rotatif, étiquetez une série de diapositives au microscope et étiez les glissières sur un chauffe-glissière de 37 degrés Celsius. Distribuez environ 450 microlitres d’eau ultra pure de type 1 autoclavé sur chaque glissière et réglez l’épaisseur de coupe de la section du microtome à cinq micromètres.

Chargez le tissu incorporé sur le bloc de coupe et abaissez le bloc de paraffine jusqu’à ce que l’échantillon soit au niveau du visage avec le bord de la lame de microtome. Faire pivoter la roue à main avec un rythme régulier, effectuer une coupe initiale pour enlever la paraffine et exposer le tissu surrénalien. Ensuite, acquérir cinq sections de micromètres à travers l’extrémité de la glande surrénale à l’aide de forceps pour transférer chaque section dans la gouttelette d’eau sur l’une des diapositives pré-étiquetées comme il est recueilli.

Après avoir confirmé la présence de tissu dans les sections par microscopie, séchez les glissières sur la plaque chaude pendant environ deux heures et faites-les cuire au moins toute la nuit sur un plateau de glissière à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’eau visible. Une fois sèches, conservez les glissières dans une boîte à glissière à température ambiante. Pour la récupération d’antigène d’immunofluorescence, dé-paraffinize les glissières avec deux immersions de cinq minutes de 100% xylène, suivies de la réhydratation dans une série descendante d’immersion d’éthanol et d’eau.

Après l’immersion dans l’eau, transférer les glissières sur un porte-glissière métallique et placer le support dans un bécher de citrate molaire bouillant de 0,01 sur une plaque chaude pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, retirer le bécher de la plaque chaude et laisser refroidir pendant 20 minutes, en prenant soin que toutes les sections surrénales soient encore recouvertes de tampon. Lorsque le bécher est refroidi, transférer les glissières dans un bocal Coplin pendant trois lavages de 10 minutes dans du PBS frais avec un basculement doux.

Après le dernier lavage, essuyez soigneusement la surface de chaque toboggan sans endommager les sections tissulaires et utilisez un marqueur hydrophobe pour faire un cercle autour de chaque section. Placez les glissières dans une chambre humidifiée et ajoutez rapidement au moins 50 microlitres de solution de blocage à chaque section pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, lavez les glissières trois fois dans du PBS frais pendant cinq minutes par lavage avec le basculement et retournez les glissières à la chambre.

Ensuite, ajoutez le cocktail principal d’anticorps d’intérêt à chaque section pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les échantillons avec trois lavages de 15 minutes en PBS frais par lavage et étiquetez les glissières avec la solution d’anticorps secondaire appropriée pendant une heure à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec trois lavages de 15 minutes sur un rocker protégé de la lumière, en étiquetant les noyaux des sections avec dapi pendant sept minutes à température ambiante protégée de la lumière après le dernier lavage.

Après trois lavages PBS de cinq minutes avec bascule, ajouter 60 microlitres d’agent de montage adaptés à l’immunofluorescence le long de la surface d’un verre de couverture par échantillon et appuyez légèrement sur chaque côté de section de tissu de glissière vers le bas sur un verre de couverture, prenant soin d’éviter des bulles. Ensuite, déposer chaque glissière à plat dans un récipient sombre pour le séchage à température ambiante pendant au moins 24 heures avant l’imagerie. Pendant le processus d’élimination des graisses, il est essentiel de ne pas laisser sécher la glande surrénale car la déshydratation peut endommager la structure tissulaire.

Après un déplacement réussi du tissu adipeux environnant, la glande surrénale devrait être facilement détectable sans graisse visible supplémentaire. L’immunostaining des sections surrénales de glande comme démontré indique le facteur steroidogenic nucléaire une coloration des cellules adrenocortical, la coloration d’hydroxylase de tyrosine des cellules médullaires, la coloration de DAPI des noyaux des cellules non stéroïdogènes de la capsule externe, et co-souillant avec les cellules adrenocortical et médullaires. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que les surrénales de souris sont petites et que leurs positions sont quelque peu variables rendant leur détection difficile.

Par conséquent, il est crucial d’avoir une vue claire de la zone pendant la dissection. Ces procédures sont des techniques de base pour l’étude de la glande surrénale in vivo. Par la suite, d’autres méthodes d’immunostaining peuvent être effectuées pour répondre à des besoins scientifiques spécifiques.

Après son développement, l’immunostaining a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines des sciences biomédicales pour explorer l’expression in situ des protéines, un outil utile dans de nombreuses disciplines et domaines.