Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet
1 novembre 2018
Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du chloroplaste, par exemple, la composition des machines d’importation de protéines chloroplastes. Il est essentiel pour le verdissement et la photosynthèse et donc pour la production alimentaire sur la planète. La machine moléculaire se compose de deux complexes distincts dans le membre externe et intérieur du chloroplaste appelé TOC et TIC, mais la composition n’est pas entièrement connue.
Le principal avantage de cette technique est que la purification du complexe Arabidopsis TOC/TIC peut être accomplie en une seule étape méthode de purification, la purification TAP-TOC. C’est une méthode spécifique et efficace. En général, les chercheurs nouveaux à cette méthode peuvent lutter parce qu’ils ne sont pas familiers avec l’isolement des fractions de membrane chloroplaste, détergent, solubilization, ou purification d’affinité.
Après avoir préparé les plantes arabidopsis, moudre 10 grammes de semis de trois semaines dans de l’azote liquide, à l’aide d’un mortier froid et pilon avec du sable. Ajouter 20 millilitres de tampon de broyage à froid aux tissus du sol. Bien mélanger et laisser le mélange décongeler sur la glace.
Ensuite, trempez deux couches de matériau de filtration rapide avec tampon de broyage. Filtrer l’homogénéité à travers les deux couches de matériau de filtration dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Centrifugez le filtrate à 1500 fois g en quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et transférez le supernatant dans un tube de centrifugeuse conique frais et pré-refroidi de 50 millilitres.
Répétez la centrifugation une fois de plus dans les mêmes conditions. Transférer le supernatant dans un tube d’ultracentrifugeuse froid de 38,50 millilitres et le recharger jusqu’à 35 millilitres avec tampon de broyage à froid. Utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.
À l’aide d’un homogénéisateur en téflon en verre, réutilisez la pastille verte dans un tampon de broyage. Centrifugeuse à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure et jeter le supernatant. Utilisez l’homogénéiseur en verre téflon pour résuspendre la pastille verte dans 18,75 millilitres d’un tampon de broyage x.
Ajouter ensuite 9,375 millilitres d’un tampon de broyage x. Ajouter 9,375 millilitres de quatre x solution de solubilisation pour porter le volume final à 37,5 millilitres et incuber sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.
Transférer le supernatant contenant les membranes solubilisées dans un tube de centrifugeuse conique frais de 50 millilitres. Après avoir préparé la résine d’agarose IGG, transférez la résine d’agarose IGG précédemment lavée au tube conique de 50 millilitres contenant les 37,5 millilitres de membranes solubilisées. Incuber pendant la nuit sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, sédimenter la résine agarose IGG à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez une pipette pour enlever le surnatant. Était la résine agarose IGG dans 37,5 millilitres de tampon A et incuber sur un shaker rotatif à température ambiante pendant 10 minutes.
Continuer à sédimenter et laver la résine comme indiqué dans le protocole de texte. Après cela, transférer la résine agarose IGG à une colonne de spin de 500 microlitres avec un filtre de 35 microns. Lavez les perles deux fois avec 300 microlitres de tampon d’élitution TEV pour l’équilibrage.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon d’élitution TEV contiennent 10 microlitres de protéase TEV. Incuber la colonne de spin avec des perles dans un Thermomixer à 16 degrés Celsius et 350 tours pendant deux heures. Ensuite, ouvrez la colonne de spin et placez-la dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre.
Faites tourner ce tube à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour recueillir l’allongement. Dans cette étude, un complexe protéique d’enveloppe de chloroplaste tagué tap des usines transgéniques d’A.thaliana est purifié. L’analyse d’Immunoblot confirme que l’isolat TAP-TOC159 interagit avec TOC75 et TOC33 du complexe TOC.
La kinase de membrane externe de chloroplaste, KOC1, qui est connue pour phosphorylate TOC159 est également co-isolée. La présence de TIC110 révèle que le complexe isolé TAP-TOC159 contient également les composants du complexe TIC. L’anticorps FBN1A n’a pas reconnu le complexe TAP-TOC159, ce qui indique l’absence de contaminations.
Dans le contrôle négatif, la protéine NTAP immunoprécipitée ne s’est co-isolée avec aucune des protéines TOC, TIC et confirme la spécificité de la purification TAP-TOC159. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’importation de protéines chloroplastes, elle peut potentiellement être appliquée à tout autre complexe dans le système de bouteilles arabidopsis thaliana. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes peuvent être appliquées, comme le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse, soit pour démontrer la présence de composants connus, soit pour identifier de nouveaux composants des complexes TOC et TIC.
Cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de l’importation de protéines chloroplastes afin d’explorer la fonction des nouveaux composants des complexes TOC et TIC.
Aperçu
Cet article présente un protocole d'isolement par affinité en une étape pour purifier les complexes d'importation de protéines des chloroplastes (complexe TOC-TIC) en utilisant la balise TAP. Cette méthode peut identifier de nouveaux partenaires d'interaction par spectrométrie de masse et est cruciale pour comprendre la fonction des chloroplastes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Biologie des chloroplastes
- Purification des protéines
- Spectrométrie de masse
Contexte
- Le mécanisme d'importation des protéines des chloroplastes est essentiel pour la photosynthèse et la production de nourriture.
- Les complexes TOC et TIC sont impliqués dans l'importation des protéines, mais leur composition complète n'est pas bien comprise.
- Les méthodes actuelles pour isoler ces complexes peuvent être complexes et chronophages.
- Cette étude vise à simplifier le processus de purification.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole simple pour purifier le complexe TOC-TIC.
- Faciliter l'identification de nouveaux composants impliqués dans l'importation des protéines des chloroplastes.
- Fournir une méthode qui peut être appliquée à d'autres complexes protéiques chez Arabidopsis thaliana.
Méthodes utilisées
- Préparation des plants d'Arabidopsis et broyage dans de l'azote liquide.
- Centrifugation séquentielle pour isoler les membranes des chloroplastes.
- Purification par affinité utilisant une résine d'agarose IGG.
- Analyse par immunoblot pour confirmer la présence de protéines spécifiques.
Résultats principaux
- Le complexe TAP-TOC159 a été purifié avec succès et a montré une interaction avec TOC75 et TOC33.
- La co-isolation de TIC110 a indiqué la présence de composants TIC dans le complexe purifié.
- La méthode a démontré une spécificité, car les contrôles négatifs n'ont pas montré de co-isolation avec les protéines TOC et TIC.
- Cette technique permet une exploration plus approfondie des mécanismes d'importation des protéines des chloroplastes.
Conclusions
- La méthode de purification par balise TAP est efficace et spécifique pour isoler les complexes protéiques des chloroplastes.
- Cette approche peut améliorer la recherche sur le système d'importation des protéines des chloroplastes.
- Des études futures peuvent exploiter cette méthode pour identifier de nouveaux composants des complexes TOC et TIC.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
