Name: Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum: souches MSR-1, 1-AMB et MS-1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Apprenez à cultiver trois souches de bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum avec contrôle précise de l'oxygène. Ce protocole optimise la croissance de MSR-1, AMB-1 et MS-1 pour des études reproductibles en microbiologie environnementale.

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Nous remercions Richard B. Frankel pour son aide avec cultures MTB, Adam P. Hitchcock et Xiaohui Zhu pour leur soutien pendant la mise en place des cultures de VTT à l’Université McMaster et Marcia Reid pour la formation et l’accès à la facilité de la microscopie électronique (McMaster University, Faculté des Sciences de la santé). Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) et le US National Science Foundation.

1. installation de la Station de2 N
Remarque : Choisissez le diamètre intérieur du tuyau pour qu’il peut être relié au réservoir de gaz avec fuite minimale et que le cylindre d’une seringue de 1 mL en plastique s’adapte étroitement dans ce tube. Une illustration de la complète N2 station de gazage est fournie à la Figure 1.
<ol><li>En toute sécurité installer un réservoir de gaz N2 à proximité d’un banc sur lequel il y a suffisamment d’espace pour mettre en place la station2 N (une longueur d’environ 50 cm).</li>
	<li>Raccorder à la citerne un morceau de tuyau assez longtemps pour atteindre la zone où sera construite la station. Si nécessaire, appliquez du ruban téflon à la sortie du réservoir pour éviter toute fuite.</li>
	<li>Pour construire une station capable de propagation cinq bouteilles de milieu en même temps, coupez quatre morceaux de tuyau d’environ 5 cm de longueur.</li>
	<li>Assemblez les morceaux de tube en ligne avec trois raccords en plastique triangulaire en forme de T. Connectez une extrémité de cette ligne pour le morceau de tuyau à la sortie du réservoir N2 grâce à un raccord supplémentaire en forme de T. Ajouter un coude de 90° à l’autre extrémité.</li>
	<li>Utiliser du ruban pour fixer la structure d’une tige métallique horizontale placée à environ 30 cm au-dessus du banc.</li>
	<li>Connectez cinq morceaux de tuyau (environ 20 cm de longueur) sur les sorties libres du mobilier installé à l’étape 1.4.</li>
	<li>Retirer les pistons de seringues en plastique de cinq 1,0 mL et couper l’extrémité la plus grande de ces seringues (i.e., la face du côté de l’aiguille), gardant seulement la partie graduée. Remplissez ces seringues avec du coton, sans trop serrer.</li>
	<li>Insérer les seringues dans les pièces verticales de 20 cm de tube et utiliser de l’eau savonneuse pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite lorsque N2 circule.</li>
	<li>Enlever les bouchons des cinq aiguilles 25 G (0,5 mm x 25 mm) et insérer ces aiguilles dans les pièces de 10 cm de tube mince. Veiller à ce que les aiguilles s’adapter étroitement dans la tubulure. ATTENTION : Il existe un risque de coups de couteau au cours de cette étape. Faites-le lentement et soigneusement.</li>
	<li>Fixer les aiguilles élaborées en étape 1.9 pour les seringues de la N2 . Veiller à ce que N2 circule dans toutes les cinq lignes et maintenir la station en stand by.</li>
</ol>2. croissance moyenne préparation
Remarque : Il est possible d’ajuster la quantité de milieu préparé, comme il est expliqué dans les étapes 2.1.2, 2.2.2 et 2.3.8. La quantité d’eau et de produits chimiques mises en oeuvre doit juste être ajustée proportionnellement. Le rôle de toutes les composantes moyennes est décrite dans supplémentaire tableau 1.
<ol><li>Préparation du milieu de culture liquide MSR-1<ol>
<li>Préparer une solution de citrate ferrique 10 mM en ajoutant 100 mL d’eau distillée désionisée 0,245 g de citrate ferrique. Faire chauffer et remuer pour bien dissoudre, jusqu'à un jaune à l’orange clair solution est obtenue. Stériliser la solution en utilisant une norme cycle (au moins 15 min exposition à 121 ° C) et ensuite stocker cette solution-mère à température ambiante dans l’obscurité. Remarque : Jeter la solution de citrate ferrique lorsqu’un précipité devient évident.</li>
		<li>Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 1,0 mL de l’oligo-élément complément solution, 0,1 g de KH2PO4, 0,15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g NaNO3 , extrait de 0,1 g de levure, 3,0 g de peptone de soja de haricot, 4,35 mL de lactate de potassium (solution à 60 % w/w) et 5 mL de la solution mère de citrate de Fe (III) de 10 mM. Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Pour une station de2 N capable de propagation cinq bouteilles en même temps, tel que celui construit à l’étape 1 du présent protocole, préparer 300 mL de milieu. ATTENTION : Trace minérale et stock de citrate de Fe (III) des solutions doivent rester stérile. Pour éviter toute contamination, utilisez technique stérile standard lorsque vous utilisez les (flamme ouverte dessus des bouteilles à l’aide d’un bec Bunsen) et pointes de pipette stérile pour la distribution. Conserver la solution minérale dans un réfrigérateur à 4 ° C.</li>
		<li>Après l’addition de tous les produits chimiques, ajuster le pH à 7.0 avec la solution de NaOH 1 M. Diluer le milieu fraîchement préparé dans des flacons de sérum de 125 mL. Verser 60 mL de milieu dans chaque bouteille.</li>
		<li>N2 , dans le milieu pendant 30 min enlever le dissous O2, Bubble, utilisant le petit tuyau relié à la gare de2 N décrite à l’étape 1. Placer un bouchon en butyle-caoutchouc sur le dessus de chaque bouteille, laissant une petite ouverture pour permettre à l’excès de gaz à la sortie de la bouteille. ATTENTION : La mousse peut-être former tout en bulles avec N2. Régler le débit de gaz en conséquence afin d’éviter la production de mousse.</li>
		<li>Sertissage sceller chaque bouteille avec le bouchon préparé et un joint d’étanchéité en aluminium. Le joint d’étanchéité en aluminium assure que la bouteille reste scellée pendant le reste du protocole.</li>
		<li>Débranchez les aiguilles et le tube mince de la station de2 N et remplacez-les par des seringues propres (1po, ≤ 23 G). Régler les vannes du réservoir N2 pour qu’un léger courant continu de gaz sort de la cuve (environ 50 mL/min). Remarque : Aiguilles supérieure à 23G peuvent laisser des trous unsealable permanentes du bouchon.</li>
		<li>Insérez l’un des aiguilles connectés au réservoir N2 dans un flacon de milieu, à travers le bouchon en caoutchouc. Insérer immédiatement une autre aiguille propre dans le même flacon. Répétez cette étape pour les autres bouteilles et laisser couler2 N pendant environ 30 min remplacer l’air dans les bouteilles par N2.</li>
		<li>Débrancher une bouteille de la station de2 N en retirant l’aiguille correspondante. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la pression dans la bouteille de milieu diminue à la pression atmosphérique et retirer l’aiguille de seconde. Répétez cette étape pour toutes les bouteilles restantes. ATTENTION : Pour éviter que O2 réintègrent les flacons de milieu de culture après étape 2.1.4, effectuez les étapes 2.1.4 - 2.1.8 en succession rapide. Si toutes les bouteilles ne peut pas être connectés à la station2 de N dans le même temps, procéder à des mesures 2.1.4-2.1.8 pour la première série de bouteilles et puis répétez ces étapes pour les bouteilles restantes.</li>
		<li>Stériliser les biberons. Laissez-les refroidir à température ambiante pendant la nuit et les stocker à température ambiante par la suite.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du milieu de culture liquide pour AMB- 1et/MS-1<ol>
<li>Préparer une solution quinates ferrique de 10 mM. Tout d’abord dissoudre 0,19 g de l’acide quinique dans 100 mL d’eau distillée désionisée, puis ajouter 0,27 g de FeCl3.6H2O. remuer pour dissoudre, jusqu'à l’obtention d’une solution claire rouge foncée. Autoclave la solution en utilisant un cycle standard (exposition d’au moins 15 min à 121 ° C). NOTE : Stocker la solution ferrique quinate à température ambiante dans l’obscurité comme une solution stérile. Jeter la solution quand un précipité devient évident.</li>
		<li>Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 10,0 mL de la solution de supplément de vitamine, 5,0 mL de la solution de supplément minéral trace, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g du succinate de sodium dibasique hexahydraté, 0,575 g de di-Sodium tartrate dihydraté, 0,083 g d’acétate de Sodium trihydraté, 0,45 mL de 0,1 % solution aqueuse résazurine, 0,17 g NaNO3, 0,04 g d’acide ascorbique et 3,0 mL de la solution mère quinate Fe (III) de 10 mM. Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Pour une station de2 N capable de propagation cinq bouteilles en même temps, tel que celui construit à l’étape 1 du présent protocole, préparer 300 mL de milieu. ATTENTION : Vitamine, oligo-élément et Fe (III) les solutions mères quinates doivent rester stérile. Pour éviter toute contamination, utiliser une technique stérile standard et pointes de pipette stérile lors de la distribution. Stocker les solutions de minéraux et de vitamines dans un réfrigérateur à 4 ° C.</li>
		<li>Après l’addition de tous les produits chimiques, ajuster le pH à 6,75 à l’aide de la solution de NaOH 1 M.</li>
		<li>Reportez-vous aux étapes 2.1.3-2.1.9 pour le reste du protocole.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du milieu semi-solide pour MSR-1<ol>
<li>Préparer un 0,5 M phosphate solution tampon pH 7.0 en dissolvant 3,362 K2HPO4 et 4,178 g de KH2PO4 dans 100 mL d’eau distillée désionisée. Vérifiez si le pH 7.0 et ajuster le pH légèrement avec KH2PO4 ou NaOH si nécessaire. Conserver la solution dans un flacon de verre scellé (préférable au plastique afin d’éviter l’échange de l’oxygène).</li>
		<li>Préparer 100 mL d’une solution chlorhydrique de 0,02 M. Ajouter 0,2 g de FeCl2.4H2O dans cette solution et remuez pour dissoudre en vue d’obtenir une solution de chlorure de fer de 10 mM. Conserver la solution dans l’obscurité dans une bouteille de verre scellé.</li>
		<li>Préparer une solution de bicarbonate de sodium 0,8 M en dissolvant 6,72 g de NaHCO3 dans 100 mL d’eau distillée désionisée. Conserver la solution dans un flacon de verre scellé.</li>
		<li>Autoclave les solutions préparées en étapes 2.2.1 - 2.2.3 en utilisant un cycle standard (exposition d’au moins 15 min à 121 ° C). Rangez-les dans l’obscurité des solutions mères aussi stériles.</li>
		<li>Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 5 mL de la solution de supplément minéral trace, 0,2 mL de solution aqueuse de résazurine 1 %, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7H2 O, 0,05 g de CaCl2.2H2O, 1 g de succinate sodique de 0,5 g d’acétate de sodium, 0,2 g de levure, extrait et 1,6 g d’agar.</li>
		<li>Couvrir le bécher avec le papier d’aluminium et de stériliser la solution préparée à l’étape 2.3.5.</li>
		<li>Juste avant la fin du cycle de l’autoclave, préparer un frais 4 % L-cysteine· HCl· Solution2O H en dissolvant 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O dans 20 mL d’eau distillée désionisée. Neutraliser la solution à pH 7,0 avec une solution de NaOH 5 M. ATTENTION : il est important que la solution de cystéine est préparée fraîche pour éviter l’oxydation de la cystéine. Conserver la solution minérale dans un réfrigérateur à 4 ° C.</li>
		<li>Après la stérilisation, laisser refroidir les moyens jusqu'à 50 – 60 ° C et placer le bécher sous la flamme d’un bec Bunsen. Retirer le papier d’aluminium et rapidement ajouter ce qui suit dans l’ordre en agitant doucement : 0,5 mL de la solution de vitamine, 2,8 mL de la solution mère du tampon phosphate stérile, 3 mL de la solution mère de fer stérile chlorure, 1,8 mL de l’étalon de bicarbonate de sodium stérile solution et 10 mL de solution de cystéine stérilisée par filtration. Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Il convient généralement d’établir un lot de 120 mL de milieu. ATTENTION : Toutes les solutions doivent rester stériles pour une utilisation future. Effectuez l’étape 2.3.8 en utilisant une technique stérile standard et pipette stérile conseils lors de la distribution.</li>
		<li>Après l’addition de tous les produits chimiques, transvaser le milieu chaleureux dans Hungate tubes de 16 mL stérile un bouchon qui visse. Transfert de 12 mL de milieu dans chaque tube et sceller les tubes. ATTENTION : Pour éviter toute contamination, pour effectuer l’étape 2.3.9 sous la flamme d’un bec Bunsen. Effectuez-la avant l’agar solidifie, tandis que le milieu est à 40 ° C ou plus.</li>
		<li>Laisser les tubes pendant plusieurs heures jusqu'à ce que l’agar se solidifie et le OAI devient évident, qui interviendrait comme une rose à l’interface incolore, environ 1 à 3 cm sous la surface du milieu. NOTE : Le support doit tourner lentement incolore dans le tube. La quantité de temps nécessaire à cette transition est variable et dépend de la quantité d’O2 initialement dissous dans le milieu.</li>
	</ol></li>
</ol>3. inoculation de MTB
Nota : Les cultures de souches AMB-1 MS-1 et MSR-1 peuvent être obtenues sur le marché (Table des matières).
ATTENTION : Pour effectuer toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles, la flamme d’un bec Bunsen.
<ol><li>Inoculation des souches MSR-1, 1-AMB et MS-1 en milieu liquide<ol>
<li>Sceller une bouteille vide de 125 mL de sérum avec un bouchon de caoutchouc-butyle et d’un joint de sertissage en aluminium. Insérez deux aiguilles dans la bouteille à travers le bouchon et raccorder une seringue préparée comme étape 1.7 à l’un d'entre eux. Connecter la seringue à une bouteille d’O2 dans le même type de tube comme celle utilisée pour la station de2 N.</li>
		<li>Laisser couler2 O par le biais de la bouteille pendant environ 30 min, pour s’assurer que tout l’air dans la bouteille est remplacé par O2. Enlever les deux aiguilles, permettant une légère surpression dans la bouteille, puis l’autoclave. Laisser la bouteille se refroidir à température ambiante avant utilisation. NOTE : Pour gagner du temps, effectuez les opérations 3.1.1 et 3.1.2 au cours de la préparation moyenne et stériliser la bouteille ainsi que le support ou les solutions mères.</li>
		<li>Stériliser le dessus des bouchons de la bouteille de milieu frais et la bouteille de2 O en appliquant quelques gouttes de solution d’éthanol 70 % au-dessus d’eux et en leur passant par la flamme d’un bec Bunsen.</li>
		<li>À l’aide d’une seringue stérile et une aiguille, 1 mL d’O2 extrait de la bouteille de2 O et transférez-le dans le flacon de milieu frais. Assurez-vous que l’aiguille fermement sur la seringue au cours de cette étape pour éviter l’air dans la seringue.</li>
		<li>Si vous utilisez l’inoculum à partir d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, stériliser les bouchons de la nouvelle bouteille moyenne et le plus vieux flacon d’hémoculture en appliquant quelques gouttes de solution d’éthanol 70 % au-dessus d’eux et en leur passant par la flamme d’un bec Bunsen. Si vous utilisez l’inoculum à partir d’un tube de culture congelée, juste le laisser réchauffer à température ambiante avec le tube scellé sous la flamme d’un bec Bunsen.</li>
		<li>Si vous utilisez l’inoculum à partir d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, ensemencer 1 mL de la culture plus ancienne dans le milieu frais. Si vous utilisez l’inoculer un stock congelé, inoculer seulement 0,1 mL pour diluer le glycérol ou diméthyl sulfoxyde (DMSO) utilisé dans le processus de congélation. Dans les deux cas, utilisez une aiguille stérile et une seringue stérile.</li>
		<li>Incuber la culture à 32 ° C et il ensemencer un milieu frais après 4 à 7 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculation de MSR-1 en milieu semi-solide dégradé du O-2<ol>
<li>Vérifiez que le tube de milieu frais affiche un OAI bien défini, matérialisé par une rose à interface incolore.</li>
		<li>Si l’inoculum est venant d’une autre culture semi-solide O2 gradient de concentration, récolter les bactéries par pipetage 50µl de la culture avec un embout de la pipette stérile placé sur la bande formée par les bactéries. Lentement, inoculer ces bactéries à l’OAI dans le milieu frais (rose/incolore interface), en évitant de déranger l’interface. Si l’inoculum provient d’une culture congelée, procéder de la même façon avec 100 µL d’inoculum au lieu de cela.</li>
		<li>Fermer le tube et laisser que les bactéries se développent entre 25 ° et 30 ° C. Transvaser dans un milieu frais utilisant la même procédure, avant que la bande des bactéries n’atteigne la surface du milieu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. observation des bactéries
<ol><li>Stériliser le bouchon de la bouteille de culture en appliquant la solution d’éthanol à 70 % dessus et passant par la flamme d’un bec Bunsen. Pour un milieu semi-solide, ouvrez le tube sous la flamme d’un bec Bunsen. Utiliser une aiguille stérile et une seringue stérile pour extraire les bactéries.</li>
	<li>Utilisation la pendaison drop méthode8 pour s’assurer que les bactéries sont magnétiques et mobiles. NOTE : Microscopie à contraste de Phase donne d’excellents résultats mais n’est pas obligatoire. Conviennent de grossissements allant de 10 X à 60 X.</li>
	<li>Microscopie électronique à transmission (TEM) permet d’observer la structure cellulaire et les magnétosomes en détail8.</li>
</ol>

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<li>Hergt, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304885305001186">Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools.</a> Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).</li>
<li>Lefevre, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+magnetite-producing+magnetotactic+bacteria+belonging+to+the+Gammaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria.</a> The ISME Journal. 6 (2), 440(2012).</li>
<li>Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetospira+thiophila+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+a+marine+magnetotactic+bacterium+that+represents+a+novel+lineage+within+the+Rhodospirillaceae+%28Alphaproteobacteria%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria).</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+marine+magnetotactic+spirillum+axenic+culture+QH-2+from+an+intertidal+zone+of+the+China+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea.</a> Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les exigences de concentration de2 O spécifiques de m. tuberculosis rendent non négligeable à cultiver en laboratoire. Une étape clé du protocole pour le milieu liquide est la suppression initiale de tous les O2 du milieu afin de contrôler la concentration finale en ajoutant un volume précis d’O2, juste avant l’inoculation. Il a été démontré que MSR-1 pousse dans des conditions aérobies presque complètement, cependant, le magnétisme des cellules est considérablement réduit. Les résultats ...

Bactéries magnétotactiques (MTB) représentent un large éventail d’omniprésents dans les habitats aquatiques d’eau douce et1gramnégatives procaryotes. Ces bactéries ont la capacité de produire les cristaux magnétiques en magnétite (Fe3O4) ou greigite Fe3S4, qui sont le plus souvent assemblés dans des chaînes à l’intérieur des cellules. Ce motif structural particulière est due à la présence de plusieurs protéines spécifiques agissant aussi bien dans le cytoplasme de la bactérie et sur la membrane lipidique qui entoure chaque cristal2. Chaque cristal individuel et ses vésicules de membrane environnante est appelé un magnétosomale et est variant entre 30 et 50 nm de Magnetospirillum espèces3. En raison de la configuration de la chaîne de magnétosomes, ces bactéries possèdent un moment magnétique permanent qui les rend aligner passivement des champs magnétiques appliqués extérieurement. Par conséquent, ces bactéries activement nagent le long des lignes de champ magnétique, en tant que micro-boussoles automoteurs vraisemblablement à plus localiser efficacement les conditions les plus favorables (e.g., concentration de O2 ) pour la croissance.
Une propriété intéressante de m. tuberculosis est leur capacité à réguler la chimie et la cristallographie de leurs cristaux magnétosomale. La plupart des souches produisent des cristaux relativement haute pureté de magnétite ou greigite, bien que certains biomineralize les deux minéraux4. Dans tous les cas, les bactéries sont capables de contrôler avec précision la taille et la forme de leurs cristaux domaine magnétique unique. C’est ce qui explique pourquoi un grand nombre de recherches est entrepris pour développer une meilleure compréhension de comment MTB effectuer ce processus de biominéralisation. Compréhension de ce processus pourrait permettre aux chercheurs de travailler-faire des nanocristaux magnétiques pour de nombreuses applications commerciales et médicales.
Un obstacle de taille à des recherches approfondies sur les VTT a été la difficulté de leur culture en laboratoire. La plupart des espèces, y compris les souches utilisées dans ce travail, sont obligatoirement microaérophiles lorsqu’il est cultivé avec O2 comme accepteur terminal d’électron. C’est ce qui explique pourquoi ces bactéries se trouvent le plus souvent à la zone de transition entre les conditions oxiques et anoxiques (l’interface oxic-anoxiques, OAI). Cela montre clairement que les VTT ont O2 concentration aux exigences précises qui doit évidemment être pris en compte lorsqu’ils établissent des milieux de culture pour ces organismes. De plus, la grande diversité existante de VTT implique que différentes souches aura besoin de différents types de gradients chimiques et d’éléments nutritifs pour une croissance optimale.
Dans ce travail, nous décrivons les méthodes pour la culture de trois du plus largement étudié VTT : Magnetospirillum magneticum (souche AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) et M. gryphiswaldense (MSR-1). Ces espèces phylogénétiquement appartiennent à la classe Alphaproteobacteria du phylum des Proteobacteria , sont hélicoïdales en morphologie et possèdent un flagelle polaire à chaque extrémité de la cellule. Nous fournissons les protocoles pour la culture de la souche MSR-1 en liquide et en O2 gradient de concentration semi-solide médias, sur la base des recettes moyennes publiées antérieurement5,6. Nous présentons également un protocole détaillé pour la culture de souches AMB-1 et MS-1 mis à jour le magnétique Spirillum croissance moyenne (MGSM)7.

<table><tbody><tr><td>AMB-1</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC 31632&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>Citrate ferrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>Supplément d’oligo-éléments</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fischer scientific</td><td>DF210929</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fischer scientific</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solution de L-lactate de potassium (60 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Acide quinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>Fischer scientific</td><td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>Complément vitaminique</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium hexahydraté</td><td>Fischer scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>L-tartrate de sodium dibasique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 .4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-cystine.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 1,0 mL</td><td>Fischer scientific</td><td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G x 1 aiguilles</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>flacons de sérum de 125 mL</td><td>Wheaton</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>joints en aluminium de 20 mm</td><td>Wheaton</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>Sertisseuse E-Z de 20 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>bouchons en caoutchouc butyle</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Hungate</td><td>Chemglass (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon de septum, 13mm, Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture en verre</td><td>Corning (VWR)</td><td>9826-16X</td> Acide chlorhydrique 36.5-38 %, <td></td></tr><tr><td>BioReagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11.6 - 12 N</td></tr></tbody></table>

croissance des bactéries magnétotactiques du genre magnetospirillum: souches msr-1, 1-amb et ms-1

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnétostatiques bactéries sont Gram négatifs, mobiles, principalement aquatiques procaryotes omniprésents dans les habitats d’eau douce et marins. Ils sont caractérisés par leur capacité de magnétosomes biomineralize, qui sont magnétiques taille nanométrique cristaux de magnétite (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) entouré d’une membrane lipidique bi-couche, dans leur cytoplasme. Pour la plupart des bactéries magnétotactiques connus, magnétosomes sont assemblés dans les chaînes dans le cytoplasme, ce qui confère un moment magnétique permanent aux cellules et obligeant à aligner passivement avec les champs magnétiques externes. En raison de ces caractéristiques, les bactéries magnétotactiques ont un grand potentiel pour des applications commerciales et médicales. Cependant, la plupart des espèces sont microaérophiles et ont des exigences spécifiques de O2 concentration, ce qui les rend plus difficiles à se développer régulièrement que beaucoup d’autres bactéries comme Escherichia coli. Nous présentons des protocoles détaillés pour la culture de trois des souches de bactéries magnétotactiques, tous appartenant au genre Magnetospirillumplus largement étudiés. Ces méthodes permettent un contrôle précis de la concentration de2 O mis à la disposition de la bactérie, afin de s’assurer qu’ils poussent normalement et synthétisent les magnétosomes. Croissance des bactéries magnétotactiques pour poursuivre ses études à l’aide de ces procédures ne nécessite pas l’expérimentateur d’être un expert en microbiologie. Les méthodes générales présentées dans cet article peuvent aussi servir à isoler et à la culture des autres bactéries magnétotactiques, bien qu’il soit probable que composition chimique de la croissance médias devront être modifiées.

Succès de la préparation des milieux de croissance peut être évaluée comme suit. À la fin du processus, des solutions claires (i.e., libre de tout précipité) doit être obtenu (Ceci vaut pour les milieux liquides et le milieu semi-solide dégradé O2 ). Une photo montrant l’aspect attendu du milieu liquid MSR-1 avant l’inoculation peut être vu dans la Figure 2 a. Un milieu semi-solide succès O2 gradient de concentration est signalé...

Nous présentons une procédure pour la culture de plusieurs souches de Magnetospirillum dans deux différents types de milieux de culture. Magnetospirillum gryphiswaldense souche MSR-1 est cultivée en liquide et en gradient de concentration2 O milieu semi solide alors que M. magneticum souche AMB-1 et M. magnetotacticum souche MS-1 sont cultivés en milieu liquide.

Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum: souches MSR-1, 1-AMB et MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Cette méthode permet de cultiver trois espèces différentes de bactéries magnétoactiques appelées MSR-1, AMB-1 et MS-1. Toutes les espèces d’eau douce, et toutes du genre magnétospirillum. Il s’agit d’une première étape essentielle pour toute recherche reproductible impliquant ces organismes.Les bactéries magnétoactiques ont des besoins en oxygène très spécifiques, c’est pourquoi elles ont développé un système de navigation magnétique. Il est donc très important de contrôler la quantité d’oxygène à leur disposition. Tout ce protocole a été optimisé pour quelques souches spécifiques de magnétospirille d’eau douce.Ses détails peuvent être optimisés afin de répondre aux besoins en oxygène et en nutriments d’autres bactéries magnétoactiques. Installez en toute sécurité un réservoir de gaz azoté près d’un banc sur lequel il y a suffisamment d’espace pour installer la station d’azote. Connectez un morceau de tube au réservoir qui est assez long pour atteindre la zone où la station sera construite.Si nécessaire, appliquez du ruban téflon à la sortie du réservoir pour éviter toute fuite. Pour construire une station capable de bouillonner cinq bouteilles de milieu en même temps, couper quatre morceaux de tube d’aproximately cinq centimètres de longueur. Assemblez les morceaux de tube en ligne avec trois raccords en plastique en forme de T à trois sens.Connectez une extrémité de cette ligne au morceau de tube à la sortie du réservoir d’azote grâce à un raccord supplémentaire en forme de T. Ajouter un raccord de coude à 90 degrés à l’autre extrémité. Utilisez du ruban adhésif pour fixer la structure à une tige métallique horizontale placée aproximately 30 centimètres au-dessus du banc.Connectez cinq morceaux de tubes d’une longueur aproximately de 20 centimètres aux trois sorties des raccords installés. Retirez les pistons de cinq seringues en plastique d’un millilitre et coupez l’extrémité la plus grande de ces seringues, en ne conservant que la partie graduée. Remplissez ces seringues de coton, en prenant soin de ne pas emballer trop étroitement.Insérez les seringues dans les tubes verticaux de 20 centimètres de long. Allumez le gaz et utilisez de l’eau savonneuse pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite lorsque l’azote coule. Retirez les bouchons de cinq aiguilles de calibre 25 et insérez ces aiguilles dans des morceaux de tubes minces de 10 centimètres.Fixez les aiguilles préparées aux seringues de la station d’azote. Assurez-vous que l’azote circule dans les cinq lignes et gardez la station en veille. Préparer une solution de citrate ferrique de 10 millimères en ajoutant 0,245 gramme de citrate ferrique à 100 millilitres d’eau déionisée distillée.Chauffer et remuer pour dissoudre jusqu’à ce qu’une solution claire orange soit obtenue. Autoclavez la solution à l’aide d’un cycle standard d’au moins 15 minutes d’exposition à 121 degrés Celsius avant de stocker la solution de stock stérilisé à température ambiante dans l’obscurité. Pour préparer cinq bouteilles de milieu de croissance liquide pour MSR-1, ajoutez les produits chimiques énumérés dans un protocole texte à un bécher contenant 300 millilitres d’eau déionisée distillée.L’ajout du citrate ferrique stérile et des solutions minérales doit être effectué sous la flamme d’un brûleur Bunsen à l’aide de techniques de stérilisation. Les conditions stériles sont essentielles pour éviter la contamination de la culture par d’autres espèces bactériennes. Après l’ajout de tous les produits chimiques, réglez le pH à 7,0 avec une solution molaire d’hydroxyde de sodium.Distribuez le milieu fraîchement préparé dans des bouteilles de sérum de 125 millilitres, versant 60 millilitres de milieu dans chaque bouteille. Bullez l’azote dans le milieu pendant 30 minutes pour enlever l’oxygène dissous à l’aide du petit tube relié à la station d’azote. Placez un bouchon en caoutchouc butyl sur chaque bouteille, en laissant une petite ouverture pour permettre à l’excès de gaz de sortir de la bouteille.Après 30 minutes, sertir chaque bouteille avec le bouchon préparé et un joint en aluminium. Le joint en aluminium garantit que la bouteille reste scellée pendant le reste du protocole. Déconnecter les aiguilles et les tubes minces de la station d’azote et les remplacer par des aiguilles propres.Ajustez les vannes du réservoir d’azote de sorte qu’un flux de gaz doux et continu sorte du réservoir. Maintenant, insérez l’une des aiguilles reliées au réservoir d’azote dans une bouteille de milieu à travers le bouchon en caoutchouc. Insérez immédiatement une autre aiguille propre dans la même bouteille.Répétez cette étape pour les autres bouteilles, et laissez couler l’azote pendant environ 30 minutes pour remplacer l’air dans les bouteilles par de l’azote. Après 30 minutes, déconnecter une bouteille de la station d’azote en enlevant l’aiguille correspondante. Attendez quelques secondes jusqu’à ce que la pression dans la bouteille de milieu diminue à la pression atmosphérique, et retirez la deuxième aiguille.Répétez cette étape pour toutes les bouteilles restantes. Pour préparer 120 millilitres de milieu de croissance semi-soluble pour MSR-1, recouvrez le bécher de papier d’aluminium et autoclavez la solution préparée comme décrit dans le protocole textuel. Juste avant la fin du cycle de l’autoclave, préparer une solution fraîche de cystéine de 4% et ajuster le pH à 7,0 avec une solution d’hydroxyde de sodium cinq molaire, tel que décrit dans le protocole de texte.Après l’autoclaving, laisser refroidir le milieu à 50 à 60 degrés Celsius, et amener le bécher sous la flamme d’un brûleur Bunsen. Retirer le papier d’aluminium et ajouter rapidement les produits chimiques énumérés dans le protocole texte à l’aide de techniques stériles tout en remuant doucement. Ajouter 1,2 millilitres de solution de cystéine stérilisée filtre.Après l’ajout de tous les produits chimiques, transférer le milieu chaud dans 16 millilitres stérile bouchon à vis Hungate tubes. Transférer 12 millilitres du milieu dans chaque tube et sceller les tubes. Pour inoculer les souches MSR-1, AMB-1 et MS-1 dans un milieu liquide, flammez le dessus de l’oxygène et des bouteilles moyennes fraîches en appliquant de l’éthanol sur les bouchons et en les passant à travers la flamme d’un brûleur Bunsen.À l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille, extraire un millilitre d’oxygène de la bouteille d’oxygène et la transférer dans la bouteille moyenne fraîche. Si vous utilisez l’inoculum d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, flammez les deux bouteilles. Puis inoculer un millilitre de la culture plus ancienne dans le milieu frais.Incuber la culture à 32 degrés Celsius, et l’inoculer dans un milieu frais après quatre à sept jours. Pour inoculer MSR-1 en gradient d’oxygène, milieu semi-solide, vérifiez que le tube de milieu frais affiche un OAI bien défini, matérialisé par une interface rose à incolore d’environ un à trois centimètres sous la surface du milieu. Si l’inoculum vient d’une autre culture semisolide de gradient de concentration d’oxygène, récoltez les bactéries en aspirant 50 microlitres de la culture avec une pointe stérile de pipette placée sur la bande formée par les bactéries.Inoculer lentement ces bactéries à l’OAI dans le milieu frais, en évitant de perturber l’interface. Sceller le tube et laisser les bactéries se développer entre 25 degrés Celsius et 30 degrés Celsius. Pour s’assurer que les bactéries sont à la fois magnétiques et modales, placez une goutte de culture sur le glissement de couverture du microscope.Retournez le bordereau de couvercle et installez-le sur un anneau O reposant sur une glissière en verre. Assurez-vous que la chute ne touche pas la glissière inférieure. Placez la goutte suspendue sous un microscope et concentrez-vous sur un bord de la gouttelette.Placez le pôle sud d’un aimant près de ce bord, et regardez les bactéries nager vers le bord. Retournez l’aimant pour les faire nager dans la direction opposée. On y voit les bouteilles de liquide avant l’inoculation et après la croissance bactérienne.La turbidité dans la deuxième bouteille indique que les bactéries se développent. Ce film deux fois accéléré montre le résultat attendu d’une expérience de chute suspendue pour une culture modale et magnétique des bactéries magnétoactiques. Les bactéries ont d’abord nagé vers le bord de la gouttelette lorsqu’un champ magnétique est appliqué.Lorsque la direction du champ de l’aimant est inversée, les bactéries ont nagé loin du bord où le champ magnétique est appliqué. On y voit des tubes de milieu semi-soluble avant l’inoculation et après la croissance bactérienne. Comme prévu, une bande de bactéries se forme à l’interface oxique-anoxique et migre au fil du temps à mesure que l’oxygène est consommé et que l’interface monte.On y voit un micrographe électronique représentatif d’un spirillum magnétique. La flagelle est indiquée par les flèches noires, tandis que les flèches rouges montrent les magnétosomes. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se rappeler que les bactéries magnétoactiques ont des besoins très spécifiques niveau d’oxygène afin à la fois de croître correctement et de produire du magnétosome.Ce protocole montre comment contrôler et surveiller les niveaux d’oxygène dans le média de croissance afin d’atteindre les micro-conditions privilégiées par ces organismes. Suivant cette méthode, des concentrations élevées de cellules saines et hautement magnétiques peuvent être obtenues. De cette façon, des expériences qui nécessitent de grandes quantités de bactéries peuvent être réalisées, telles que l’extraction du magnétosome, des études génomiques et génétiques, ou l’observation du mouvement collectif par microscopie.La possibilité de cultiver des bactéries magnétoactiques en laboratoire est vraiment ce qui a permis aux scientifiques d’explorer de manière systématique les propriétés biochimiques et physiques fascinantes de ces organismes.

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

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