Une Purification et analyse d’activité In Vitro pour un (p) ppGpp synthétase de Clostridium difficile

Nous décrivons ici une méthode pour la purification des enzymes pyrophosphokinase histidine-étiquetées et utilisant la chromatographie sur couche mince des substrats radiomarqués et produits pour le dosage de l' activité enzymatique in vitro. Le dosage de l’activité enzymatique est largement applicable aux kinase, cyclase de nucléotides ou réaction de transfert de phosphore dont le mécanisme comprend l’hydrolyse de nucléotides triphosphate.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les enzymes phosphotransfer, y compris la spécificité du substrat enzymatique et la cinétique de réaction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la collecte rapide de plusieurs ensembles de données qui sont très cohérents, permettant une quantification statistiquement robuste de l’activité enzymatique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle parce qu’il est beaucoup plus facile de démontrer que d’expliquer les réactions sur les plaques TLC et la quantification des espèces radioactives dans les réactions.

En plus d’Astha, la démonstration de la procédure sera Asia Poudel, un autre étudiant diplômé de mon laboratoire. Commencez ce protocole par une surexpression inductible d’une protéine étiquetée histidine telle que décrite dans le protocole de texte. Préparer un millilitre de résine d’acide nitriloacetic nickel dans une colonne gravitationnel pour purifier la protéine.

La veille de l’utilisation, équilibrer la colonne pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec deux millilitres de tampon d’équilibrage. Le lendemain, faites passer la colonne de quatre degrés Celsius à la température ambiante avant de charger le lysate clarifié et laissez-la reposer pendant environ deux à trois heures. Puis réutilisez la pastille dans le tampon de lyse.

Sonicate les cellules sur la glace pendant 10 fois intervalles de 10 secondes, s’arrêtant 30 secondes entre les impulsions. Clarifier le lysate par centrifugation à 3080 fois g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une microcentrifugeuse. Préparer le lysate clarifié avec des volumes égaux de tampon de lyse, puis appliquer le lysate préparé et clarifié à la colonne et recueillir le flux à travers.

Réappliquez le flux de lysate clarifié vers la colonne et recueillez le flux secondaire. Ensuite, lavez la colonne avec cinq millilitres de tampon de lavage un et de recueillir le flow-through. Lavez la colonne à nouveau avec cinq millilitres de tampon de lavage deux et de recueillir le flow-through.

Maintenant, appliquez deux millilitres de tampon d’élitution. Recueillir le débit en deux fractions d’un millilitre chacune. Lors de la purification des protéines, l’inclusion du chlorure de magnésium dans les tampons de purification, une modification du protocole du fabricant, est essentielle pour l’activité enzymatique.

Pour évaluer qualitativement la purification des protéines par SDS-PAGE, exécutez 20 aliquots de microlitres de toutes les fractions de colonne sur un empilement de 4%, 10% de gel polyacrylamide en cours d’exécution pendant 60 minutes à 170 volts. Tacher le gel avec 0,1%Coomassie bleu à température ambiante pendant cinq heures, berçant doucement sur un rocker benchtop. Puis detain le gel dans 40%méthanol-10% acide acétique glaciaire pendant la nuit à température ambiante, berçant sur le rocker benchtop.

Dialyze la fraction 2 éludée contre le tampon de dialyse à un rapport de 200:1 utilisant un dispositif de dialyse d’un millilitre avec un seuil de poids moléculaire de 20 kilodalton pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Déterminer la concentration d’échantillons de protéines dialysées en mesurant l’absorption à 280 nanomètres et en utilisant le coefficient d’extinction molaire calculé. Conserver les aliquots de 100 microlitres de l’échantillon de protéines dialysées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Avant d’effectuer la réaction, préparez des plaques de chromatographie à couche mince de cellulose de l’Île-du-Prince-Édouard en les lavant dans de l’eau déionisée. Placer les assiettes dans une chambre de verre avec de l’eau double-distillée à une profondeur d’environ 0,5 centimètres. Après avoir permis à l’eau de migrer vers le haut de la plaque, sortez les plaques de la chambre de verre et laissez sécher pendant la nuit sur un support de banc.

Marquez les plaques séchées à deux centimètres d’un bord à l’aide d’un crayon souple pour indiquer où les échantillons seront appliqués pour le TLC. Pour les échantillons de deux microlitres, appliquer des échantillons à pas moins d’un centimètre l’un de l’autre. Lors de la planification d’expériences, laissez toujours un endroit sur chaque plaque inutilisé pour servir de voie blanche pour la quantification de l’échantillon.

Pour effectuer l’analyse de l’activité enzymatique, préparez des réactions individuelles à l’aide du gamma P32 ATP tel que décrit dans le protocole de texte. Ajoutez le RSH après que les autres composants ont été mélangés, car l’ajout de RSH au mélange contenant du nucléotide initie l’analyse d’activité enzymatique. Pour contrôler l’hydrolyse ATP de contaminer l’activité nucléase, assemblez une réaction de 10 microlitres ne contenant aucune protéine et incubez-la en parallèle.

Spot échantillons de deux microlitres à T égale zéro et à la fin de l’expérience pour s’assurer que l’ATP n’a pas été hydrolysé en l’absence de protéines. Immédiatement après l’ajout de RSH, retirez deux microlitres et placez-les sur la plaque de cellulose de l’Île-du-Prince-Édouard étiquetée, car le T équivaut à un échantillon de zéro minute. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius, en enlevant les aliquots à deux microlitres aux points de temps désirés.

Après que tous les aliquots aient été rassemblés, exécutez la chromatographie mince de couche en remplissant la chambre de chromatographie avec le phosphate monobasique monobasic de 1.5-molaire de potassium à une profondeur de 0.5 centimètres. Plonger le bord inférieur de la plaque dans le solvant et laisser le solvant migrer vers le haut de la plaque pendant environ 90 minutes. Retirez la plaque du réservoir de chromatographie et placez-la sur un support de séchage benchtop pour sécher à l’air sec pendant la nuit.

Une fois la plaque sèche, envelopper la plaque dans un film plastique pour éviter le transfert de matières radioactives vers la cassette d’imagerie et analyser par autoradiographie. Exposez la plaque de cellulose de l’Île-du-Prince-Édouard contenant des réactions séparées à une cassette de phosphorimager pendant quatre heures à température ambiante. Après exposition, imagez la cassette sur un phosphorimager.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie avec une interface utilisateur graphique, dessinez des régions d’intérêt ou des ROM en sélectionnant d’abord Dessiner un rectangle, puis utilisez la souris pour dessiner des IA rectangulaires autour d’une voie entière et les taches ATP et guanosine-tétraphosphate contenues dans cette voie. Utilisez les commandes Select, Copy et Paste pour dessiner des IA identiques dans les autres voies afin de s’assurer que les ROM mesurent le signal dans des zones identiques dans chaque voie. Inclure les ROM d’une voie inutilisée à utiliser comme blancs.

À l’aide de l’analyse, des outils, du gestionnaire du retour sur investissement, ajoutez des commandes du logiciel d’imagerie, sélectionnez toutes les IA dessinées sur la plaque de cellulose de l’Î.-P.-É. Utilisez maintenant les commandes Analyze, Set Measurements, Measure pour quantifier l’intensité du signal dans chaque retour sur investissement et exporter les mesures comme un spreadsheeet. Dans la feuille de calcul, soustrayez les valeurs de retour sur investissement vierges des signaux expérimentaux.

Il est essentiel de convertir les données en synthétisation à pourcentage de guanosine-tétraphosphate, car cela garantit que les ensembles de données collectés à différents jours avec différents lots de protéines ou différents ATP gamma P32 sont cohérents et peuvent être mis en commun pour la rigueur statistique. Ce dessin animé montre comment les régions d’intérêt sont utilisées pour définir une voie qui contient le signal radioactif total dans un échantillon et les composantes radioactives ATP et guanosine tétraphosphate régions d’intérêt. Les signaux de tétraphosphate d’ATP et de guanosine sont normalisés au signal total plutôt que de déclarer les valeurs absolues parce que l’erreur de pipetage ou la décomposition du substrat radioactif peut affecter le signal total dans l’échantillon mais n’affectent pas l’activité enzymatique.

Il est indiqué ici une plaque TLC réelle d’une réaction effectuée à l’aide de C.difficile RSH purifié. Une réaction de contrôle ne contenant aucune protéine permet la quantification de l’hydrolyse ATP noncatalysée tandis qu’une voie blanche permet une quantification précise du signal. Dans les taches ATP et guanosine-tétraphosphate, l’enzyme transfère le phosphate radioactif du substrat ATP au précurseur du PIB, créant du tétraphosphate radioactif de guanosine.

Ceci confirme que la synthétase putative de tétraphosphate de guanosine de C.difficile est une enzyme active. En échantillonnant la réaction à intervalles réguliers, le progrès peut être observé. Ici, le signal brut est observé à chaque point de temps.

L’ATP diminue et le tétraphosphate de guanosine augmente. Voici les données normalisées. Les barres d’erreur sont beaucoup plus petites parce que la normalisation explique toute erreur de pipetage.

Tout en essayant cette procédure, il est important de faire attention à ne pas rayer la résine sur la plaque TLC, car cela peut interférer avec la migration des solvants. Il s’agit d’une technique très accessible avec une analyse directe des données qui peut rapidement fournir une quantification robuste de l’activité enzymatique. Nous l’avons utilisé pour confirmer que Clostridium difficile synthétise le tétraphosphate de guanosine, qui n’a jamais été signalé auparavant.

N’oubliez pas que travailler avec la radioactivité peut être extrêmement dangereux et vous devez suivre les règles de votre institution pour le stockage et l’utilisation des matières radioactives tout en effectuant cette procédure. Cette méthode peut fournir un aperçu de la synthèse du tétraphosphate de guanosine, mais elle peut également être appliquée à d’autres réactions de phosphotransfer, y compris l’activité de kinase protéique et la synthèse cyclique du diguanylate.