Analyse numérique de l'immunostaining de ZW10 Interagir les protéines dans les tissus pulmonaires humains

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le pathologique et l’immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique est que plus rapide et qui produit des médias numériques de haute qualité. Commencez par fixer un échantillon de tissu de kung de trois par trois centimètres dans 4%paraformaldéhyde pendant 24 heures à température ambiante.

Le lendemain, déshydrater le tissu dans des immersions ascendantes d’éthanol à température ambiante, suivie de trois immersions en 100% xylène pendant 20 minutes par traitement. Après la dernière immersion de xylène, placez le tissu dans la paraffine de 63 degrés Celsius pendant 30 minutes, suivi d’une deuxième immersion de 45 minutes dans la paraffine fraîche de 63 degrés Celsius, puis changez la paraffine une fois de plus pour une incubation finale d’une heure. Lorsque la paraffine s’est refroidie, utilisez un microtome rotatif pour acquérir cinq sections micrométriques d’épaisseur de l’échantillon de tissu intégré à la paraffine, capturant les sections sur des glissières poly-L-lysine de 20 microgrammes par millilitre.

Pour le déwaxing, placez les glissières dans un four à 65 degrés Celsius pendant deux heures, suivies d’une immersion dans le diméthylbenzene pendant 15 minutes et de trempage à 100% xylène pendant 15 minutes, puis réhydratez les diapositives dans une série descendante d’immersion d’éthanol. Pour la réparation des antigènes, placez les glissières dans une boîte antigène-réparation et ajoutez 300 millilitres de liquide de réparation d’acide citrique à la boîte. Chauffer la boîte dans un four à micro-ondes à puissance élevée pendant deux minutes, puis chauffer à basse puissance pour maintenir l’ébullition pendant six minutes.

Lorsque les glissières ont refroidi à température ambiante, lavez les échantillons de tissus avec trois lavages de 0,01 molaire PBS de cinq minutes dans un shaker rotatif à température ambiante. Pour éliminer la peroxyde endogène, incuber les glissières avec 3% de peroxyde d’hydrogène dans de l’eau double-distillée pendant 30 minutes dans une boîte humide à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les glissières comme démontré et branchez toute liaison non spécifique sur chaque section avec 100 microlitres de sérum de chèvre à 10 % pendant 39 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, étiquetez les tissus avec 100 microlitres d’anticorps anti-ZWINT par glissière à quatre degrés Celsius pendant la nuit, suivi de trois lavages en 0,01 molaire PBS. Après le dernier lavage, incuber les toboggans avec un anticorps secondaire approprié pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, suivi de trois lavages de 0,01 molaire PBS. Après le dernier lavage, ajouter les toboggans à 300 microlitres de DAB frais pendant 10 minutes, suivi d’un lavage de 10 secondes avec de l’eau du robinet à température ambiante.

Les compteurs tachent les tissus avec la solution de coloration d’hématoxyline pendant deux minutes à température ambiante, suivis du lavage dans l’eau du robinet pendant 15 minutes, puis déshydratent à nouveau le tissu dans des immersions ascendantes d’éthanol, suivis de deux immersions de 15 minutes dans le xylène à température ambiante. Après la dernière immersion 100% éthanol, monter les sections avec 15 microlitres d’un xylène de 5% dans la solution de gomme neutre et couvrir chaque échantillon de tissu avec un verre de couverture. Pour la numérisation automatique des sections à glissière entière, laissez d’abord sécher les glissières à température ambiante pendant 12 heures pour dessicquer les échantillons de tissus.

Ensuite, dans le scanner automatique à glissière entière, sélectionnez Brightfield manuellement et entrez l’interface de numérisation manuelle. Révisons le nom des diapositives et sélectionnez un chemin de stockage pour les images. Définissez la zone de numérisation et sélectionnez les échantillons d’analyse à l’aide de l’option Seuils définis par l’utilisateur.

Le seuil est d’environ 50 avec une valeur d’expansion de la zone de balayage de 200 micromètres. Définissez la valeur de mise au point de balayage et sélectionnez le mode Mise au point automatique et single layer, puis chargez les diapositives sur le poste de travail et démarrez la numérisation automatique. Lorsque toutes les diapositives ont été numérisées, enregistrez les images pour une analyse ultérieure.

Pour analyser les images des sections des tissus pulmonaires, ouvrez le logiciel histopathologique d’analyse d’image et sélectionnez Local Computer pour ouvrir le fichier avec les données de numérisation. Sélectionnez le niveau de zoom approprié et utilisez Toggle Color Adjust pour définir la couleur au contraste optimal, puis encerclez et nommez les régions d’intérêt sur chaque image. Ensuite, sous plugins, sélectionnez QC. Le scenario builder apparaîtra.

Sélectionnez Density Quant et ajustez la barre de détection. Ajustez les niveaux de score jusqu’à ce que l’intensité de coloration des zones encerclées soit similaire à celle des images originales, et stockez et nommez le modèle comme un nouveau fichier, puis appliquez le modèle à d’autres diapositives et sélectionnez Annotation sélectionnée pour laisser le logiciel calculer automatiquement le score APE pour les régions d’intérêt pour chaque image. Le balayage numérique de glissière entière des sections de tissu de poumon de tumeur et des tissus non tumoraux adjacents des spécimens non-petites cellules de cancer de poumon produit des images numériques d’une qualité élevée.

Les scores des APE calculés à partir de ces types d’échantillons de cancer du poumon sont généralement significativement plus élevés que ceux déterminés pour les tissus non cancéreux adjacents. En outre, les niveaux d’expression de ZWINT dans les sections squamous-cellule de tissu de carcinome sont fréquemment déterminés pour être sensiblement plus élevés que ceux mesurés dans des échantillons de tissu d’abnocarcinome. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de se préparer avec la haute qualité des secteurs de tumeur ou de tumeur pendant le balayage pathologique.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes de la microscopie peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions. Ni la méthode ou la méthode différente pour la numérisation pathologique. Après cette technique a ouvert la voie pour les chercheurs dans le domaine de la numérisation pathologique pour explorer le diagnostic numérique dans le but de recherche.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que des masques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.