In Vitro Méthode de contrôle des Concentrations de gaz halogénés en cellules épithéliales alvéolaires
23 octobre 2018
Les auteurs décrivent un protocole facile, spécialement conçu pour atteindre des concentrations précises et contrôlées du sévoflurane ou isoflurane le in vitro afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions épithéliales pulmonaires et de tester les roman traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aiguë.
Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de la recherche sur les lésions pulmonaires et la réparation, comme l’essai de l’adjonction halogène comme thérapies novatrices potentielles pour le syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le principal avantage de cette technique est qu’elle repose sur une méthode très simple pour la culture des cellules et les exposer à des agents halogènes afin d’atteindre des concentrations précises et contrôlées. Pour construire la chambre hermétique, utilisez une boîte hermétique en polypropylène d’une capacité de 6,5 litres.
Percer un trou de 2,5 centimètres de diamètre sur le côté inférieur de la paroi latérale de la boîte. Insérez ensuite un tube ondulé avec une marque verte qui servira de tuyau d’entrée de mélange d’air gazeux. Et scellez-le avec du silicone.
Ensuite, percer un deuxième trou avec un diamètre de 2,5 centimètres sur le côté supérieur de la paroi latérale opposée. Insérez un autre tube ondulé avec une marque rouge et connectez-le avec un filtre à charbon de bois qui servira de tuyau de sortie du mélange d’air gazeux. Ensuite, scellez-le avec du silicone.
Percez ensuite un trou serré d’un diamètre de quatre millimètres au centre du mur. Insérez le tube à perfusion courte qui est relié à un collecteur avec une serrure de leurre mâle rotatif. Branchez-le à un analyseur de gaz et scellez-le avec du silicone.
Placez ensuite un thermomètre numérique à l’intérieur de la chambre hermétique. Sous un capot extracteur de laboratoire, personnalisez un circuit de machine anesthésique pour changer la ligne de gaz d’oxyde nitreux par le dioxyde de carbone. Insérez un humidificateur chauffé dans le tuyau entre la machine anesthésique et la chambre hermétique pour réchauffer le mélange de débit de gaz à environ 37 degrés Celsius.
Branchez la chambre hermétique avec le tube ondulé vert marqué dans le circuit personnalisé de machine anesthésique. Ensuite, placez la chambre hermétique sur une plaque chauffante fixée à 37 degrés Celsius. Placer une plaque de six puits contenant des cellules épithéliales alvéolaires humaines dans la chambre hermétique et sceller le couvercle.
Réguler le débit de gaz pour obtenir rapidement 5% de CO2. Ouvrez ensuite l’évaporateur d’agent halogène et ajustez le pourcentage désiré. Une fois que les valeurs cibles sont atteintes, réduisez le débit de gaz frais à un litre par minute.
La chambre hermétique peut être maintenue avec ce débit de gaz aussi longtemps que nécessaire pour l’expérience. Les cours des concentrations de sevoflurane et d’isoflurane dans le milieu étaient semblables au fil du temps. Immédiatement après que la concentration requise d’agent halogène a été réglée, les concentrations ont augmenté au cours de la première heure.
Un plateau a alors été atteint qui a persisté jusqu’à ce que l’administration de l’agent halogène ait été arrêtée. Après interruption de l’administration, les concentrations ont diminué en moins d’une heure. On y voit les fractions d’agent halogène au fil du temps dans la chambre hermétique mesurée par l’analyseur de gaz.
Cette procédure est relativement peu coûteuse et très facile à adopter même lorsque les chercheurs n’ont jamais manipulé une chambre hermétique auparavant. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la quantification des protéines et de l’ARN, l’immunofluorescence, la mesure de la perméabilité des protéines et le transport gratuit peuvent être effectuées afin de répondre aux questions sur les effets spécifiques des agents halogènes pendant les lésions pulmonaires épithéliales et sa résolution. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie à la recherche dans le domaine du syndrome de détresse respiratoire aiguë pour étudier davantage le mécanisme impliqué dans les lésions pulmonaires épithéliales pendant ards et pour tester de nouvelles thérapies.
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Aperçu
Cet article présente un protocole simple permettant d'obtenir des concentrations précises de sévoflurane ou d'isoflurane in vitro. La méthode vise à améliorer la compréhension des mécanismes de lésion épithéliale pulmonaire et à évaluer de nouvelles thérapies pour le syndrome de détresse respiratoire aiguë.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Médecine respiratoire
- Pharmacologie
Contexte
- Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection critique nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques.
- Les agents halogénés tels que le sévoflurane et l'isoflurane pourraient présenter un potentiel dans le traitement des lésions pulmonaires.
- La compréhension des mécanismes des lésions pulmonaires est essentielle au développement de traitements efficaces.
- Cette étude porte sur une méthode permettant de contrôler l'exposition à ces agents en milieu de laboratoire.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour l'étude des lésions pulmonaires et de la réparation.
- Évaluer des composés halogénés comme traitements potentiels du SDRA.
- Approfondir la compréhension des mécanismes des lésions épithéliales pulmonaires.
Méthodes utilisées
- Construction d'une chambre étanche à l'aide d'une boîte en polypropylène hermétique.
- Perçage d'un trou pour l'entrée du mélange gazeux et obturation avec du silicone.
- Techniques de culture cellulaire pour exposer les cellules à des agents halogénés.
- Obtention de concentrations contrôlées de sévoflurane ou d'isoflurane.
Résultats principaux
- La méthode permet un contrôle précis de la concentration des agents halogénés.
- Elle facilite l'étude des mécanismes de lésion pulmonaire in vitro.
- Elle fournit une plateforme pour tester de nouvelles thérapies contre le SDRA.
- Elle démontre la simplicité et l'efficacité du protocole.
Conclusions
- Le protocole développé constitue un outil précieux pour la recherche sur les lésions pulmonaires.
- Il ouvre des perspectives pour explorer de nouvelles options thérapeutiques dans le traitement du SDRA.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour valider les résultats et explorer les applications cliniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthode permet un contrôle précis in vitro des concentrations de gaz halogénés afin d'étudier les mécanismes de lésion épithéliale pulmonaire dans le SDRA. Elle offre une plateforme reproductible pour évaluer de nouvelles thérapies ciblant les lésions alvéolaires et l'inflammation. L'approche soutient la validation précoce des cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments pulmonaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques impliquant des agents halogénés dans les voies de lésion pulmonaire.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système standardisé pour la validation fonctionnelle de cibles liées aux réponses épithéliales aux agents anesthésiques.
- Valeur prédictive : Renforce la fiabilité prédictive en fournissant des données quantifiables et résolues dans le temps sur la concentration dans le milieu de culture.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour un criblage de composés en aval à l'aide d'une exposition contrôlée aux gaz.
- Reproductibilité : Garantit des concentrations stables du sévoflurane et de l'isoflurane dans le milieu, permettant une évaluation fiable des composés.
- Extensibilité : Utilise un dispositif simple et étanche, adapté aux formats de plaques multi-puits et aux expériences répétées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise une lésion de l'épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques pertinentes pour la physiopathologie du SDRA.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro à la validation préclinique en définissant des seuils d'exposition associés à des effets biologiques.
- Progression adaptée au risque : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en établissant des relations concentration-effet pour le criblage de la sécurité et de l'efficacité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'interaction avec la cible à l'optimisation du composé précurseur, en particulier pour les thérapeutiques pulmonaires ciblant les voies inflammatoires et lésionnelles.
- Découverte en biologie : Permet de tester l'hypothèse selon laquelle des agents halogénés modulent les mécanismes de lésion et de réparation épithéliales.
- Écrantage : Permet la standardisation des tests grâce à des concentrations gazeuses stables et mesurables en phase liquide dans le temps.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives de variables dépendantes (par exemple, concentration dans le milieu en mg/L) par spectrométrie de masse des gaz, permettant la comparaison des conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la dynamique d'exposition et les effets biologiques, favorisant une continuité préclinique alignée sur les biomarqueurs.
- Réutilisation institutionnelle : Offre une plateforme réutilisable et peu coûteuse pour des tests itératifs de thérapeutiques basées sur des anesthésiques ou des gaz, dans divers projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les modèles de lésions pulmonaires en fournissant des conditions d'exposition aux gaz contrôlées et reproductibles.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à un design de chambre étanche et à une surveillance en temps réel des gaz.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une élimination précoce des risques associés aux adjuvants halogénés avant des études in vivo coûteuses.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats médicaments pulmonaires grâce à un profilage défini de la relation exposition-réponse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire à l'interface air-liquide et en systèmes de manipulation des gaz.
- Suppose l'accès à des circuits de machine anesthésique, à des analyseurs de gaz et à la spectrométrie de masse pour la validation des concentrations dans le milieu.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'exposition, des techniques d'étanchéification et des contrôles environnementaux (37°C, 5 % CO2).
- Implique des adaptations selon les types cellulaires, les formats de plaques et les agents halogénés autres que le sévoflurane et l'isoflurane.
- Les limitations pratiques incluent les contraintes liées au volume des chambres et le temps d'équilibration (~1 heure) nécessaire pour atteindre des concentrations stables dans le milieu.
