Name: In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez un dosage robuste d'agrégation de la protéine Tau pour l'étude des tauopathies et le dépistage de médicaments. Cette méthode utilise des protéines recombinantes pures et un lecteur de microplaques multimodal.

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Les auteurs tiens à remercier Hector Quirante d’expression et purification de huTau441, Hanna Inganäs et Margot van Winsen excellent support technique et Martin Koldijk pour l’analyse des données.

1. préparation du réactif
<ol><li>
Tampon de réaction
	<ol>
<li>Préparer le tampon de réaction : 0,5 mM TCEP dans du PBS, pH 6,7 en dissolvant la poudre sèche TCEP (MW = 286.65 g/mol) dans PBSstock, pH 7,4. Remarque : La présence de PTCE est due à combler les études d’agrégation à l’aide de la protéine tau de type sauvage qui contient des cystéines. Dans le protocole actuel, PTCE n’est utilisé pour ajuster le pH de PBS de 7,4 à 6,7 et ne joue aucun rôle dans la régulation des réactions d’oxydo-réduction.</li>
		<li>Bien mélanger et filtrer la solution avec un filtre à membrane stérile 0,22 μm pore taille PES.</li>
		<li>Aliquote et les conserver à-80 ° c.</li>
		<li>Dégel sur le banc et se stabiliser à RT avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Supprimer huTau441 (pour voir d’expression et purification de protéine Apetri et al. 24) du congélateur de-80 ° c.</li>
		<li>Dégel sur le banc et est proportionnelle à la température ambiante (RT).</li>
		<li>Tourner le tube avec un stock de protéines pendant 5 min à 12 000 x g à 20-25 ° c pour éliminer les bulles d’air.</li>
		<li>Mesurer la concentration de huTau441by d’absorption à 280 nm en utilisant un coefficient d’extinction du mL 0,31 mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thioflavine T
	<ol>
<li>Préparer 500 μM thioflavine T (ThT) solution en dissolvant 10 mg de poudre sèche de ThT (MW = 318.86 g/mol) dans 35 mL de tampon de réaction.</li>
		<li>Mélanger soigneusement, vortex 3 fois pendant 20 secondes à vitesse maximale et filtrer la solution avec un stérile filtre à membrane 0,22 μm pore taille PES.</li>
		<li>Déterminer la concentration en mesures d’absorption à 411 nm en utilisant un coefficient d’extinction de 22 000 M-1 cm-1 et ajuster la concentration ThT à 500 μM. Conserver à la RT abri de la lumière. Préparer frais tous les 2 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Héparine
	<ol>
<li>Préparer une solution fraîche de l’héparine 55 μM en dissolvant 1 mg de poudre sèche de l’héparine HMW (MW = 17-19 kDa) dans 1 mL de tampon de réaction à température ambiante.</li>
		<li>Agiter vigoureusement et vortex 2 fois pendant 5 secondes.</li>
		<li>Filtrer la solution à travers un filtre de membrane en PES stérile 0,20 μm pore taille (seringue).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mode continu ThT agrégation analyse sur un lecteur de microplaques multimode
NOTE : Colorant ThT est ajouté à la réaction de suivre la cinétique de l’agrégation de huTau441 en mode continu (mesures automatiques). Bien que la réaction peut être suivie d’un fluorimètre régulière à l’aide d’une cuvette conventionnelle, la nature manuelle de l’opération limite la fréquence des mesures et compromet l’exactitude des courbes cinétiques enregistrés. Pour cette raison, un lecteur de microplaques de multimode automatique est utilisé.
<ol><li>
Instrument mis en place
	<ol>
<li>Allumez l’ordinateur et le lecteur de microplaque multimode. Laissez l’appareil se stabiliser pendant 10 minutes.</li>
		<li>Lancez le logiciel et l’élaboration d’un protocole.<ol>
<li>Sélectionnez le type de protocole : protocole standard (réduction des données est effectuée indépendamment pour chaque plaque).</li>
			<li>Réglez la température à 37 ° c, puis sélectionnez preheatment avant de continuer le protocole.</li>
			<li>Définir le terme cinétique : durée 50 h de fonctionnement / intervalle de mesure : 15 min.</li>
			<li>La valeur orbitale secouant à 425 cpm (3 mm) en mode continu.</li>
			<li>Sélectionnez la méthode de lecture : Fluorescence intensité point de terminaison/cinétique - monochromateurs longueurs d’onde : Excitation 440 nm (bande de 20 nm) / émission 485 nm (bande de 20 nm) - optique position : haut - Normal vitesse - Read hauteur : 4.50 mm</li>
			<li>Lancer l’exécution en utilisant le protocole créé. Nommez l’expérience, sélectionnez la destination du fichier nouvellement créé, puis laissez l’instrument s’avance est proportionnelle à la température désirée.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Conversion de huTau441 spontanée
	<ol>
<li>Préparation des échantillons de réaction dans un tube de 1,5 mL. Utilisation 200 μL mélange par réaction et au moins 4 répétitions (réplique de volume réactionnel pour 4 = 800 μL).</li>
		<li>Mélanger 800 μL réaction d’échantillon (en cas de 4 réplique) contenant 15 μM huTau441, 8 héparine μM et 50 μM ThT. Start en mélangeant de la protéine avec le tampon de réaction, ajouter l’héparine et ThT et mélanger bien en pipettant également monter et descendre 5 fois. Respecter l’ordre indiqué pour l’addition du réactif.</li>
		<li>Tissent des échantillons à 12 000 x g et 25 ° c pendant 5 min éliminer les bulles d’air.</li>
		<li>Ajouter 200 μL d’échantillon de réaction par puits dans des microplaques 96 puits (puits-volume 360 μL, Microplaque 96 puits noir de solide, fond plat). Eviter la formation de bulles d’air.</li>
		<li>Sceller la microplaque pour éviter l’évaporation.</li>
		<li>Placer la microplaque en lecteur de microplaques multimode et commencer les mesures.</li>
		<li>À l’issue de l’expérience, retirer la plaque du matériel et exporter des données vers un logiciel de traitement de données.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contrôle de la qualité de la conversion, de collecte de semences et de stockage.
	<ol>
<li>Retirer l’enduit de la plaque et mettre en commun les différents réplicats en tubes de 1,5 mL. Bien mélanger l’échantillon groupé dans les puits de pipetage de haut en bas 2 fois avant de recueillir ce. Agrégats ont tendance à se déposer sur le fond du puits.</li>
		<li>Mélanger soigneusement en les 1,5 mL de tube de pipetage et descendre 5 fois et ajouter 10 à 20 μL sur une surface de mica pour analyser les agrégats par AFM (pour plus de détails voir Apetri et al. ( 24).</li>
		<li>Récolter les agrégats en faisant tourner le tube de 1,5 mL à 20 000 x g et 4 ° c pendant 1 heure. Agrégats forment une boulette.</li>
		<li>Séparer et analyser le liquide surnageant par S-MALS pour confirmer l’absence de tau monomère dans l’échantillon, ce qui indique une conversion réussie en agrégats (pour plus de détails, voir Apetri et al. ( 24).</li>
		<li>Le tube de 1,5 mL contenant les agrégats restants (pellet) indiquant la concentration de protéines huTau441 initiale et le volume d’échantillon de l’étiquette. Clin d’oeil geler les agrégats et les conserver à-80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Réaction de semis
	<ol>
<li>Enlever les agrégats huTau441-80 ° c congélateur. Ajouter le volume de tampon de réaction indiquée sur l’étiquette (volume de l’échantillon initial) et laisse le tube se stabiliser pour RT. remettre en suspension les agrégats en pipettant également, haut et bas de 5 à 8 fois.</li>
		<li>Laisser agir l’échantillon groupé. Pour un échantillon de 200 μL (huTau441 de 15 μM), laisser agir sur la glace à l’aide d’un 1/8" microtip (de 100 μl à 10 mL) pour une durée totale de 15 s en utilisant des impulsions de 1 s et fait une pause de 2 s à 30 % amplitude (sonicateur 250 Watts). Échantillon de rééquilibrer RT. Remarque : Les conditions de sonication indépendants mènent à une population homogène des fibrilles de tau avec des longueurs de 20 à 50 nm24.</li>
		<li>Préparation des échantillons de réaction dans des tubes de 1,5 mL. Utilisation 200 μL mélange par réaction et au moins 4 répétitions (réplique de volume réactionnel pour 4 = 800 μL).</li>
		<li>Mélanger 800 μL d’échantillon réaction contenant 15 μM huTau441, 8 héparine μM et 50 μM ThT. Start en mélangeant de la protéine avec le tampon de réaction, ajouter l’héparine et ThT et mélanger bien en pipettant également monter et descendre 5 fois. Respecter l’ordre indiqué pour l’addition du réactif.</li>
		<li>Tissent des échantillons à 12 000 x g et 25 ° c pendant 5 min éliminer les bulles d’air.</li>
		<li>Ajouter 200 μL d’échantillon de réaction / puits à 96 puits (puits-volume 360 μL, Microplaque 96 puits noir de solide, fond plat). Eviter la formation de bulles d’air.</li>
		<li>Homogénéiser soigneusement l’échantillon de fibrilles préformées par répétitif vers le haut et vers le bas de pipetage (5 fois) et ajouter à chaque puits le montant correspondant au pourcentage désiré de graines. Pour un bien montant record de 200 μL, 2 μL d’addition de semences préformé est un 1 % (v/v). Mix en pipettant également monter et descendre 3 fois lors de l’ajout dans le puits et éviter la formation de bulles d’air.</li>
		<li>Sceller la microplaque pour éviter l’évaporation.</li>
		<li>Placer la microplaque en lecteur de microplaques multimode et commencer les mesures.</li>
		<li>Retirer la plaque du matériel et exporter les données vers une feuille de calcul.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
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<li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease%3A+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li>
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<li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li>
<li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li>
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<li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li>
<li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li>
<li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li>
<li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li>
<li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li>
<li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Malgré de nombreux efforts, la cinétique de l’agrégation de tau rapportées dans la littérature à l’absence de date le niveau désiré de reproductibilité et/ou certaines des caractéristiques d’une nucléation polymérisation dépendante19,20,21 , 22 , 23 , 25. c’est souvent accentué par l’absence d’une phase de latence, le semis inefficace et la nature non fibrillaire des agrégats de tau. La raison de ces lacunes peut varier et comprend la qualité des protéines tau sous-optimal (fragmentation, présence d’agrégats, faible pureté, etc..), choix de protéines et induisant des réactifs et ou les conditions expérimentales. Un autre facteur de complication sont les deux résidus de cystéine situés autour de l’interface d’agrégation tau qui peuvent former intra - ou inter - des ponts disulfure moléculaire selon l’environnement d’oxydo-réduction et affectent l’efficacité de l’agrégation de tau. Dans la plupart des approches réduisant les réactifs tels que TNT ou PTCE ont été utilisées pour maintenir les résidus de cystéine dans formes réduites et ainsi augmenter les niveaux de reproductibilité25. En outre, le coefficient d’extinction du tau est très faible qui conduit à des difficultés pour des mesures précises de concentration de la protéine.
Nous nous sommes concentrés surtout sur quelques paramètres et attributs de qualité que nous avons considéré cruciales pour un profil robuste, reproductible et représentatif de l’agrégation de la protéine tau : éliminer la possibilité d’intra - et inter-formation de disulfure moléculaire, générer un monomère tau très pure et d’améliorer la précision de la détermination de la concentration. Tous ces réactifs associés questions sont des points d’attention possibles que nous avons jugés critiques pour le développement du dosage optimal. Pour résoudre ces problèmes, huTau441 pleine longueur a été exprimée avec deux mutations, C291A et C322A et avec des étiquettes de N - et C-terminale. Mutation des résidus cystéine a un impact minime sur la protéine tau, tout en éliminant les autrement très difficile de contrôler le pont disulfure. Exprimant la protéine avec des tags relativement courte N - et C-terminal nous a permis de poursuivre un protocole de purification d’affinité en deux étapes qui a conduit à très haute pureté, d’intégrité et contenu de monomère. En outre, nous avons introduit une mutation F8W qui augmente le coefficient d’extinction de la protéine et autorisé beaucoup plus précis de mesures de concentration24.
En utilisant des réactifs de protéines de haute qualité, plus d’autres paramètres de dosage ont été également optimisés. Le tau optimale : ratio de l’héparine a été identifiée comme étant environ 0,5 (M/M) qui s’inscrit dans les études déjà publiées,26. En outre, mécaniques et optiques des paramètres instruments sont cruciales pour assurer la reproductibilité et les paramètres optimaux peuvent différer dans une certaine mesure selon le fabricant.
L’agrégation de tau décrit dans ce test montre des caractéristiques qui sont associés à la pathogenèse de tau dans AD et associés tauopathies. Le processus commence par une phase de latence initiale correspondant à la formation des noyaux de haute énergie et est suivi d’une phase de croissance rapide qui correspond à la croissance de la fibrille. Le temps de latence est suffisamment long pour ouvrir une fenêtre large afin d’étudier en détail le processus d’amorçage couvrant une large gamme de concentrations (Figure 5) alors que c’est pas encore trop longtemps afin d’évite la dégradation des protéines et/ou l’agrégation non spécifique de la graine (Figure 2). ces événements secondaires pourraient se produire en particulier lorsqu’une protéine intrinsèquement désordonnée comme huTau441 est exposée pendant de longues périodes de temps à des conditions physiologiques. L’affichage d’agrégats de tau obtenus la morphologie de FHJ isolée du cerveau des patients atteints de ma et sont très efficaces en recrutement tau monomère et convertissant en reprenant générée agrégats, un processus dénommé ensemencement. L’essai est très reproductible, la courbe cinétique étant pratiquement impossible à distinguer entre les puits, runs expérimentaux et des lots de protéines. Bien que le dosage en cours ne porte que sur la plus longue isoformes tau, huTau441, l’application peut être adaptée à l’étude de la conversion d’autres formes de tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica Communications, sous presse) en outre, elle permet des études mécanistes axé sur l’interaction des isoformes tau et éventuellement faire la lumière sur les différences entre la pathogenèse tau dans AD où les 3R et 4R isoformes sont présents dans FHJ et de PICK de maladie ou de la démence frontotemporale où la pathologie tau contient principalement 3R et 4R tau isoformes, respectivement le27.
La très haute reproductibilité du dosage doit permettent aux lecteurs de mettre en œuvre avec une relative facilité à leurs paramètres de laboratoire spécifique. Le dosage imite ce qu’on croit être la en vivo mauvais repliement et l’agrégation de tau, ce qui permet des études mécanistes qui éclairent tau pathogenèse et il constitue un outil précieux pour la présélection des candidats-médicaments et évaluer leur interférence avec les différentes étapes du processus de pathogenèse.

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative dévastateur qui désigne l’examen histopathologique par l’accumulation de plaques séniles extracellulaires d’agrégation amyloïde bêta1 et des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires contenant agrégées hyperphosphorylée tau protein2. Tau physiologique est monomérique et présentée comme six isoformes uniques contenant 0-2 inserts bornes N et liaison de microtubules 3 ou 4 domaines3,4 découlant de l’épissage alternatif et une moyenne de 2-3 phosphorylations. On croit que hyperphosphorylée, mauvais repliement et auto-agrégation fibrillaire structures constituent les éléments clés dans la pathogenèse de tau, telle qu’évaluée pathologiquement personnes démentes5,6.
Les enchevêtrements de tau neurofibrillaires agrégées sont une caractéristique non seulement pour AD, mais aussi pour les autres tauopathies, y compris la dégénérescence lobaire fronto-temporale (FTLD), maladie de Pick, paralysie supranucléaire progressive (PSP), démence fronto-temporale (DFT) et primaire liée à l’âge tauopathy (partie)2. D’un point de vue biochimique, comprendre le mécanisme de tau mauvais repliement et l’agrégation pourrait faire la lumière sur les processus pathologiques associés à annonce et autres tauopathies. Outre l’aspect scientifique, robuste en vitro agrégation tests sont des outils précieux pour le dépistage des drogues candidats7,8,9,10. On croit que l’agrégation de tau suit une nucléation dépendant de polymérisation processus (NPD)11,12,13,14. La cinétique du NPD est sigmoïde et commence par une étape de nucléation énergétiquement défavorable suivie d’un processus d’agrégation descente rapide énergiquement.
Contrairement aux autres protéines amyloïdogène, y compris de la protéine prion, la protéine bêta-amyloïde et le α-synucléine, tau ne s’agrège pas spontanément dans des conditions physiologiques et pHs voire extrême ou hautes températures sont non propice pour agrégation15. C’est très probablement en raison des interactions hydrophylic présentes dans l’interface de l’agrégation de tau. Cependant, tau agrège efficacement à des concentrations physiologiques lorsqu’on utilise des inducteurs tels que l’héparine16 ou autres polyanions17,18 .
Les efforts antérieurs de mettre en place en vitro tau agrégation dosages ont nous éclairer sur les détails de la mauvais repliement tau et de l’agrégation, mais ils sont courts d’imiter ce qu’on croit être la cinétique de l’agrégation en vivo tau. Dans la plupart des cas, la cinétique de l’agrégation de tau était absente de la phase de latence initial associée de nucléation de tau. Cela aurait pu être la conséquence de l’utilisation de concentrations de protéine tau très élevé, présence d’agrégats dans les préparations de protéines tau départ et/ou l’utilisation de fragments de tau avec beaucoup propension d’agrégation plus élevée que le tau de pleine longueur plus physiologique protéines19,20,21,22,23. En outre, des études antérieures n’a pas abordé la reproductibilité et l’aspect de robustesse de la cinétique de l’agrégation de tau.
Nous décrivons ici une robuste essai in vitro tau agrégation avec qui imite les caractéristiques principales d’une polymérisation dépendant de nucléation avec une phase de latence initiale correspondant à la nucléation de tau, suivie d’une phase de croissance exponentielle. En outre, les agrégats de tau recombinant générées sont fibrillaires dans la nature et ont une très forte puissance de semis. Le test est très reproductible aussi entre les lots de tau et représente un outil précieux pour dépister les inhibiteurs de l’agrégation.

<table><tbody><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516-5G</td><td>poudre sèche (Mw = 318,86 g/mol)</td></tr><tr><td>Héparine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>poudre sèche (Mw = 17-19 kDa)</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259-1G</td><td>poudre sèche (MW= 286,65 g/mol)PBS</td></tr> <tr><td></td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Stérile, pH 7,4 (1X)</td></tr><tr><td>0,22 &mu ; m filtre stérile</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>membrane PES&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,20 &mu ; m filtre à serynge stérile</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>membrane PES&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microplaques 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502867</td><td>Noir, botton plat</td></tr><tr><td>Scelleuses de microplaques&nbsp ;</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>Bandes adhésives&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques multimode Synergy Neo2</td><td>Biotek</td><td>Synergy Neo2</td><td>Hybrid Technology, Gen5</td></tr><tr><td>Software Eppendorf Tubes</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>0030 120.086</td><td>Tubes de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Ultrasons-Branson SFX250</td><td>Branson</td><td>101-063-966R</td><td>1/2 » Corne pleine et 1/8 » micro-pointe&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

in vitro dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine tau et de dépistage des drogues

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Agrégation de la protéine tau et de la formation de filaments hélicoïdaux appariés sont une caractéristique de la maladie d’Alzheimer et autres tauopathies. Par rapport aux autres protéines associées à des maladies neurodégénératives, la cinétique de l’agrégation signalées in vitro pour la protéine tau sont moins fiables présentant une variabilité relativement élevée. Nous décrivons ici le développement d’un test in vitro l’agrégation qui imite les étapes attendues associées à tau mauvais repliement et agrégation in vivo. Le test utilise l’isoforme de tau plus longue (huTau441) qui contient les insertions acides N-terminal ainsi que quatre domaines de liaison du microtubule (MBD). L’agrégation in vitro est déclenchée par l’ajout d’héparine et suivie en permanence par fluorescence thioflavine T dans un format 96 puits microplaque. L’essai de l’agrégation de tau est hautement reproductible entre les différents puits, runs expérimentaux et des lots de la protéine. L’agrégation mène à tau PHF morphologie qui est très efficace pour la formation de structures fibrillaires de novo de l’ensemencement. Outre son application dans l’étude du mécanisme de tau mauvais repliement et d’agrégation, le dosage en cours est un outil solide pour le dépistage de médicaments pouvant interférer avec la pathogenèse du tau.

HuTau441 recombinant contenant les mutations C291A et C322A et N-terminal C-terminal C-balises et son a été exprimé et purifiée comme précédemment décrit24. Les lots de huTau441 sont très purs que visualisées sur SDS-PAGE et pratiquement 100 % de monomères tels qu’évalués par S-MALS (Figure 1). L’agrégation de 15 µM huTau441 a été induite par l’ajout d’héparine HMW 8 µM et la réaction a été suivie en permanence par ThT fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques multimode. La longueur d’onde d’excitation est de 440 nm (bande passante 20 nm) alors que l’émission a été mesurée à 485 nm (bande passante 20 nm). L’essai est très reproductible, et les résultats de 10 puits individuels étant pratiquement impossible à distinguer (Figure 2 a). Les morphologies des agrégats positive huTau441 ThT ont été évalués après 50 h par l’AFM. Hutau441 groupé est un mélange homogène des structures fibrillaires de différentes longueurs similaires à déclarés ex vivo morphologies (Figure 2 b). En outre, le mélange réactionnel final ne contient-elle pas de monomère, suggérant une conversion complète en agrégats, comme en témoignent les mesures S-MALS (Figure 2). La cinétique de l’agrégation de huTau441 dans les essais expérimentaux indépendants sont très similaires, comme l’ont souligné les courbes sigmoïdes similaires et phases indiscernables de lag et de croissance (Figure 3). Le niveau élevé de reproductibilité est maintenu lors de différents lots de protéine sont utilisés (Figure 4). En outre, huTau441 préformé agrégats sont très efficaces dans le recrutement de monomère de tau et induire la formation d’agrégats de tau de novo . Quantités aussi faibles que 0,0025 % (v/v) d’agrégats de tau préformés sont capables de contourner la nucléation et la génération de déclencheur de fibrilles de novo (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figure 1 : huTau441 recombinante est monomérique et extrêmement pur. A) évaluation de la pureté dans des conditions sur un gel de SDS-PAGE 4-12 % dont l’échelle standard de protéines de poids moléculaire (en kDA) dénaturantes (voie 1) ; passer de l’étape finale de la purification du affinité C-tag (voie 2) ; colonne lavage fraction (3 voies), élué pic de protéine de huTau441, avant (4 voies) et après tampon change (voie 5), respectivement). B) analyse de S-MALS de la huTau441. Protéine montre &gt; 99,9 % monomère avec une masse molaire de 51 kDa et ne contient-elle pas d’agrégats ou fragments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figure 2 : agrégation de huTau441 recombinante est hautement reproductible et conduit quantitativement à structures fibrillaires. A) agrégation de huTau441 surveillée en continu au format bien Microplaque 96 par ThT fluorescence induite par cinétique d’héparine. Concentrations de huTau441 et de l’héparine sont de 15 µM et 8 µM, respectivement. Les 10 courbes individuelles correspondent à la conversion d’un même lot de protéine dans dix puits de la microplaque de même et se caractérisent par une phase de latence moyenne (avec SD) de 14,2 ± 0,38 h et t50 de 18,8 données cinétiques de la h. 0,40 ± était équipé d’un 5-paramètre logisti c courbe avec une diminution linéaire de l’asymptote supérieure. Décalage de phase et t50 ont été calculées par interpolation entre les valeurs prédites par régression linéaire. Phase de latence est calculé selon l’augmentation de 3 % du signal de fluorescence de ThT. Courbe d’ajustement et sommaires statistiques sont obtenues à l’aide de IBM SPSS statistics version 20.0.0.2. B). agrégats Tau montrent des morphologies PHF-like comme indiqué par imagerie de l’AFM à 50 h ; C). l’analyse S-MALS de monomère huTau441 (t = 0 h) et le liquide surnageant du mélange réactionnel à la fin de la réaction (t = 50 h). Au point h 50 temps le mélange réactionnel est centrifugé pendant 1h à 20 000 X g et 4 ° c et le surnageant a injecté sur S-MALS. La disparition de la crête de monomère confirme l’agrégation complete de tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figure 3 : le dosage de l’agrégation de tau montre haute reproductibilité entre les essais expérimentaux indépendants. Les deux panneaux d’affichage quatre traces de cinétique individuels pour l’agrégation spontanée huTau441 recueillis dans deux expériences indépendantes à l’aide du même lot de protéine huTau441. Concentrations de huTau441 et de l’héparine sont de 15 µM et 8 µM, respectivement. Cinétique se caractérisent par une phase de latence moyenne (avec SD) de 12,2 ± 0,18 h et t50 de 17,8 ± 0,8 h (course 1) et 11,6 ± 0,52 h et t50 de 17,8 ± 0,23 h (Run 2), respectivement. Données cinétiques était munies d’une courbe logistique 5-paramètre avec une diminution linéaire de l’asymptote supérieure. T-50 ont été calculées par interpolation entre les valeurs prédites par régression linéaire. Phase de latence est calculé selon l’augmentation de 3 % du signal de fluorescence de ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figure 4 : le test d’agrégation tau montre haute reproductibilité entre les différents lots de protéines huTau441. Chaque panneau présente que quatre réplicats correspondant à un lot spécifique huTau441. L’agrégation de chaque lot a été suivie en expériences indépendantes. Concentrations de huTau441 et de l’héparine sont de 15 µM et 8 µM, respectivement. Cinétique d’agrégation correspondant à la tau individuel quatre lots sont caractérisés par une phase de latence moyenne (avec SD) de 15,3 ± 0,38 h et t50 de 21,1 ± h 0,46 (lot 1) ; phase de latence de 12,5 ± 0,07 h et t50 de 19,8 ± 0,34 h (lot 2) ; retard de phase de 15,1 ± 0,34 h et t50 de 21,9 ± 0,86 h (lot 3) et décalage de phase de 11,5 ± 0,29 h et t50 de 17,8 ± 0,29 h (lot 4), respectivement. Données cinétiques était munies d’une courbe logistique 5-paramètre avec une diminution linéaire de l’asymptote supérieure. Décalage de phase et t50 ont été calculées par interpolation entre les valeurs prédites par régression linéaire. Phase de latence est calculé selon l’augmentation de 3 % du signal de fluorescence de ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figure 5 : hutau441 préformé agrégats ont élevé ensemencement activité. Pour lancer l’ensemencement, tau aux ultrasons agrégats ont été ajoutés à hutau441 de monomère. Du rouge au bleu, chaque couleur des cinétiques différentes courbes représente la quantité différente de graines ajoutés : 1,25 %, 0,63 %, soit 0,31 %, 0,16 %, 0,08 %, 0,04 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,005 % et 0,0025 % (v/v), respectivement. La conversion spontanée du hutau441 est représentée en noir. Toutes les conditions ont été testées en quatre exemplaires. Les quatre réplicats cinétiques associées à une certaine concentration de graines sont hautement reproductible et le plus souvent impossibles à distinguer. Concentrations de hutau441 et de l’héparine sont de 15 µM et 8 µM, respectivement. L’addition de petites quantités de structures fibrillaires aux ultrasons pré-formé élimine la phase de latence initiale observée dans la conversion spontanée et l’effet est proportionnel à la quantité de graines. Du rouge au bleu, la différence de t50 observée (t50 spont.conv-t50 semis) est de 18,9, 18,40, 17,8, 17,3, 16,6, 16,1, 15.4, 14,7, 14,2 et 13,7 heures, respectivement. La conversion spontanée du hutau441 est caractérisée par une moyenne t50 (avec SD) de 19,85 ± 0,54 h. données cinétiques a été monté avec une courbe logistique 5-paramètre avec une diminution linéaire de l’asymptote supérieure. t50 ont été calculées par interpolation entre les valeurs prédites par régression linéaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Le dosage de l’agrégation de tau décrit dans ce manuscrit imite les caractéristiques prévues en vivo tau mauvais repliement et d’agrégation.

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Le mauvais déroulement de la protéine Tau dans son auto-assemblage en filaments héliciques appariés est une caractéristique pathologique de la maladie d’Alzheimer et d’autres tauopathies. Ici nous présentons un essai robuste d’agrégation de Tau qui pourrait aider à élucider le processus de pathogénie de Tau. La conversion suit toutes les étapes d’un processus de polymérisation dépendant de la nucléation et est hautement reproductible, permettant le dépistage des médicaments dans un format plus rigoureux qui a atteint le niveau d’OSI à ce jour.La qualité des reagents est cruciale. Le Tau recombinant doit être très pur et dépourvu d’agrégats et de fragments. Allumez d’abord l’ordinateur et le lecteur de microplaque multimode.Après avoir permis à l’équipement de se stabiliser, démarrez le logiciel et sélectionnez protocole standard comme type de protocole. Réglez la température à 37 degrés Celsius et sélectionnez Préchauffage avant de poursuivre le protocole. Ensuite, réglez le temps de course cinétique à 50 heures et l’intervalle de mesure à 15 minutes.Réglez la secousse orbitale à 425 cycles par minute en mode continu. Par la suite, choisissez la méthode de lecture comme momochromators cinétiques de point de terminaison d’intensité de fluorescence. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 440 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 485 nanomètres, la position optique au sommet, et le gain à 80.Sélectionnez la vitesse normale de lecture et réglez la hauteur de lecture à 4,50 millimètres. Ensuite, validez et enregistrez le protocole. Démarrez l’exécuter à l’aide du protocole créé.Nommez l’expérience, sélectionnez la destination du fichier nouvellement créé et permettez à l’instrument de prééquilibrer à la température désirée. Pour une expérience spontanée de conversion de Tau recombinante, préparez un échantillon de réaction de 1000 microlitres avec 800 microlitres pour la fluorescence thioflavine-T, et 130 microlitres pour l’analyse SEC-MALS en mélangeant d’abord la protéine avec le tampon de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite l’héparine et le thioflavine-T et bien mélanger en faisant monter et descendre cinq fois.Il est important d’exécuter le protocole avec précision pour assurer une reproduction élevée, mélanger les réaccentrages dans le même ordre et rester dans les délais. Faites tourner l’échantillon à 12 000 x g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air. Après centrifugation distribuer 200 microlitres d’échantillon de réaction par puits dans une microplaque de 96 puits, en évitant la formation de bulles d’air.Ensuite, scellez la microplaque pour éviter l’évaporation. Placez la microplaque dans un lecteur de microplaque multimode. Sélectionnez la plaque complète, ou si la plaque n’est pas pleine, sélectionnez les puits à lire et commencez la mesure.Exportez les données vers un logiciel de traitement de données. Retirez ensuite la microplaque de l’équipement. Ensuite, retirez le scellant de la microplaque.Mélangez l’échantillon agrégé dans les puits en pipetage de haut en bas deux fois, et mettre en commun les différentes répliques dans des tubes de 1,5 millilitre. Mélangez soigneusement chaque échantillon en pipetage de haut en bas cinq fois, et distribuez 10 à 20 microlitres sur une surface de mica pour analyser les agrégats par microscopie de force atomique. Par la suite, récoltez les agrégats en faisant tourner chacun un tube de 1,5 millilitre à 20 000 x g et 4 degrés Celsius pendant une heure.Analyser le supernatant par SEC-MALS pour confirmer l’absence de Tau monomère dans l’échantillon, indiquant une conversion réussie en agrégats. Ensuite, retirez tous les supernatants restants et étiquetez le tube de 1,5 millilitre contenant les agrégats restants avec la concentration initiale de protéines Tau recombinantes et le volume de l’échantillon. Casser congeler les agrégats et stocker à 80 degrés Celsius.Pour une expérience ensemencée, retirez les agrégats tau recombinants du congélateur, ajoutez le volume de tampon de réaction indiqué sur l’étiquette et laissez le tube se stabiliser à température ambiante. Puis réutilisez les agrégats en faisant monter et descendre cinq à huit fois. Sonicate l’échantillon agrégé de 200 microlitres sur la glace à l’aide d’un microtip de 1/8 pouce pour une période totale de 15 secondes avec des impulsions d’une seconde sur et deux secondes à 30 pour cent d’amplitude.Ensuite, préparez un échantillon de réaction de 800 microlitres en mélangeant d’abord la protéine avec le tampon de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite l’héparine et le thioflavine-T et bien mélanger en faisant monter et descendre cinq fois. Faites tourner les échantillons à 12 000 x g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air.Après centrifugation, distribuez 198 microlitres d’échantillon de réaction par puits dans une microplaque de 96 puits, évitant ainsi la formation de bulles d’air. Homogénéisez l’échantillon fibral pré-formé en faisant monter et descendre trois fois. Ajouter la quantité correspondant au pourcentage désiré de graines à chaque puits et mélanger en pipetting de haut en bas trois fois.Ensuite, scellez la microplaque pour éviter l’évaporation. Placez la microplaque dans le lecteur de microplaque multimode et commencez la mesure. Une fois l’expérience terminée, retirez la microplaque de l’équipement.Exportez ensuite les données vers une feuille de calcul. Recombinant Tau contenant les mutations C291A et C322A et n terminal son terminal c-tags sont très purs comme visualisé sur la page SDS et pratiquement 100 pour cent monomère tel qu’évalué par SEC-MALS. L’agrégation recombinante de Tau induite par l’héparine a été suivie de la fluorescence de thioflavine-T utilisant une longueur d’onde d’excitation de 440 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 485 nanomètres.L’analyse est hautement reproductible avec des résultats de 10 puits individuels étant pratiquement indiscernables. Les agrégats tau recombinants sont un mélange homogène de structures fibulaires de différentes longueurs, semblables aux morphologies ex vivo rapportées. Le mélange de réaction final ne contient pas de monomère, ce qui suggère une conversion complète en agrégats, comme le montrent les mesures SEC-MALS.La cinétique de l’agrégation recombinante de Tau dans les courses expérimentales indépendantes sont semblables, comme souligné par les courbes sigmoidal semblables et les phases indiscernables de décalage et de croissance. Le niveau élevé de reproductibilité est maintenu lorsque différents lots de protéines sont utilisés. Les agrégats tau recombinants pré-formés sont efficaces pour recruter du monomère Tau et induire la formation d’agrégats de novo Tau, et l’efficacité du processus est directement proportionnelle au pourcentage de graines.Des quantités aussi faibles que 0,0025 pour cent des agrégats Tau pré-formés exprimés en volume sont capables de contourner la nucléation recombinante tau et déclencher la génération de novo fibral. L’analyse actuelle imite ce que l’on croit être le mauvais déroulement et l’agrégation in vivo de Tau et permet des études mécanistes qui pourraient faire la lumière sur le processus de pathogénie et constitue un outil précieux pour le dépistage des médicaments et l’étude de l’interférence des candidats médicaments à différentes étapes du processus. La haute reproductibilité de l’essai permettra aux scientifiques de le mettre en œuvre avec une relative facilité en laboratoire.Bien que l’analyse actuelle se concentre uniquement sur le plus long Tau isoforme, humain Tau-441, l’application peut être adaptée pour étudier différentes variantes tau. Et n’oubliez pas que le choix des bons réaditeurs protéiques et leur production à des normes de qualité élevées sont essentiels à la mise en place d’un test robuste et hautement reproductible.

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Évaluation de l&#39;alternance spontanée, reconnaissance récente d&#39;objets et assemblage des membres dans les modèles de souris transgéniques de la neuropathologie amyloïde-β et tau

Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Ce manuscrit décrit les protocoles normalisés pour mesurer les tau hyperphosphorylée, mesure contraignante de tau de microtubules et la localisation de tau intracellulaire suivant des traitements médicamenteux. Ces protocoles peuvent être utilisés répétitivement pour le dépistage de drogues ou autres composés qui ciblent tau hyperphosphorylée ou microtubules contraignant.

Dosage pour la Phosphorylation et microtubules liaison avec localisation de la protéine Tau dans les cellules du Cancer Colorectal

In vivo la microdialyse a permis la collecte des molécules présentes dans le liquide interstitiel de cerveau (ISF) des animaux éveillés, agir librement. Afin d’analyser les molécules relativement importantes dans l’ISF, l’article actuel se concentre spécifiquement sur le protocole de la microdialyse utilisant des sondes à haut poids moléculaire, couper des membranes.

In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

Nous décrivons ici une analyse axée sur la cellule pour évaluer quantitativement l’absorption tau par la microglie dans le but de créer un outil expérimental pour mieux caractériser les mécanismes d’action des anticorps anti-tau.

Cell-based Assay pour étudier la clairance Tau humoral de la microglie

Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.

Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

Découvrez un dosage robuste d'agrégation de la protéine Tau pour l'étude des tauopathies et le dépistage de médicaments. Cette méthode utilise des protéines recombinantes pures et un lecteur de microplaques multimodal.

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues

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