Name: Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez la tomographie par cohérence optique et la réponse optocinétique pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes chez les rongeurs. Ces méthodes non invasives permettent des études longitudinales en neurologie et ophtalmologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Dr Robert Pfleger Ilselore Luckow-fondation, ainsi que Biogen et Novartis à pa Figure 1 b a été reproduite de « manipulateurs positionnels confiné pour l’imagerie oculaire de rats et de souris anesthésiés : un guide de bricolage. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, Aktas, O., Brandt, A. U., H., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, P. BMJ ophtalmologie ouverte. 1 (1), e000008, 2017" avec la permission du BMJ Publishing Group Ltd.

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux directives d’expérimentales approuvés par les autorités régionales (Agence nationale pour la Nature, l’environnement et la Protection des consommateurs ; référence numéro 84-02.04.2014.A059) et sont conformes à l’Association pour Recherche en Vision et Ophthalmology (ARVO) déclaration sur l’utilisation des animaux en ophtalmique et Vision Research et la directive européens 2010/63/ce relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
1. confocal Scanning Laser ophtalmologique-optical Coherence Tomography
Remarque : Le protocole de mesure cSLO-OCT est adaptable pour toutes les souches de rats et de souris de laboratoire.
<ol><li>Préparation mise en place et l’imagerie pré Remarque : La configuration du système de l’appareil de OCT utilisé dans le présent protocole a déjà été décrit ailleurs31.</li>
	<li>
Préparation rongeur inhalant anesthésie
	<ol>
<li>Placer le rongeur dans une chambre à induction et mettre le vaporisateur isoflurane concentration de 2 % à 2 L/min O2.</li>
		<li>Vérifier si le rongeur est anesthésié par pincement de la queue, retirez-la de la chambre et l’envelopper dans une serviette en papier pour garder au chaud.</li>
		<li>Placer le rongeur dans le support personnalisé33 et accrocher les incisives maxillaires sur la barre de morsure intégrée de l’embout buccal, relié à l’évaporateur (isoflurane de 2,5 % à 2 L/min O2).</li>
		<li>Appliquer une goutte de 2.5%-Tropicamide phényléphrine 0,5 % sur chaque œil pour la dilatation pupillaire.</li>
		<li>Essuyez tout excès de liquide des gouttes pour les yeux après 1 min et lubrifier les yeux avec le gel ophtalmique méthyl-cellulose basée (par exemple, hypromellose 0,3 % collyre) afin d’éviter le séchage dehors et la turbidité de la cornée.</li>
		<li>Placer les lentilles de contact personnalisé (+ 4 dioptries) sur l’oeil de la souris à la main ou avec une pincette. Couvrir le œil de rat avec une plaque de verre (par exemple, ronde 12 mm diamètre verre couvre-objet) sans propriétés optiques pour garantir une surface plane. Remarque : Fréquence respiratoire de moniteur pendant l’anesthésie. Augmentez ou diminuez l’Isoflurane concentration si nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesure et analyse Remarque : Assurez-vous d’effectuer et de signaler les mesures OCT en ligne avec les recommandations de APOSTEL34 part contrôle de la qualité selon l’OSCAR-IB consensus critères35. Que ces recommandations ont été élaborées pour les images OCT humaines, certains critères ne sont pas ou seulement partiellement applicable.<ol>
<li>Pour le œil gauche de l’image, positionner le support tel que présenté dans la Figure 1 a à veiller à ce que l’ampoule de le œil gauche des visages rongeurs la caméra.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton Démarrer dans le coin droit de l’affichage du panneau contrôle pour démarrer le mode d’acquisition.</li>
		<li>Placez le levier de filtre à R et sélectionnez BR + OCT pour l’imagerie du fond de œil réflectance bleue et acquisition de B-scan sur le panneau de configuration.</li>
		<li>Définir la distance de mise au point à environ 38 dioptries à l’aide de la molette de mise au point sur le dos de l’appareil et effectuer un zoom avant sur la rétine jusqu'à ce que l’analyse de l’OCT est visible à l’écran. Remarque : Lors de la première mesure, le bras de référence doit être adapté pour la mesure de rongeur. Appuyez sur la combinaison Ctrl + Alt + Maj + O et ajuster la valeur du bras référence dans la fenêtre ouverte jusqu'à ce que le OCT-scan apparaît à l’écran.</li>
		<li>Afin d’assurer un trajet optique au milieu de la pupille avec un angle orthogonale à la rétine dans tous les plans, la position du disque optique au milieu de la piste illuminée (BR) et ajuster la ligne horizontale et verticale B-scans à un niveau horizontal en rotation/rotation le titulaire (Figure 1 b) ou en déplaçant la caméra.</li>
		<li>Sélectionnez le mode de balayage de volume et affectez-lui 25 B-scans en mode haute résolution à 50 suivi automatique en temps réel (ART, pixellisé de 50 A-Scans en moyenne) sur l’écran du logiciel.</li>
		<li>Centre au milieu de la grille d’analyse de volume sur le disque optique et commencer l’acquisition en appuyant sur le bouton de sensibilité noir, puis acquérir sur le panneau de configuration.</li>
		<li>Placez le levier de filtre à A, sélectionnez Bleu Auto floraison (BAF) sur le panneau de commande et régler la luminosité de l’image avec le bouton de sensibilité. Appuyez sur le bouton de sensibilité, puis acquérir pour cellules fluorescentes image (par exemple, EGFP) ou dépôts fluorescent auto.</li>
		<li>Appliquez le gel ophtalmique sur le œil du rongeur pour prévenir la déshydratation et mettre l’animal dans une cage séparée avec une source de chaleur.</li>
		<li>Superviser les rongeurs jusqu'à ce qu’il est complètement remis de l’anesthésie, dans une cage séparée et logement individuel. Lorsque l’animal est ambulatoire, renvoyez-le à la cage.</li>
		<li>Pour l’analyse des scans volume, utilisez la segmentation automatique du logiciel de l’appareil OCT en cliquant-droit sur le scan et sélectionnez Segmentation puis Tous les calques. S’assurer que la qualité des images OCT est suffisante et de définir les seuils de qualité pour chaque série d’expériences, par exemple, > 20 décibels.</li>
		<li>Effectuer la correction manuelle des couches en double-cliquant sur la numérisation souhaitée, sélectionnez le Profil d’épaisseur et cliquez sur Modifier les Segmentations de couche. Sélectionnez un calque, par exemple, appuyez sur ILM pour intérieur limitant la membraneet, si nécessaire, corriger la ligne verte en déplaçant les points rouges de glisser et déposer à la position correcte. Remarque : Veillez à ce que l’enquêteur effectuant la correction manuelle est aveuglé pendant les groupes expérimentaux.</li>
		<li>Sélectionnez l’onglet Carte d’épaisseur et choisir le traitement précoce, 1, 2, 3 mm , de grille d’étude (ETDRS) de rétinopathie diabétique. Centrez le cercle intérieur du disque optique (Figure 2, gauche).</li>
		<li>Calculer l’épaisseur des couches rétiniennes des valeurs épaisseur fournies par le logiciel pour les différents secteurs rétiniens d’intérêt. Pour calculer les valeurs d’épaisseur moyenne des analyses de volume, utilisez l’entier 1, 2, 3 mm ETDRS grille, ce qui couvre un angle de 25° environ, à l’exclusion du cercle intérieur de 1 mm, qui contient du disque optique (Figure 2, droite).</li>
		<li>Effectuer l’analyse statistique en utilisant le logiciel adéquat. Si les deux yeux d’un animal est inclus, envisager une comptabilité de modèle statistique pour dans les corrélations inter-oeil sujet (p. ex., des équations d’estimation généralisées ou mixtes modèles linéaires), comme les yeux d’un sujet sont statistiquement dépendantes36 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. réponse optocinétique
Remarque : Par la suite, est fourni un manuel détaillé pour les mesures OKR des souris et des rats, qui peut être adapté aux besoins spécifiques de chacun.
<ol><li>
Mise en place et mesure préalable de préparations
	<ol>
<li>Allumez l’ordinateur. Après que le système a démarré, tourner sur les écrans de la chambre d’essai tel que décrit plus en détail ailleurs37.</li>
		<li>Sélectionnez une plate-forme appropriée pour la mesure des rats ou des souris. Remarque : La taille de la plate-forme est sélectionnée selon la taille du corps du rongeur. L’animal doit être en mesure de s’asseoir correctement sur la plate-forme sans la possibilité de se promener.</li>
		<li>Ouvrez la fenêtre de préréglages en double-cliquant sur le logiciel, sélectionnez nouveau groupe et choisissez le nom du groupe, le nombre de sujets, les espèces et les souches. Sélectionnez un stimulus variable : fréquence spatiale/temporelle, de sensibilité au contraste, de vitesse ou d’orientation dans le menu déroulant, puis appuyez sur Créer un nouveau groupe.</li>
		<li>Mettre l’accent sur la plate-forme en manipulant la bague de mise au point de la caméra sur le dessus de la chambre et de calibrer le système en alignant (glisser / déplacer) le cercle rouge autour du cercle noir sur la plate-forme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesure et analyse
	<ol>
<li>Placez l’animal sur la plate-forme, laissez-le s’adapter à l’environnement pendant environ 5 min. soulever l’animal en arrière sur la plate-forme si elle tombe (Figure 3 a).</li>
		<li>Sélectionnez le numéro de l’objet et l’état sur le coin supérieur droit de l’écran du logiciel (Figure 3 b). Un stimulus est variable, les autres stimuli sont gardés constants. Ceci est confirmé par le symbole cadenas ouvert ou fermé serrure à côté de la stimulation.</li>
		<li>Démarrer mesure en sélectionnant ◄ pour Oui ou ■ No, si l’animal suit ou ne suit pas, respectivement. Remarque : Suivi dans le sens horaire correspond à la gauche et vers la gauche suivi à le œil droit. Le logiciel change au hasard la direction de la grille mobile.</li>
		<li>Sélectionnez la taille de palier du stimulus manuellement en cliquant sur les flèches vers le haut et vers le bas à côté de l’impulsion variable ou laissez-le s’adapter automatiquement par le logiciel, si le seuil de stimulation converge.</li>
		<li>Pour des résultats optimaux, animer l’animal, , par exemple, en haut siffler sons et découpage, en cliquant sur le symbole de la boîte noire ou blanche sur l’écran du logiciel. Effectuer ces actions à plusieurs reprises dans le cas des mesures prolongées.</li>
		<li>Pour l’analyse de données, sélectionnez l’onglet résumé et cliquez sur fichier | Tableau/graphique d’exporter pour exporter l’ensemble de données désiré.</li>
		<li>Effectuer l’analyse statistique en utilisant le logiciel désiré (voir aussi l’étape 1.3.15).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Le travail présenté sans lien avec que les auteurs déclarent les informations financières suivantes :
Michael Dietrich a reçu des honoraires de haut-parleur de Novartis. Andrés Cruz-Herranz est un stagiaire postdoctoral de la National Multiple Sclerosis Society. Ari J. Green a siégé au Conseil scientifique de MedImmune, Novartis, OCTIMS, création 5 Biosciences et Bionure ; est rédactrice adjointe du JAMA neurologie ; a été membre du conseil éditorial de neurologie ; est titulaire d’un brevet pour les molécules de la remyélinisation et voies ; consulté au sujet de la création 5 Sciences ; recherche reçu soutien de Novartis Pharma OCTIMs, création Sciences SRA, NINDS, NIA, National multiple Sclerosis Society, Sherak Foundation et la Fondation Hilton ; est titulaire d’actions ou stock-options en création 5 ; et a servi comme témoin expert à Mylan v Teva Pharma. Hans-Peter Hartung bénéficie d’honoraires pour siéger à des comités directeurs de Biogen Idec, GeNeuro, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune, Bayer HealthCare, avance Pharma, et Roche, les droits d’avoir siégé sur des comités consultatifs de Biogen Idec, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals et Roche et conférence de Biogen Idec, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals , Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune et Roche. Philipp Albrecht a reçu une indemnisation pour siéger à des comités consultatifs scientifiques pour Ipsen, Novartis, Biogen ; Il a reçu des honoraires de haut-parleur et parcourez le soutien de Novartis, Teva, Biogen, Merz Pharmaceuticals, Ipsen, Allergan, Bayer Healthcare, Esai, UCB et Glaxo Smith Kline ; Il a reçu le soutien à la recherche de Novartis, Biogen, Teva, Merz Pharmaceuticals, Ipsen et Roche. Les autres auteurs ne rapportent aucune divulgation.

Ce protocole prévoit une instruction pour les mesures d’épaisseur et l’examen de la fonction visuelle chez les rongeurs. Les affichages visuels sont de plus en plus utilisés dans la recherche translationnelle18,26,38,39,40 et sont facilement transférables aux essais cliniques. L’avantage considérable d’OCT par rapport aux enquêtes histologiques lors des expérimentations animales, c’est que les analyses longitudinales sont possibles permettant l’étude des processus pathologiques dynamiques, largement réduire la variabilité et le nombre de animaux nécessaires par l’étude. En outre, imagerie in vivo avec OCT n’est pas sous réserve de la fixation, coupe ou coloration des artefacts qui peuvent influer sur l’épaisseur de la couche dans les études histologiques.
Cependant, l’orientation orthogonale du faisceau laser sur tous les plans par rapport à la rétine est une étape essentielle pour assurer la qualité et la reproductibilité des valeurs d’épaisseur. Il nécessite une formation de l’enquêteur et est obligatoire avant l’acquisition de scans d’OCT. En outre, comme les appareils commerciaux sont construits à des applications humaines, la qualité des images de OCT rongeurs est reste inférieure par rapport à B-scans de patients humains. Dans l’expérience des auteurs, il peut être difficile de distinguer la rétine interne différente couches (couche des fibres nerveuses rétiniennes, couche de cellules de ganglion et couche plexiforme interne) au cours de la correction manuelle. Nous recommandons donc d’analyser ces couches comme une lecture composée (IRL).
Le montage expérimental offre une option d’anesthésie volatile, par exemple, inhalant isoflurane, qui est, selon notre expérience, plus sûre et plus facile à contrôler que l’anesthésie injectable, par exemple, la kétamine-xylazine41,42 et réduit le risque du réveil prématuré des rongeurs en cas d’acquisition plus longue temps (par exemple, lors de l’exécution de l’imagerie de cellules marquées fluorescent). Dans une étude préliminaire, les scans du volume ont été identifiés comme les protocoles la validité plus élevée et la fiabilité. La fiabilité de contre-essai inter-évaluateurs et test était excellente lorsque les analyses de volume à l’exclusion de la partie centrale contenant du disque optique ont été évaluées avec les valeurs (coefficient de corrélation intraclasse) ICC au-dessus de 0,85 pour toutes les évaluations.
La mesure de la réponse optocinétique est basée sur le réflexe involontaire optocinétique, qui se produit en réponse à un champ sans cesse en mouvement. Chez les rongeurs, contrairement aux autres espèces, le mouvement implique non seulement les yeux, mais toute la tête, qui peut facilement être détectée à l’aide de la caméra.
Faire la distinction entre « suivi » ou normale des mouvements comportementales des animaux exige une formation de l’enquêteur, et il est important d’être aveuglé pour le groupe expérimental. En outre, les animaux ont besoin d’une phase d’adaptation pour accueillir la création expérimentale et pendant les protocoles de mesure depuis longtemps, les animaux doivent être animé à plusieurs reprises pour s’assurer que « aucun suivi » n’est due à atteindre le seuil des OKR et ne pas à une diminution de attention. Il y a aussi une variabilité importante souche au sujet de la fonction visuelle du laboratoire souris et les rats43,44. L’acuité visuelle du rongeur doit donc être évaluée avant ils sont testés et certaines souches, tels que des souris SJL, même peut-être pas adaptés aux mensurations OKR, car ils sont homozygotes pour l’allèle Pde6brd1 (dégénérescence rétinienne 1).
En résumé, l’examen de la rétine morphologie et fonction visuelle dans des modèles animaux permet d’enquêtes non invasif et longitudinales des dommages structuraux et fonctionnels qui se produisent dans le contexte de l’EAE et peut être utile dans d’autres modèles impliquant le visuel système, y compris mais non limité aux modèles des rétinopathies ou de lésions du nerf optique.

L’examen de la voie visuelle, dans le cadre du système nerveux central, s’est avéré pour être un point de départ efficace en abordant non seulement ophtalmologique1,2,3,4,5 , mais aussi neurologiques6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 questions. Ces dernières années, OCT et OKR ont été identifiés comme des outils utiles analytiques, non invasif pour évaluer une grande variété de rétinopathies et rétiniennes manifestations dans divers modèles de rongeurs17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT permet de rapide et de haute résolution en vivo visualisation de la rétine morphologie et structure chez les souris et les rats, avec des résultats en bon accord avec les coupes histologiques des rétines animaux26. OKR constitue une méthode rapide et robuste pour évaluer quantitativement la fonction visuelle.
Nombreux appareils OCT permettent simultanée balayage laser ophtalmologique (cSLO) imagerie confocale avec différentes longueurs d’onde, qui fournit des informations de diagnostic concernant les pathologies rétiniennes, c'est-à-dire, la visualisation des dépôts de lipofuscine ou des altérations de la rétine pigment épithélium27. En outre, en vivo imagerie de fluorescence étiquetés cellules chez les animaux transgéniques est possible28,29,30,31,32. Toutefois, l’application des technologies de l’OCT dans les modèles de rongeurs est toujours difficile, principalement en raison de la taille de petit oeil. Plusieurs appareils disponibles dans le commerce nécessitent des adaptations, et souvent une taille différente du titulaire est nécessaire à l’image des animaux d’espèces différentes. En outre, animaux nécessite une anesthésie pour la mesure.
OKR appareils peuvent être utilisés pour évaluer la fonction visuelle chez les rongeurs. Les animaux sont placés sur une plate-forme au centre d’un cylindre réel ou virtuel affichant un déplacement grinçant, de suivre les animaux avec tête réflexive et les mouvements du cou. Cette réponse optocinétique est réduite ou éliminée dans le cas de la réduction ou la perte de la fonction visuelle.
Ce protocole vise à présenter un manuel pour le mesurage de l’épaisseur rétinienne en utilisant un dispositif OCT commercialement disponible avec un support personnalisé offrant inhalant anesthésie. Le protocole montre comment analyser les scans de volume à l’aide du logiciel fourni par le fabricant. Pour le test visuel, vise à fournir des instructions sur la façon d’utiliser un système disponible dans le commerce pour évaluer l’OKR.

<table><tbody><tr><td>Système Heidelberg Spectralis HRA+OCT&nbsp ;</td><td>Heidelberg Engineering, Allemagne</td><td>N/A</td><td>Système de plate-forme d’imagerie ophtalmique</td></tr><tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Allemagne</td><td>N/A</td><td>Version 1.9.10.0</td></tr><tr><td>bleu 25D lentille sans contact</td><td>Heidelberg Engineering, Allemagne</td><td>N/A</td><td>lentille pour mesure des rongeurs</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics Inc., Canada</td><td>N/A</td><td>système pour l’analyse de la fonction visuelle</td></tr><tr><td>OptoMorty HD software</td><td>CerebralMechanics Inc., Canada</td><td>N/A</td><td>Version 2.1.0</td></tr><tr><td>Anesthésique par inhalation Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA&nbsp ;</td><td>803250</td><td>Hydroxylétique</td></tr><tr><td>par inhalation Phényléphrine 2,5 %-Tropicamide 0,5 %&nbsp ;</td><td>Hôpital universitaire D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td>N/A</td><td>dilatation pupillaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Visc-Ophtal</td><td>Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>58407</td><td>gel ophtalmologique pour les yeux</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc, San Diego, CA, États-Unis N</td><td>/A Logiciel</td><td>d’analyse statistique, Version 5.00</td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics</td><td>IBM Corporation, Armonk, New York, États-Unis S.O.</td><td>Logiciel</td><td>d’analyse statistique, Version 20</td></tr></tbody></table>

utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les rats

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Tomographie par cohérence optique (OCT) est une technique rapide, non invasif, interférométrique permettant une imagerie rétinienne. C’est un outil idéal pour l’étude des processus de neurodégénérescence, neuroprotection et neuro-réparation impliquant le système visuel, comme ces souvent corréler avec modifications rétiniennes. Comme une lecture fonctionnelle, œil compensatoire visuellement évoqué et mouvements de la tête sont couramment utilisés dans les modèles expérimentaux portant sur la fonction visuelle. Combinant les deux techniques permet une enquête quantitative in vivo de la structure et la fonction, qui peut être utilisée pour enquêter sur les conditions pathologiques ou pour évaluer le potentiel de nouvelles thérapeutiques. Un grand avantage des techniques présentées est la possibilité d’effectuer des analyses longitudinales permettant l’étude des processus dynamiques, en réduisant la variabilité et permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences. Le protocole décrit vise à fournir un manuel pour l’acquisition et l’analyse des scans rétiniens de haute qualité des souris et des rats en utilisant un support personnalisé faible coût avec une option pour livrer l’anesthésie par inhalation. En outre, le guide proposé vise comme un manuel d’instruction pour les chercheurs qui utilisent optocinétique analyse de la réponse (OKR) chez les rongeurs, qui peuvent être adaptés à leurs besoins et intérêts.

En utilisant l’imagerie de OCT 3rd génération peptide de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) induit des modèles de souris de l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), haute résolution sections morphologiques de la rétine de souris ont été obtenues. Grâce à cette technologie, les capacités de protection des différentes substances ont été démontrées17. Les valeurs d’épaisseur des couches rétiniennes internes (IRL) obtenues sont en bon accord avec le nombre de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) obtenues par coloration histologique de la rétine wholemounts (Figure 4).
OKR surveillance fournit une lecture fonctionnelle de la neurodégénérescence vu par OCT. Dans ces expériences, fonction visuelle évalués comme fréquence spatiale par OKR et dystrophies dommages évalués comme IRL amincissement par OCT, étaient en corrélation étroite17. Différents protocoles peuvent être utilisés pour examiner l’acuité visuelle en changeant la fréquence spatiale ou temporelle, la sensibilité au contraste, l’orientation ou la vitesse de la grille mobile. Dans le modèle de l’EAE, une fréquence spatiale améliorée de 0,05 cycles/degré (c/d) des animaux traités avec la substance 1 a été détectée par rapport aux souris non traitées de MOG-EAE (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig1.jpg"> Figure 1 : support personnalisé pour la mesure de l’OCT. (A) OCT imagerie de souris C57BL/6J en utilisant le support personnalisé33 et (B) l’axe de rotation autour de le œil de rongeur. Rotation dans le plan transversal (à gauche) et dans le plan axial (à droite) est démontrée. Ce chiffre a été modifié par Dietrich, M. Al.33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig2.jpg"> Figure 2 : OCT après analyse de l’acquisition. « 1, 2, 3 mm » grille ETDRS sur le protocole de volume B-scan 25 (à gauche). L’épaisseur des couches rétiniennes est fournie pour les différents secteurs rétiniens par le logiciel (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig3.jpg"> Figure 3 : mesure OKR des souris et des stimulus paramètres. Haut (A) découvre à travers la caméra analyse une souris C57BL/6J sur la plate-forme dans la chambre. (B) l’interface utilisateur et les paramètres du logiciel OKR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig4.jpg"> Figure 4 : souris C57BL/6J avec MOG EAE montrent une évolution de la maladie atténué lorsque traitée avec substance 1 par rapport aux témoins non traités. (A), la dégénérescence des couches rétiniennes internes est réduite (B) et la clinique score EAE est atténuée au cours de l’EAE lorsqu’on a administré la substance 1. Souris ont été marqués par jour, et OCT mesures ont été effectuées tous les mois sur une période de 120 jours. Les graphiques représentent la moyenne et l’écart-type d’au moins dix animaux par groupe. (*p &lt; 0,05, ***p &lt; 0,001, aire sous la courbe comparée par analyse de la variance avec les post-hoc test de Dunnett). (C) le changement d’épaisseur IRL est en bon accord avec perte RGC (***p &lt; 0,001, par analyse de la variance avec post-hoc test de Dunnett, par rapport aux souris non traitée de MOG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig5.jpg"> Figure 5 : mesure OKR de souris C57BL/6J avec MOG-EAE. (A), OKR révèle une acuité visuelle améliorée d’animaux traitée avec la substance 1 par rapport aux souris non traitées de MOG EAE mesurées par seuil de fréquence spatiale stable sur une période de 120 jours. Les graphiques représentent la moyenne et l’écart-type d’au moins six animaux par groupe (**p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, aire sous la courbe comparée par analyse de la variance avec les post-hoc test de Dunnett). (B) Image de souris C57BL/6J dans la chambre d’essai. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Un protocole détaillé pour l’évaluation des afficheurs structurels et visuelles chez les rongeurs par réaction d’optocinétique et de tomographie par cohérence optique est présenté. Les résultats fournissent des indications précieuses pour la recherche ophtalmologique ainsi que neurologique.

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurologie et de l’ophtalmologie, et aider à évaluer une grande variété de rétinopathies et de manifestations rétiniennes dans divers modèles de rongeurs. Le principal avantage de ces techniques est que des investigations longitudinales non invasives peuvent être effectuées, réduisant la variabilité et réduisant le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Ces méthodes permettent une étude quantitative in vivo de la structure et de la fonction qui peut être utilisée pour étudier les conditions pathologiques, ou pour évaluer l’utilité potentielle de nouvelles thérapeutiques.Cependant, en particulier l’application de la technologie de tomographie de cohérence optique dans les modèles de rongeurs est toujours difficile, principalement en raison de la petite taille des yeux. Michael Dietrich, doctorant de notre laboratoire, démontrera les procédures. Après anesthésier le rongeur, appliquer une goutte de Phényléphrine Tropicamide sur chaque œil pour la dilatation pupille.Essuyez tout excès de gouttelette humide après une minute. Et lubrifier le gel ophtalmique à base de méthylcellulose pour éviter de sécher l’œil et de créer une cornée trouble. Utilisez ensuite des forceps pour placer une lentille de contact personnalisée sur l’œil.Appuyez sur le bouton Démarrer dans le coin droit de l’écran du panneau de commande pour démarrer le mode d’acquisition. Ensuite, pour l’image de l’œil gauche, placez le support pour s’assurer que l’ampoule de l’œil gauche du rongeur fait face à la caméra. Réglez le niveau de filtre à R, et sélectionnez BR et OCT pour l’imagerie fundus reflets bleus et l’acquisition de B-scan dans le logiciel.Ensuite, réglez la distance de mise au point à environ 38 diopters, en utilisant le bouton de mise au point à l’arrière de la caméra. Et zoomer sur la rétine, jusqu’à ce que le scan OCT soit visible à l’écran. Ensuite, pour assurer un chemin de faisceau à travers le milieu de la pupille, avec un angle orthogonal de la rétine dans tous les plans, placez le disque optique au milieu du champ illuminé.Et ajustez les balayages horizontaux et verticaux de ligne B à un niveau horizontal en tournant le support. Sur l’écran du logiciel sélectionnez le mode d’analyse de volume, et réglez-le à 25 B-scans en mode haute résolution à 50 suivi automatique en temps réel. Centrez le milieu de la grille de balayage de volume sur le disque optique et commencez l’acquisition en appuyant sur le bouton de sensibilité noire, puis acquérir sur le panneau de commande.Une fois l’acquisition terminée, réglez le niveau de filtre à A.Select Blue Autofluorescence sur le panneau de commande. Et ajustez la luminosité de l’image avec le bouton de sensibilité. Appuyez sur le bouton de sensibilité, puis acquérir à l’image des cellules fluorescentes ou des dépôts autofluorescents.Pour l’analyse des analyses de volume, utilisez la segmentation automatisée du logiciel de l’appareil OCT en cliquant à droite sur l’analyse. Et sélectionnez Segmentation, puis Toutes les couches. Effectuez la correction manuelle des couches en cliquant en double sur l’analyse désirée.Sélectionnez Profil d’épaisseur. Et cliquez sur Modifier les segmentations de calque. Sélectionnez une couche à la fois.Et si nécessaire corriger la ligne verte en déplaçant les points rouges en faisant glisser et tomber à la bonne position. Sélectionnez ensuite la carte d’épaisseur de l’onglet. Choisissez la grille ETDRS de 1, 2, 3 millimètres.Centrez le cercle intérieur sur le disque optique. Enfin, calculer l’épaisseur des couches rétiniennes à partir des valeurs d’épaisseur fournies par le logiciel pour les différents secteurs rétiniens d’intérêt. Pour calculer les valeurs d’épaisseur principale à partir des balayages de volume, utilisez l’ensemble de la grille ETDRS de 1, 2, 3 mm qui couvre un angle d’environ 25 degrés, à l’exclusion du cercle intérieur d’un millimètre qui contient le disque optique.Commencez par choisir une plate-forme pour mesurer les rongeurs. Ouvrez la fenêtre Presettings en cliquant en double sur le logiciel. Sélectionnez Nouveau Groupe et choisissez le nom du groupe, le nombre de sujets, l’espèce et les souches.Sélectionnez un stimulus variable, une fréquence spatiotemporale, une sensibilité au contraste, une vitesse ou une orientation dans le menu dropdown et appuyez sur Créer un nouveau groupe. Concentrez-vous sur la plate-forme en manipulant l’anneau de mise au point de la caméra sur le dessus de la chambre. Et calibrer le système en alignant le cercle rouge autour du cercle noir sur la plate-forme.Ensuite, placez le rongeur sur la plate-forme et laissez-le s’adapter à l’environnement pendant environ cinq minutes. Ensuite, commencez la mesure en sélectionnant la flèche gauche pour oui ou le carré pour non, si l’animal suit ou ne suit pas respectivement. Sélectionnez manuellement la taille de l’étape du stimulus en cliquant sur les flèches de haut en bas à côté du stimulus variable.Enfin, sélectionnez l’onglet Résumé et cliquez sur le fichier, le tableau d’exportation ou le graphique pour exporter l’ensemble de données souhaité. Les résultats indiquent que la dégénérescence des couches rétiniennes intérieures est réduite. Et un score clinique d’EAE est atténué pendant le cours d’EAE quand la substance 1 a été administrée.En outre, OKR révèle une acuité visuelle améliorée des animaux traités avec la substance 1 comparée aux souris non traitées d’EAE de MOG mesurées par l’essai de seuil de fréquence spatiale sur une période de 120 jours. Lors de l’exécution des mesures oct, une étape critique est l’orientation orthogonale du faisceau laser dans tous les plans par rapport à la rétine pour assurer la qualité et la reproductibilité des valeurs d’épaisseur. Pour la technique OKR, la distinction entre le suivi et les mouvements comportementaux normaux de l’animal, nécessite une certaine formation de l’enquêteur.Il est important d’être aveuglé pour le groupe expérimental. Après ces investigations des dommages structurels et fonctionnels se produisant dans le contexte de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale, la procédure peut également être utile dans d’autres modèles impliquant le système visuel, y compris mais pas limité aux modèles des rétinopathies, ou des dommages optiques de nerf. Ces techniques ouvrent la voie à la recherche in vivo dans les domaines de la neurologie et de l’ophtalmologie et sont facilement transférables aux essais cliniques.

using-optical-coherence-tomography-optokinetic-response-as-structural

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

Ce manuscrit décrit un protocole pour l’imagerie in vivo de la rétine de souris avec tomographie à cohérence optique haute résolution de domaine spectral (SD-OCT). Il se concentre sur les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans la région péripapillaire, avec plusieurs de numérisation et de quantifier les approches décrites.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Pour examiner la vision de la souris, nous avons mené un test imminent. Des souris ont été placées dans une grande arène carrée avec un moniteur sur son plafond. La stimulation visuelle imminente évoquaient systématiquement le gel ou les réactions de vol chez les souris.

Utilisation de stimuli visuels imminente pour évaluer la vision de la souris

Ici, nous décrivons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique

La dégénérescence neuronale dans les yeux et le cerveau à la suite du diabète peut être observée grâce à des tests comportementaux effectués sur des rongeurs. Le labyrinthe Y, une mesure de la cognition spatiale, et la réponse optomotrice, une mesure de la fonction visuelle, fournissent tous deux un aperçu des diagnostics et des traitements potentiels.

Évaluation comportementale de la fonction visuelle via la réponse optomotrice et de la fonction cognitive via Y-Maze chez les rats diabétiques

Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’occlusion veineuse rétinienne à l’aide de rose bengale et un système de microscope d’imagerie rétinienne guidé par laser avec des recommandations pour maximiser sa reproductibilité dans les souches génétiquement modifiées.

Optimisation du modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne pour limiter la variabilité

Nous décrivons ici une technique d’imagerie in vivo utilisant la tomographie par cohérence optique pour faciliter le diagnostic et la mesure quantitative de la rétinopathie chez la souris.

Application de la tomographie par cohérence optique à un modèle murin de rétinopathie

Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

Nous décrivons ici un protocole standard pour quantifier le réflexe optocinétique. Il combine la stimulation virtuelle du tambour et la vidéo-oculographie, et permet ainsi une évaluation précise de la sélectivité caractéristique du comportement et de sa plasticité adaptative.

Quantification de la sélectivité des caractéristiques visuelles du réflexe optocinétique chez la souris

Découvrez la tomographie par cohérence optique et la réponse optocinétique pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes chez les rongeurs. Ces méthodes non invasives permettent des études longitudinales en neurologie et ophtalmologie.

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats

Explorer plus de vidéos