Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats
10 janvier 2019
Un protocole détaillé pour l’évaluation des afficheurs structurels et visuelles chez les rongeurs par réaction d’optocinétique et de tomographie par cohérence optique est présenté. Les résultats fournissent des indications précieuses pour la recherche ophtalmologique ainsi que neurologique.
Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurologie et de l’ophtalmologie, et aider à évaluer une grande variété de rétinopathies et de manifestations rétiniennes dans divers modèles de rongeurs. Le principal avantage de ces techniques est que des investigations longitudinales non invasives peuvent être effectuées, réduisant la variabilité et réduisant le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Ces méthodes permettent une étude quantitative in vivo de la structure et de la fonction qui peut être utilisée pour étudier les conditions pathologiques, ou pour évaluer l’utilité potentielle de nouvelles thérapeutiques.
Cependant, en particulier l’application de la technologie de tomographie de cohérence optique dans les modèles de rongeurs est toujours difficile, principalement en raison de la petite taille des yeux. Michael Dietrich, doctorant de notre laboratoire, démontrera les procédures. Après anesthésier le rongeur, appliquer une goutte de Phényléphrine Tropicamide sur chaque œil pour la dilatation pupille.
Essuyez tout excès de gouttelette humide après une minute. Et lubrifier le gel ophtalmique à base de méthylcellulose pour éviter de sécher l’œil et de créer une cornée trouble. Utilisez ensuite des forceps pour placer une lentille de contact personnalisée sur l’œil.
Appuyez sur le bouton Démarrer dans le coin droit de l’écran du panneau de commande pour démarrer le mode d’acquisition. Ensuite, pour l’image de l’œil gauche, placez le support pour s’assurer que l’ampoule de l’œil gauche du rongeur fait face à la caméra. Réglez le niveau de filtre à R, et sélectionnez BR et OCT pour l’imagerie fundus reflets bleus et l’acquisition de B-scan dans le logiciel.
Ensuite, réglez la distance de mise au point à environ 38 diopters, en utilisant le bouton de mise au point à l’arrière de la caméra. Et zoomer sur la rétine, jusqu’à ce que le scan OCT soit visible à l’écran. Ensuite, pour assurer un chemin de faisceau à travers le milieu de la pupille, avec un angle orthogonal de la rétine dans tous les plans, placez le disque optique au milieu du champ illuminé.
Et ajustez les balayages horizontaux et verticaux de ligne B à un niveau horizontal en tournant le support. Sur l’écran du logiciel sélectionnez le mode d’analyse de volume, et réglez-le à 25 B-scans en mode haute résolution à 50 suivi automatique en temps réel. Centrez le milieu de la grille de balayage de volume sur le disque optique et commencez l’acquisition en appuyant sur le bouton de sensibilité noire, puis acquérir sur le panneau de commande.
Une fois l’acquisition terminée, réglez le niveau de filtre à A.Select Blue Autofluorescence sur le panneau de commande. Et ajustez la luminosité de l’image avec le bouton de sensibilité. Appuyez sur le bouton de sensibilité, puis acquérir à l’image des cellules fluorescentes ou des dépôts autofluorescents.
Pour l’analyse des analyses de volume, utilisez la segmentation automatisée du logiciel de l’appareil OCT en cliquant à droite sur l’analyse. Et sélectionnez Segmentation, puis Toutes les couches. Effectuez la correction manuelle des couches en cliquant en double sur l’analyse désirée.
Sélectionnez Profil d’épaisseur. Et cliquez sur Modifier les segmentations de calque. Sélectionnez une couche à la fois.
Et si nécessaire corriger la ligne verte en déplaçant les points rouges en faisant glisser et tomber à la bonne position. Sélectionnez ensuite la carte d’épaisseur de l’onglet. Choisissez la grille ETDRS de 1, 2, 3 millimètres.
Centrez le cercle intérieur sur le disque optique. Enfin, calculer l’épaisseur des couches rétiniennes à partir des valeurs d’épaisseur fournies par le logiciel pour les différents secteurs rétiniens d’intérêt. Pour calculer les valeurs d’épaisseur principale à partir des balayages de volume, utilisez l’ensemble de la grille ETDRS de 1, 2, 3 mm qui couvre un angle d’environ 25 degrés, à l’exclusion du cercle intérieur d’un millimètre qui contient le disque optique.
Commencez par choisir une plate-forme pour mesurer les rongeurs. Ouvrez la fenêtre Presettings en cliquant en double sur le logiciel. Sélectionnez Nouveau Groupe et choisissez le nom du groupe, le nombre de sujets, l’espèce et les souches.
Sélectionnez un stimulus variable, une fréquence spatiotemporale, une sensibilité au contraste, une vitesse ou une orientation dans le menu dropdown et appuyez sur Créer un nouveau groupe. Concentrez-vous sur la plate-forme en manipulant l’anneau de mise au point de la caméra sur le dessus de la chambre. Et calibrer le système en alignant le cercle rouge autour du cercle noir sur la plate-forme.
Ensuite, placez le rongeur sur la plate-forme et laissez-le s’adapter à l’environnement pendant environ cinq minutes. Ensuite, commencez la mesure en sélectionnant la flèche gauche pour oui ou le carré pour non, si l’animal suit ou ne suit pas respectivement. Sélectionnez manuellement la taille de l’étape du stimulus en cliquant sur les flèches de haut en bas à côté du stimulus variable.
Enfin, sélectionnez l’onglet Résumé et cliquez sur le fichier, le tableau d’exportation ou le graphique pour exporter l’ensemble de données souhaité. Les résultats indiquent que la dégénérescence des couches rétiniennes intérieures est réduite. Et un score clinique d’EAE est atténué pendant le cours d’EAE quand la substance 1 a été administrée.
En outre, OKR révèle une acuité visuelle améliorée des animaux traités avec la substance 1 comparée aux souris non traitées d’EAE de MOG mesurées par l’essai de seuil de fréquence spatiale sur une période de 120 jours. Lors de l’exécution des mesures oct, une étape critique est l’orientation orthogonale du faisceau laser dans tous les plans par rapport à la rétine pour assurer la qualité et la reproductibilité des valeurs d’épaisseur. Pour la technique OKR, la distinction entre le suivi et les mouvements comportementaux normaux de l’animal, nécessite une certaine formation de l’enquêteur.
Il est important d’être aveuglé pour le groupe expérimental. Après ces investigations des dommages structurels et fonctionnels se produisant dans le contexte de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale, la procédure peut également être utile dans d’autres modèles impliquant le système visuel, y compris mais pas limité aux modèles des rétinopathies, ou des dommages optiques de nerf. Ces techniques ouvrent la voie à la recherche in vivo dans les domaines de la neurologie et de l’ophtalmologie et sont facilement transférables aux essais cliniques.
Aperçu
Cet article présente un protocole complet pour évaluer les paramètres structuraux et visuels chez les modèles rongeurs à l’aide de la tomographie par cohérence optique (OCT) et de la réponse optocinétique (OKR). Ces techniques non invasives fournissent des données pertinentes pour la recherche ophtalmologique et neurologique, permettant des études longitudinales avec une variabilité réduite et un nombre moindre d’animaux utilisés.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Ophthalmologie
- Modèles rongeurs
Contexte
- L'étude porte sur l'évaluation des rétinopathies et des manifestations rétiniennes chez les rongeurs.
- Elle met en évidence les difficultés liées à l'application de la TOM en raison de la petite taille des yeux de rongeurs.
- La TOM et la RCO permettent l'investigation quantitative in vivo de la structure et de la fonction rétinienne.
- Ces méthodes fournissent des données précieuses pour évaluer des thérapeutiques potentielles et comprendre les affections pathologiques.
Objectif de l'étude
- Développer et démontrer un protocole utilisant la tomographie en cohérence optique (OCT) et la réaction optocinétique (OKR) en recherche sur les rongeurs.
- Étudier les lésions structurelles et fonctionnelles dans le cadre de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Évaluer l'efficacité de nouvelles substances thérapeutiques dans des modèles précliniques.
Méthodes utilisées
- Les rongeurs ont été anesthésiés pour assurer leur confort pendant les procédures de TCO et de ROK.
- L'imagerie par TCO a été réalisée à l'aide d'une lentille de contact sur mesure et de paramètres logiciels spécifiques pour des balayages haute résolution.
- La plateforme de ROK consistait à présenter divers stimuli afin d'évaluer les capacités de suivi visuel.
- Les étapes clés comprenaient des procédures de calibration et d'acquisition minutieuses afin de garantir des résultats fiables en matière d'imagerie et de suivi.
Résultats principaux
- Les résultats ont indiqué une diminution de la dégénérescence des couches rétiniennes internes chez les rongeurs traités.
- Une acuité visuelle améliorée a été observée chez les animaux traités par rapport aux témoins non traités.
- Les données suggèrent que ces techniques peuvent mesurer de façon fiable les modifications rétiniennes et la fonction visuelle au fil du temps.
Conclusions
- La présente étude démontre la viabilité de la TCO et de la ROK comme outils puissants pour la recherche in vivo en neurologie et en ophtalmologie.
- Les résultats permettent d'approfondir l'exploration de la pathologie rétinienne et l'évaluation de nouvelles interventions thérapeutiques.
- Les méthodologies présentées pourraient contribuer de manière significative à la conception d'essais cliniques et à la compréhension des troubles du système visuel.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La combinaison de paramètres structuraux et fonctionnels du système visuel permet une évaluation longitudinale et quantitative de l'intégrité rétinienne et de la fonction visuelle chez les modèles rongeurs, soutenant ainsi la détection mécanistique des risques dans les programmes précliniques de neurologie et d'ophtalmologie. Cette approche à double modalité réduit la variabilité expérimentale et l'utilisation d'animaux tout en fournissant des critères d'évaluation transposables pour évaluer des thérapeutiques neuroprotectrices ou modifiant la maladie. La méthodologie améliore la confiance prédictive dans la validation des cibles en corrélant les modifications structurales rétiniennes avec les résultats fonctionnels visuels à travers différents modèles de maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant l'épaisseur des couches rétiniennes comme biomarqueur structurel de la neurodégénérescence ou de la neuroprotection.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données structurelles reproductibles et non invasives qui soutiennent la validation fonctionnelle des cibles dans la modulation de la voie visuelle.
- Valeur prédictive : Corrèle les modifications structurelles rétiniennes issues de l'OCT avec l'acuité visuelle mesurée par la réaction optocinétique (OKR) afin de renforcer la confiance dans l'engagement de la cible et la modulation de la voie.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Établit des protocoles standardisés d'OCT et de ROK pour l'imagerie quantitative in vivo et le suivi comportemental, permettant un criblage fiable de composés.
- Reproductibilité : Permet un suivi longitudinal de la structure et de la fonction rétiniennes, réduisant la variabilité inter-individuelle et améliorant la précision du test.
- Évolutivité : Prend en charge l'adaptation à haut débit grâce à des paramètres de stimulus personnalisables et à une segmentation automatisée pour une production de données cohérente entre les études.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Démontre l'applicabilité dans les modèles d'encéphalomyélite auto-immune (EAE), en associant la préservation de la structure rétinienne à une amélioration fonctionnelle de la vision et à une atténuation des symptômes cliniques.
- Continuité translationnelle : Offre un pont entre la découverte et la validation préclinique en mesurant à la fois la neurodégénérescence rétinienne et la récupération de la fonction visuelle sur des périodes prolongées.
- Progrès ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en démontrant, sur 120 jours, une réduction induite par la substance de la dégénérescence de la couche interne de la rétine et une amélioration des seuils de fréquence spatiale.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation de la cible jusqu'à l'identification de composés actifs et aux essais d'efficacité préclinique, en fournissant des paramètres structuraux et fonctionnels qui renseignent sur l'activité biologique et le potentiel thérapeutique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant une étude quantitative in vivo de la structure et de la fonction rétiniennes dans les modèles de neurodégénérescence et de neuroprotection.
- Écrans de sélection : Fournit des cartes structurales d'épaisseur prêtes à l'usage et des paramètres fonctionnels reproductibles pour une évaluation fiable de composés dans des tests du système visuel.
- Analytique : Génère des profils d'épaisseur spécifiques aux couches et des seuils de fréquence spatiale permettant la comparaison entre différentes conditions et l'analyse dose-réponse.
- Recherche translationnelle : Relie la préservation structurelle de la rétine à la récupération fonctionnelle de l'acuité visuelle, soutenant l'harmonisation des biomarqueurs et la continuité préclinique dans les modèles de maladies neurologiques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'évaluation longitudinale du système visuel dans diverses indications pathologiques et modalités thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à des lectures corrélées des aspects structurel et fonctionnel du système visuel.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité par le biais de protocoles d'imagerie calibrés et de procédures de suivi comportemental en aveugle.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en fournissant des biomarqueurs précoces et transposables de modifications de la fonction rétinienne et visuelle, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats présentant à la fois une préservation structurelle de la rétine et une amélioration fonctionnelle visuelle dans des modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des rongeurs, en préparation ophtalmique et en utilisation des systèmes OCT/OKR pour une acquisition fiable des données.
- Dépend de supports sur mesure, de lentilles de contact et de systèmes d'imagerie calibrés afin de s'adapter à la petite taille de l'œil des rongeurs et d'assurer l'alignement du faisceau.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles d'anesthésie, de mydriase, de lubrification et d'imagerie afin de maintenir la cohérence entre différents sites ou études.
- Implique des adaptations en fonction des paramètres de stimulus variables (fréquence spatio-temporelle, contraste, vitesse) dans les tests OKR selon les espèces et les modèles de lignées.
- Comprend des limites pratiques telles que la nécessité d'une formation des investigateurs pour distinguer le suivi optocinétique réel des mouvements comportementaux normaux et garantir l'aveugle lors de l'évaluation.
