Name: Un modèle de souris contrôlée pour infection polymicrobienne néonatale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Découvrez le modèle de slurry cécal pour étudier la septicémie néonatale polymicrobienne chez la souris. Cette méthode standardisée permet d'identifier précocement les animaux moribonds et d'assurer des résultats reproductibles.

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Merci à Claire Harrison et l’Animal Care Facility à du British Columbia Children Hospital Research Institute (BCCHR) pour leur soutien aux travaux animale, ainsi qu’au Dr Po-Yan Cheng pour leurs conseils et de se prononcer sur la surveillance animale et le bien-être.

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<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
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<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
<li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li>
<li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li>
<li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on%3A+choosing+an+appropriate+endpoint+in+experiments+using+animals+for+research%2C+teaching+and+testing%22">Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing</a>. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).</li>
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</ol>

Dr James Wynn bénéficie du soutien de la National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Sciences médicales générales (R01GM128452) et le NIH /Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) () R01HD089939).

Postnatals souris néonatales ont très limité de mobilité et ne parviennent pas à eux-mêmes droit après avoir été placé sur le dos, même quand incontesté. Par DOL 7, l’âge de la souris dans ce modèle, une gamme de mouvement qui s’étend de droits-Mobile à FTR-Mobile a été observée chez les souris non contestés, avec une différence importante, à savoir qu’une souris incontestée à cet âge ne manifestaient pas de comportement léthargique-FTR. Seule souris présentant une infection polymicrobienne ont été observés à devenir FTR-léthargique ; par conséquent, cette réponse peut être un marqueur de gravité de la maladie. Être attentif à la coupure d’un angle de 90° de l’horizontal pour mouvement de hanche permet l’affectation cohérente et précise du mouvement de hanche léthargique ou mobile chez la souris. Le délai de 4 s pour voir si une souris peut droite elle-même a été choisi car souris incontestés ont pu eux-mêmes droit systématiquement dans ce laps de temps. Répété de mesure de la même souris a été évitée, alors que le temps à droite eux-mêmes et la mesure de la mobilité de hanche a été limitée à 4 s, pour éviter de trop fatiguer la souris, ce qui pourrait autrement affecter sa capacité à obtenir des aliments et la chaleur et pourraient affecter sa pronostic à aller mieux. Lui-même de redressement de la gauche et de droite ont été observés, et le plus élevé des scores a été utilisé pour déterminer si la souris a été à un point de terminaison sans cruauté, parce que certaines souris ont été trouvés pour afficher FTR-Nonmobile sur un côté encore une plus grande mobilité sur l’autre côté et b e en mesure de récupérer par la suite.
Le système de notation utilisé pour évaluer la santé de la souris s’est appuyé sur l’application des seuils de catégoriques à ce qui est une gamme de mouvement et sera donc sujets aux préjugés individuels. Le personnel a été formé ensemble pour s’assurer que chaque personne a marqué les souris identiques ; Cependant, il restera probablement un niveau de subjectivité conduisant à des variations. La cohérence de la notation a été évaluée par la présence de sept chercheurs qui n’avaient pas précédemment effectué le suivi de souris néonatale apprendre aux exigences énoncées dans le présent protocole et de la vidéo, puis, indépendamment attribuer des comportements et déterminer sans cruauté point de terminaison. Une précision de 97 % a été observée avec la notation effectuée sur 60 souris contestées, ce qui suggère que la partialité individuelle ne joue pas un rôle substantiel dans les affectations comportementales de ce modèle. Le protocole de surveillance comportemental présenté repose sur l’observation d’animaux a contesté sur 7 DOL, pourtant souris âgés de moins de 6 jours dans un état sain non contesté ne peut pas systématiquement droit eux-mêmes. Ainsi, les critères du point de terminaison sans cruauté décrits ne pourraient pas être appliqués directement sur souris plus jeunes. Si les souris plus jeunes sont utilisés dans ce modèle expérimental, ou si un modèle différent de défi avec des cinétiques différentes maladies est appliqué, puis critères de point de terminaison approprié sans cruauté doivent être développés et mis à l’essai pour éviter l’euthanasie des souris qui auraient sinon, éventuellement, récupérer. Le système de notation affiche une méthode robuste d’améliorer le classement de point de terminaison sans cruauté qui, de dépistage et de confirmation, pourrait potentiellement s’appliquer à d’autres modèles.
Chaque préparation de lisier caecum ou l’utilisation d’une nouvelle souche de souris requis la retitration de la dose de lisier caecum à administrer pour atteindre une dose létale similaire. Chaque préparation a été standardisée par la lecture d’intérêt, soit de survie, plutôt que de donner la même teneur en bactéries. Concentration de bactéries viables de chaque préparation boue caecum varie légèrement, potentiellement en raison des différences dans les bactéries commensales du donateur ou en raison des variations dans le poids à gauche dans la crépine de la cellule de la postfiltration stock de lisier caecale. Pendant le titrage du lisier caecal, les deux premières portées ont été divisées en deux groupes, et chaque moitié de la portée ont été contestés avec l’une des deux doses afin que chacune des doses serait testé dans deux portées. Si le taux de survie qui en résulte ne correspondait pas au niveau requis, puis la dose déclenchante a été augmentée ou diminuée de 5 à 10 % et l’expérience répétée. Plusieurs portées ont été utilisées pour tenir compte des différences de litière à la litière qui provoquent une résistance ou une sensibilité accrue aux septicémie à travers une litière. Il était important d’avec précision le titre le stock de lisier caecum avec chaque nouvelle préparation pour s’assurer que le nouveau titrage du caecum lisier était comparable aux précédentes préparations caecum de lisier. Périodes d’excès bruit et vibrations, particulièrement pendant le compactage de l’asphalte et la construction d’un immeuble voisin et de la route, ont été observés à augmenter le stress chez les mères. Cette corrélation avec les taux accrus de cannibalisation et affecté le taux de mortalité des expériences de survie, touchant même les souris incontestés, indiquant qu’il peut y avoir des répercussions étrangères sur la survie néonatale qui doivent aussi être contrôlés pour.
Méthodes antérieures pour préparation de lisier caecum versé l’utilisation du lisier caecum fraîche ou la préparation de boue de caecum congelé, à l’aide de diverses méthodes, y compris le stockage en glycérol qui serait inévitablement transférée pendant le défi. Bien que l’utilisation du lisier caecum frais offre l’avantage d’avoir une composition bactérienne plus proche de l’original contenu cæcal, il y a le risque de variation entre la souris donneuse en raison de la variation de bactéries commensales. Tandis que ceci a été minimisé en utilisant caecum donateurs auprès du même fournisseur avec un minimum de temps entre l’arrivée et la progression de l’expérience, cela pourrait devenir une option coût prohibitif pour certains laboratoires et présenté un autre défi logistique de chronométrage en ayant souris même âge disponibles lorsque commençant une boue caecum experiment en souris néonatales qui étaient vieux de 7 jours. Une méthode alternative à l’utilisation de lisier caecum frais a été utilisée, où contenu cæcal multiples donateurs adultes ont été regroupées, resuspendu dans D5W, congelés à-80 ° C sans glycérol et décongelé une aliquote à la fois pour des expériences. L’utilisation du lisier caecum de donneurs adultes pour étudier la septicémie néonatale pourrait potentiellement transférer des espèces de bactéries présentes dans la boue caecum qui la souris néonatale n’a pas été exposée à, mais c’est une stratégie qui permet l’étude de septicémie chez les souris néonatales et a été utilisée pour étudier la biologie de souris néonatales dans les dernières13,14,15. Caecum lisier a été dilué dans D5W pour lui fournir des éléments nutritifs pour les bactéries, ce qui a permis la mise en place d’une infection active une fois que les bactéries ont été injectés et a été fait pour imiter la disponibilité des nutriments dans la cavité péritonéale pendant nécrosante entérocolite nécrosante. Glycérol n’a pas été incluse comme agent stabilisant dans la congélation des bactéries en raison d’effets secondaires négatifs potentiels qui pourraient découler d’injection de glycérol seule. Si glycérol avait été inclus dans la préparation de lisier caecal, alors les dommages potentiels que le glycérol seul pouvait induire sera nécessaire doit être testée en incluant un glycérol seule (manque caecum lisier) injection chez la souris, ce qui aurait augmenté de souris utilisation. La viabilité des bactéries des stocks caecum lisier a été testée après congélation le stock de lisier caecum sans glycérol et s’est avérée constant, sans variation de la concentration de bactéries en aliquotes distinctes de la même préparation caecum lisier stockée à-80 ° C sur un 6 période du mois. Ceci suggère que le stockage sans glycérol est faisable en fournissant un résultat biologique cohérent. L’utilisation d’un vrac préparés congelés stock caecum de boue a également permis pour l’utilisation de souris race interne, réduisant le coût et en utilisant des souris mâles qui seraient autrement excès de l’élevage, donc réduisant le gaspillage de la souris.
L’identification des défis ayant échouées chez la souris a été importante d’éviter d’ajouter du bruit supplémentaire au système. Après avoir subi une injection intrapéritonéale de lisier caecal, les souris ont été observées pour la présence d’un renflement sous la peau, ce qui indiquait une injection défaillante qui a été effectivement sous-cutanée. Souris ont été observées des fuites au point d’injection, aussi bien immédiatement après le retrait de l’aiguille et après ce qui leur permet de franchir une étape après l’injection, parce que les souris seraient parfois (rarement) fuite seulement après le déplacement de la branche du site d’injection en prenant une étape. La présence d’un renflement ou une fuite suite à l’injection a entraîné en supprimant la souris de l’analyse. Après tout, aucun des deux pourrait entraîner un résultat différent en raison de la quantité incorrecte de caecum coulis injecté car une différence de 5 % de la dose déclenchante a été observée à affecter la survie ultérieure.
Défi de lisier caecum expérimente souvent requis variable cible des doses létales avec diverses doses ajustées au poids. Pour cette raison, volumes d’injection peuvent varier à partir d’aussi peu que 20 µL et jusqu'à 100 µL. L’erreur expérimentale proportionnée associé avec aiguille mort volume change également ainsi que le volume d’injection, plus difficile pour comparer directement les différentes doses. Avec la modification simple de normaliser le volume d’injection, cette source de variance est enlevée de l’expérience.
Système de surveillance comportementale de la souris néonatales utilisé dans le présent protocole est le premier de son genre. Intention de chercheurs effectuant des recherches éthiques avec les souris nouveau-nées sont souvent confrontés à la difficile manque de ressources pour évaluer le bien-être de l’animal à cet âge. Le système de contrôle intuitif et cohérent présenté commence à combler cette lacune. Ce qui est important, cette approche axée sur les éléments de preuve non seulement augmente la qualité des données expérimentales obtenues mais, en même temps, permet également de réduire la souffrance des animaux de laboratoire.

Une septicémie est une cause majeure de décès infectieuse nouveau-né humain1. Parce que la septicémie néonatale est mal connue, peu a progressé à la fois l’identification des nouveau-nés à risque très tôt au cours de la maladie et le développement de traitements efficaces ou prophylactiques. Cela nécessite l’utilisation de modèles animaux de septicémie à mieux comprendre les processus et test des interventions possibles. En outre, les rongeurs adultes réagissent différemment à une septicémie, avec des différences statistiquement significatives dans le nombre de bactéries à administrer pour obtenir la même dose létale (DL) et les différences dans la réponse de l’hôte qui en résulte par rapport aux nouveau-nés2. Ainsi, septicémie néonatale doit être étudiée chez les nouveau-nés. Plusieurs modèles de septicémie adultes ont été utilisés dans la recherche d’une septicémie. Il s’agit d’un défi par voie intraveineuse avec certains organismes impliqués dans l’infection humaine adulte ou ligature caecum et perforation (CLP). CLP est un modèle d’endogène défi où le caecum est chirurgicalement isolé, ligaturé et perforé pour permettre la fuite du contenu intestinal dans le péritoine, aboutissant à la diffusion systémique des microbes et de leurs produits3. Toutefois, l’intervention chirurgicale nécessaire pour établir la CLP est mortelle pour les animaux nouveau-nés ; une autre méthode est donc nécessaire pour imiter le défi polymicrobienne du CLP pour induire des infections néonatales. Le modèle de lisier caecum polymicrobienne neonatal sepsis a été développé pour répondre à ce besoin, selon laquelle le contenu cæcal des animaux est récolté, suspendu en stérile dextrose 5 % dans l’eau (D5W) et injecté par voie intrapéritonéale dans des souris nouveau-nées2. C’est, depuis, devenu un modèle de plus en plus populaire pour étudier une septicémie chez les animaux adultes et nouveau-nés et a avancé considérablement les perspicacités mécanistes dans processus4,5,6,7 de la maladie ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Étant donné l’utilisation croissante de ce modèle et de la volonté des chercheurs de comparer directement les résultats à travers des publications, il est nécessaire pour les aspects techniques être bien décrite et normalisées dans toutes les études. Normalisation s’applique à trois aspects du modèle, à savoir i) la préparation du stock lisier caecal, ii) la préparation des aliquotes de défi pour injection dans les animaux de laboratoire et iii) la définition du point de terminaison sans cruauté auquel cas animaux sont réputées survécu dans des expériences de défi. Plus précisément, méthodes pour préparer le stock de lisier caecum renvoient souvent vers l’article original présentant le modèle2. Un bref résumé de ce modèle est que contenu cæcal de souris adultes ont été récoltés, suspendu en D5W stérile à une concentration de 80 mg/mL et utilisé moins de 2 h pour injecter les animaux de laboratoire. Ce modèle original utilisé des souris du même âge, à l’emplacement du vendeur, qui étaient logés dans leurs installations de recherche respectifs pour moins de 2 semaines avant la récolte contenu cæcal. L’utilisation de souris accouplées internes, bien que réduisant le coût de livraison fournisseur régulier et autorisant l’utilisation de souris excès d’une vaste gamme de sexe et âge, également considérablement augmenté variabilité de donateurs-à-donateurs. Ceci a motivé le développement d’une technique alternative, selon laquelle contenu cæcal de plusieurs souris ont été groupés ensemble pour préparer un stock important, qui était alors aliquotés et congelés à-80 ° C13. Cette méthode alternative a été adaptée par plusieurs groupes14,15. Cependant, cette adaptation a entraîné certaines variantes techniques, tant dans les médias de stockage utilisés (10 % ou 15 % de glycérol, ou seul D5W) que dans la stratégie de filtration pour éliminer les particules (multistage filtration à travers un 860 µm et, ensuite, un 190 µm filtre, ou une personne filtrations par 100 µm ou 70 filtres µm)13,14,15. L’injection de glycérol seul pourrait potentiellement causer du tort, étant donné que les injections de glycérol de 25 % - 50 % ont été utilisées comme un modèle de rongeur de lésion rénale16,17,18,19, 20. Pour éviter des effets secondaires involontaires du glycérol, la préparation de lisier caecum stock pour la souris dans cette étude est gelée dans D5W sans glycérol, et subissent des tests de viabilité bactérienne du stockage à-80 ° C. La stratégie de filtration utilisée dans cette étude est un passage à travers un filtre de 70 µm, qui n’a pas été directement comparé aux autres stratégies filtration énumérés.
Doses létales de poids ajusté de lisier caecum injectée peuvent varier d’une installation pour l’installation et doivent être titrés out à la létalité désirée pour différents groupes. Avec des doses différentes, les volumes de défi accompagnement changent par nécessité. Cependant, ce détail méthodologique n’a été signalé avant. En outre, des stratégies pour des procédures standards, telles que l’injection intrapéritonéale, sont rarement développés au sein de la littérature, mais techniques individuelles peuvent avoir pour effet que les souris nouveau-nées fuient lorsqu’elle est injectée et impact sur leurs résultats finaux.
Bien-être des animaux, y compris une définition de point de terminaison sans cruauté, est un aspect central de ce modèle et dans n’importe quel modèle d’infection et l’inflammation chez les rongeurs,21. En 1998, le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) a publié des lignes directrices pour la sélection de point de terminaison sans cruauté, définir le point de terminaison sans cruauté, comme « toute douleur réelle ou potentielle, une détresse ou un inconfort, devrait être minimisé ou allégé en choisissant le plus tôt point de terminaison qui est compatible avec les objectifs scientifiques de la recherche »22. D’autres aussi attention que les points limites doivent être établies fondée sur une justification scientifique plutôt que sur une interprétation subjective de l’état de l’animal seul21. Bien qu’il y a une multitude de ressources pour clinique, comportementales et des critères de condition corporelle axée sur le signe pour point de terminaison sans cruauté, même dans le contexte de l’infection et l’inflammation spécifiquement21,23,24, aucune de ces , y compris les lignes directrices du CCPA pour le point de terminaison sans cruauté22, mentionner les souris nouveau-nées. Ainsi, les points limites objectivement et scientifiquement justifiées sont beaucoup plus difficiles à mettre en place pour les animaux nouveau-nés, compte tenu de leurs capacités comportementales limitées tant en l’absence de preuves de critères comme la perte de poids, qui est couramment utilisé pour adulte souris. Actuellement, les critères du point de terminaison sans cruauté servant de souris néonatales âgés de 5 à 12 jours dans la littérature de lisier caecum toute référence au manuscrit original qui a présenté le modèle2. Dans cet article original, la définition du point de terminaison sans cruauté des animaux nouveau-nés était fondée sur deux critères ; à savoir, l’emplacement d’une souris à l’extérieur du nid (diffusion) et l’absence de taches de lait avaient été vu à entraîner la mort dans les heures. Quelques complication dans l’attribution d’un point de terminaison sans cruauté, c’est que les taches de lait deviennent difficiles à voir dans les souches de souris avec fourrure sombre, comme la souche C57BL/6J couramment utilisée, après la première semaine de vie, tandis que les animaux malades sont suivis jusqu’au 14e jour de vie (DOL). Autres animaux morts se trouvent postchallenge lors de l’application de ces critères (propre observation, non publié) ; ainsi, une définition plus rigoureuse du point de terminaison sans cruauté est nécessaire pour soulager la souffrance des animaux expérimentaux et éviter la mortalité dans les situations où le résultat pourrait être précisément discerné plus tôt.
Les trois aspects méthodologiques du modèle caecum lisier sont présentés dans un mode opératoire normalisé décrivant la préparation du stock de lisier caecal, une méthode d’injection d’animaux de laboratoire, qui conserve la constante de volume d’injection entre les doses et réduit les risques de fuites et d’une définition du point de terminaison sans cruauté pour les souris âgés de 7 à 12 jours basé sur un système de modélisation comportementale. Informations comportementales des scores de santé souris parmi plus de 240 animaux de laboratoire a été collectées et regroupées selon le résultat final de la survie, démontrant une définition axée sur les éléments de preuve du point de terminaison sans cruauté. La souffrance des animaux d’expérimentation est réduite en identifiant les moribonds souris néonatales le plus tôt possible le moment, alors que les résultats de survie biologiquement significative peuvent être déduites par l’observation des variables clés. La représentation visuelle de lisier caecum préparation et des comportements de souris néonatales servira une excellente ressource pour n’importe quel groupe chargé d’étudier la septicémie ou défi nouveau-né modèle animaux.

<table><tbody><tr><td>0,1 à 20 mètres cubes Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1,8 mL Tube à microcentrifuger</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube à centrifuger</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 aiguilles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>uniquement l’aiguille, et non la seringue, utilisée pour épingler la souris à la mousse de polystyrène</td></tr><tr><td>28G 0,5 mL Seringue à insuline</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Flacon cryogénique</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube à centrifuger</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5 mL</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6 - 10 semaines C57BL/6J souris adultes</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + jour C57BL/6J souris néonatales</td><td>élevées en maison</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m Passoire à cellules</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sang de mouton défibriné</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose 5 % d’eau (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, pointe pointue</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à dissectionner, pointe tranchante/émoussée</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (HistoPrep 95 % alcool éthylique dénaturé)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>dilué à 70 % avec de l’eau double distillée</td></tr><tr><td>Marqueur résistant à l’éthanol ; Marqueur de laboratoire</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anesthesia Vaporizer</td><td>EZ Anesthesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, Instrument chirurgical de stérilisation à sec (stérilisateur à billes chaudes)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatule</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Aide-pipette</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-20</td><td>Rainin</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>Pince à spécimen</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Carré 1000 mL Bouteille de stockage Corning</td><td></td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>Planche de polystyrène</td><td>N’importe</td><td>quel n.a</td> Sure-Seal Chambre d’euthanasie <td></td></tr><tr><td>souris/rat</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Lab Vortex Mixer</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>peser papier</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de souris contrôlée pour infection polymicrobienne néonatale

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Septicémie néonatale reste un fardeau mondial. Un modèle préclinique à des interventions prophylactiques ou thérapeutiques efficaces écran est nécessaire. Infection polymicrobienne souris néonatale peut être induite par l’injection de boue caecum par voie intrapéritonéale dans jour de souris de vie 7 et leur surveillance pour la semaine suivante. Présentées ici sont les étapes détaillées nécessaires à la mise en œuvre de ce modèle de septicémie néonatale. Cela consiste à créer un stock de lisier caecum homogène, il diluer une dose ajustée de poids et de litière, un aperçu de l’horaire de surveillance et d’une définition des catégories de santé observées utilisé pour définir les points limites. La génération d’un stock de lisier caecum homogène de bailleurs de fonds mis en commun permet d’administrer en plusieurs portées au fil du temps, réduire la variation entre les donateurs et empêcher l’utilisation de glycérol potentiellement toxique. La stratégie de surveillance utilisée permet l’anticipation du résultat de la survie et l’identification des souris qui progresserait plus tard à la mort, ce qui permet une identification antérieure du point de terminaison sans cruauté. Deux principales caractéristiques comportementales sont utilisés pour définir les scores de la santé, à savoir, la capacité des souris néonatales à droite eux-mêmes lorsqu’il est placé sur leur dos et leur niveau de mobilité. Ces critères pourraient potentiellement être appliqués aux points limites adresse dans d’autres études de maladies néonatales chez les souris, tant qu’une étude pilote est effectuée pour confirmer l’exactitude. En conclusion, cette approche fournit une méthode normalisée de septicémie néonatale modèle chez la souris, tout en fournissant des ressources pour évaluer le bien-être des animaux utilisé pour définir les points limites précoces pour animaux contestée.

Viabilité de caecum lisier stockée à-80 ° C peut être testée au fil du temps par dilution en série et de placage aliquotes de stock de lisier caecum sur gélose trypticase soja au sang de mouton 5 % suivie par 24 h d’incubation en aérobiose à 37 ° C. A posteriori de comptage de la teneur en unité (CFU) cultivables formatrices d’une préparation de lisier caecum n’a ne pas pour changer sur une période de 6 mois, et la viabilité n’est pas affectée par un stockage prolongé à-80 ° C (Figure 2). La souris de chaque donateur a entraîné, en moyenne, assez lisier caecum de contester les trois ou quatre portées (données non présentées).
Souris soumises au DOL 7 à lisier caecum pour induire infection polymicrobienne a commencé à atteindre le point de terminaison sans cruauté dans les 12 h de la contestation, et infection polymicrobienne a été résolue pour la plupart par postchallenge de 48 h, tel qu’observé dans une courbe de survie de Kaplan-Meier combinée de données provenant de plus de 200 souris contestées (Figure 1 a). La létalité était dépendante de la dose déclenchante administrée, avec un changement de 5 % de la dose de provocation ayant pour résultat un à peu près 15 % de différence dans les taux de survie (Figure 1 b). Le poids de corps de la souris a été mesuré à chaque visite de suivi. Perte de poids a été observée chez tous les animaux handicapés, être non discriminatoires entre souris qui a fini de survivre et ceux qui ne pas pendant les premiers 24 h postchallenge (Figure 1). Après 24h, animaux plus survivants ont commencé à regagner leur poids, tandis que tous survécu a continué à perdre du poids et s’installe à leur point de terminaison sans cruauté. Toutefois, une faible proportion des animaux qui avaient conservé leur réflexe de redressement a également continué à perdre du poids ou n’a pas de gain de poids, jusqu'à la fin de l’expérience, même perdre autant que 20 % de leur poids corporel initial dans les 40 h du défi survivants. Car il y avait un chevauchement de perte de poids entre les souris qui a fini de survivre et ceux qui n’ont pas, le changement de poids ou un seuil de perte de poids ne pourrait pas être utilisé comme critère pour point de terminaison sans cruauté tout en conservant l’objectif de diviser avec précision les survivants de survécu.
Le comportement de souris a été suivi comme indiqué dans le protocole et dans le tableau 2. Instantanés de la santé, les catégories sont affichent (Figure 3 a- C). Ces photos montrent les catégories santé différentes de souris qui a échoué à droite eux-mêmes après avoir été placé sur le dos et exposer brièvement la différence entre FTR-Mobile et FTR-léthargique, qui est une distinction importante. Chez la souris incontestée de cet âge ne s’affichent pas activité FTR-léthargique ; par conséquent, cette catégorie de la santé est un marqueur de la maladie et une réponse au défi. Malade souris affichent FTR-léthargique symptômes (Figure 3 b) et pourraient régresser vers FTR-Nonmobile (Figure 3), où le haut de la jambe reste parallèle à la jambe inférieure, avec peu ou zéro hanche bascule le mouvement, qui est l’un des critères de point de terminaison sans cruauté. Les souris pourraient aussi récupérer, gagne une mouvement de hanche et devenir FTR-Mobile (Figure 3 a). Le réflexe de redressement et les scores de mobilité ont été déterminées pour le gauche et le côté droit de chaque souris, et le score le plus élevé a été utilisé pour déterminer si la souris avait atteint un point de terminaison sans cruauté. Behavioral renseignements ont été recueillis parmi plus de 240 animaux soumises à une dose létale 60 (LD60) de lisier caecum et 144 points limites ont été observés (Figure 3D-F et tableau 1). Cette approche axée sur les éléments de preuve a été utilisée pour définir et affiner le point de terminaison sans cruauté à travers quatre étapes de la maladie, catégorisés par les expérimentateurs basées sur les différences de comportement entre les survivants et survécu et par la fraction de points limites atteint au cours de chaque période. Au cours de premières expériences, souris FTR-Nonmobile qui n’avaient aucun mouvement de hanche trouvées constamment épuisée au bout de 4 à 6 h de ce comportement observé. Dans la collection des informations présentées, un score d’intégrité FTR-Nonmobile a été utilisé comme critère pour un point de terminaison sans cruauté. De postchallenge 12-21 h, tandis que les souris FTR-Nonmobile ont été euthanasiés, éteintes et survivants animaux affichent des comportements très similaires et ne pouvaient être distingués de toute autre manière (Figure 3D). Postchallenge 21-48 h, la majorité des survivants de souris retrouvé leur réflexe de redressement, tandis que moins de 1 % des comportements FTR observés chez les animaux qui iraient à survivre à l’expérience (Figure 3E). Ainsi, les souris qui n’ont pas eux-mêmes à droite des deux côtés est devenu un critère supplémentaire pour le point de terminaison sans cruauté pendant cette période. Entre 12 et 20 h postchallenge, 12,5 % du nombre total de points limites ont été observés, contre 80,5 % entre 20 et 48 h et 7 % après 48 h (tableau 1). Des traits distinctifs entre souris qui a fini qui survivent et qui finalement s’est aggravée à un point de terminaison sans cruauté a été la perte du réflexe de redressement, indépendant de la mobilité de hanche (Figure 3F). En effet, entre 20 et 48 h après le défi, un total de 121 souris n’ont pas eux-mêmes à droite des deux côtés, avec 116 de ces souris progresse finalement à un point de terminaison sans cruauté (ce qui représente un 96 % de précision dans l’identification des souris qui ne récupérerait pas). Au-delà de 48 h après le défi, 11 souris ont été observés à l’échec à droite eux-mêmes des deux côtés et 10 de ces ont progressé à un point de terminaison sans cruauté (une précision de 91 %). Au-delà de 20 h après le défi, le nombre de souris qui a perdu le réflexe de redressement pour les deux parties a prédit le résultat final avec une précision de plus de 90 % ; par conséquent, ceci a été ajouté aux critères de point de terminaison sans cruauté, pour identifier plus tôt les souris nonrecovering et réduire les souris souffrant (tableau 1).
La fréquence que les souris ont besoin de surveillance change au fil du temps, en raison des différents taux de postchallenge de la mort et est décrit dans le tableau 1. Une souris était censée être à son point de terminaison sans cruauté à tout moment si elle n’avait pas droit lui-même et indiqués non mobile mouvement de hanche des deux côtés, ou si la souris a été trouvée dispersés du nid, n’a pas pu lui-même à droite et mouvement de hanche léthargique. Souris avec l’autre de ces conditions ne s’attendait pas à pouvoir rejoindre la litière et ont été observés à FTR-Nonmobile au sein de 4 à 6 h. à partir de 20 h après le défi, un nouveau point de terminaison sans cruauté a été ajouté parce que les informations présentées montrent que la vaste majorité des souris qui FTR des deux côtés finit par succomber à la maladie.
Les vidéos, les tables et les ressources présentés dans ce manuscrit sont une ressource pédagogique efficace pour l’affectation correcte comportementale de souris contestées. Sept expérimentateurs ont été invités à regarder la vidéo de formation et de lire le protocole et les tableaux avant d’assigner des comportements à 60 animaux contestée. L’identification de la cession de point de terminaison sans cruauté était exacte tant pour distinctif FTR-Nonmobile souris de la souris qui affiche les autres comportements (Figure 4 a) et des souris FTR des souris qui ont pu eux-mêmes droit dans le délai autorisé ( Figure 4 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Figure 1 : Courbe de survie Kaplan-Meier, titration de dose de lisier caecum et le changement de poids après le défi de lisier caecal. (A) résultat de la survie de souris C57BL/6J néonatales avec une injection intrapéritonéale de lisier caecum à 7 DOL. Les données pour cette figure ont été combinées d’expériences indépendantes à l’aide de multiples défi doses, de 0,7 à 1,3 mg de lisier caecum par gramme de poids corporel a été administrés à ces souris. (B) souris néonatales soumises à 0,80 à 0,95 mg de lisier caecum par gramme de poids corporel d’une préparation de lisier caecum affichent une relation dose-dépendante entre la quantité de boue caecum étant donné et le pourcentage de survie. ()C) la variation en pourcentage du poids par rapport au poids de défi, avec la ligne pointillée indiquant une perte de 20 % du poids de l’époque de la contestation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Figure 2 : Concentration d’UFC en stock caecum lisier stocké à-80 ° C ne change pas pendant une période de 6 mois. L’effet de l’âge du caecum de boue sur la concentration de l’UFC a été testé à l’aide de la régression linéaire. Chaque point représente une aliquote de la préparation de lisier caecal, en série, dilué et plaqué sur une période de 6 mois. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Figure 3 : Catégories de mobilité des souris qui ne parviennent pas à droite eux-mêmes et des comportements animaux à divers temps postchallenge de la hanche. Souris qui ont été contestées avec septicémie, lorsqu’il est placé sur le dos, affiche des signes de morbidité qui peut être mesurée par le degré de mouvement de hanche. (A) A fail à droite (FTR)-souris Mobile montre hip mouvement de balancement de leur patte supérieure à angle de 90 ° de l’horizontale. (B) An FTR-léthargique spectacles hip bascule le mouvement de la souris mais ne dépasse pas l’angle de 90 ° de l’horizontal à tout moment au cours de la 4 s de surveillance. (C) certains FTR-Nonmobile souris seront étendra leur jambe, flexion au niveau du genou, mais montrent très peu (moins que les angles de 10 °) à zéro à bascule mouvement et les jambes des hanches restent parallèle entre eux. Postchallenge de 12 à 21 h (D) les comportements animaux montrent que seuls les comportements FTR-Nonmobile séparent survivants de survécu. (E) du 21 au postchallenge de 48 h, seulement 4 sur les comportements FTR observées 592 (0,67 %) appartiennent aux survivants, ce qui permet le redressement réflexe pour prédire le résultat final et être utilisée comme un critère nouveau point de terminaison sans cruauté. (F) au-delà de 48 h après l’infection, les souris de 6 sur 131 (4,55 %) qui avaient un réflexe de redressement sont devenue partie du groupe FTR et ont été sacrifiés par la fin de l’expérience, justifiant une surveillance soutenue tout au long de la récupération. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Figure 4 : Ressources pédagogiques entraînent une classification comportementale précise par les expérimentateurs indépendants. Expérimentateurs formés en regardant la vidéo qui accompagne le présent protocole classés en vidéos de 60 souris néonatales en groupes différents santé. (A) la capacité de distinguer un point de terminaison sans cruauté a été déterminée et une moyenne de 97 % des comportements a été correctement classée comme FTR-Nonmobile ou non, tandis que seulement 1 % des souris FTR-Nonmobile ont été identifiés. Deux pour cent des souris ont été faussement identifiés comme FTR-Nonmobile. (B) l’identification du point de terminaison sans cruauté deuxième critérium de distinguer correctement les souris FTR ou celles ayant la capacité de droite eux-mêmes au sein de 4 s d’être placés sur le dos a été correctement assignés dans 97 % des arrangements, alors que seulement 0,96 % des souris ont été incorrectement assignés comme se redresser et 2 % des souris ont été incorrectement assignés comme FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stade de la maladie</td>
			<td>A: une morbidité élevée, aucun cas de mortalité</td>
			<td>B: forte morbidité, mortalité faible</td>
			<td>C: forte morbidité, mortalité élevée</td>
			<td>D: faible morbidité, faible mortalité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heures après défi</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fréquence des contrôles</td>
			<td>défi post 2 h</td>
			<td>chaque h 4−6</td>
			<td>Chaque 4−6 h, 8 h, du jour au lendemain sans surveillance</td>
			<td>1−2 fois par jour, plus si nécessaire</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proportion du totales points limites observées</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pourcentage de points limites observées</td>
			<td>0 %</td>
			<td>12,5 %</td>
			<td>80,5 %</td>
			<td>7 %</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Critères de point de terminaison sans cruauté</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile des deux côtés</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile des deux côtés</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. dispersés du nid et est FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">2. dispersés du nid et est FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR à gauche ou à droite (avec un score de mobilité)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : fréquence des critères de point de terminaison de surveillance et humain aux différents stades de la maladie. Fréquence de surveillance, points limites observées, le pourcentage des points limites et des critères de point de terminaison sans cruauté au cours des différents stades de la maladie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réflexe de redressement</td>
			<td>Mobilité</td>
			<td>Délai à droite après avoir été placé sur le dos</td>
			<td>Date limite de mesure de quantité de mouvement (mobile / léthargique / non mobile)</td>
			<td>Critères de notation de mobilité</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Droits</td>
			<td>Mobile</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Une supplémentaire 8 s</td>
			<td>La souris prend plusieurs étapes d’affilée, soutenir l’élan vers l’avant et explore son environnement. Chiot ne tombera pas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Léthargique</td>
			<td>La souris peut prendre mais sera arrêter et faire une pause avant de prendre une autre. Chiot peut tomber.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>La souris ne prend pas des mesures après redressement lui-même. Chiot peut tomber.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Ne parviennent pas à droite</td>
			<td>Hanches mobiles</td>
			<td rowspan="3">Les 4 mêmes s utilisé pour mesurer le réflexe de redressement</td>
			<td>A énergique mouvement de hanche avec la cuisse faisant tourner au-delà de 90° de l’horizontal au moins une fois tous les 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hanches léthargiques</td>
			<td>Mouvement de hanche jusqu'à mais pas au-delà de 90° de l’horizontale.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hanches non mobiles</td>
			<td>Membres peuvent se déplacer en étendant et en rétractant mais les hanches ne tournera pas. Chiot semble très malade.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : suivi de tableau et les critères de calcul de la note de santé des souris. Les critères fournis ont été utilisées pour définir des groupes de catégories de santé à des souris et de réduire la variance individuelle dans l’attribution de scores d’intégrité.

Ce protocole prévoit les mesures nécessaires pour établir et évaluer les infections néonatales chez les souris âgées de 7 jours.

Un modèle de souris contrôlée pour infection polymicrobienne néonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Le modèle de boue cecal pour la septicémie polymicrobienne est un outil puissant pour disséquer la pathophysiologie néonatale unique. Il peut être variable, et les critères d’évaluation humains ne sont pas bien décrits. Ici, nous présentons notre procédure hautement standardisée pour préparer une boue cecale et injecter dans les animaux expérimentaux.De plus, nous utilisons une approche axée sur les données pour identifier les chiots moribonds le plus tôt possible. Commençons par préparer un bouillon de boue cecal congelé. Ceci est fait en mettant en commun concent cécal d’au moins cinq souris adultes, la suspension dans l’eau stérile dextrose, et le stockage à moins 80 pour une utilisation ultérieure.Vous pouvez utiliser des mâles ou des femelles, mais le sexe, l’âge et le fond des souris pour vos expériences doivent être maintenus constants. Tout d’abord, préparons nos outils pour la dissection. Il s’agit notamment d’un ensemble de ciseaux et de forceps pour la peau et un deuxième ensemble pour les organes internes.Allumez le stérilisateur de perles chaudes au moins 30 minutes avant l’utilisation. Tremper les outils dans 70% d’éthanol, puis les plonger dans le stérilisateur de perles chaudes pendant au moins une minute. Vaporiser un tapis de serviettes en papier avec 70% d’éthanol, puis retirer les outils du stérilisateur sans toucher la partie stérilisée de l’outil aux poignées non stériles d’autres outils.Placez-les sur le papier absorbant pour les refroidir. Disséquer les souris dans un cabinet de sécurité biologique. Épinglez les pattes de la souris sur une planche en polystyrène à l’aide d’aiguilles de calibre 23 afin que la souris soit en forme d’abdomen.Vaporiser l’abdomen avec 70% d’éthanol. À l’aide de forceps et de ciseaux stériles, couper la peau, desserrer la peau de la muqueuse péritonéale avec les ciseaux et ouvrir une région rectangulaire de l’aine au sternum et du côté gauche au côté droit. Retirer toute fourrure autour du péritoine.Passez à une nouvelle paire d’outils stériles pour couper à travers le péritoine, faisant également une ouverture rectangulaire. Identifiez le cecum, qui devrait être en cours d’exécution côté gauche à droite à travers le corps. Perturber le tissu conjonctif pour identifier les branches de cecum des intestins et couper le cecum loin des intestins.Placez-le sur une feuille de papier pesé stérilisé. À l’aide d’outils stériles, couper à travers les deux extrémités du cecum. Tenez le milieu du ccum avec des forceps et utilisez une spatule en métal plat pour pousser doucement le contenu cécal hors des extrémités à l’aide d’un mouvement de roulement.Recueillir le contenu et les placer dans un tube de centrifugeuse pré-pesé de 15 millilitres. Mettre en commun le contenu cécal d’un maximum de cinq souris dans le même tube. Weight le tube à nouveau une fois que tout le contenu a été ajouté.Pour calculer le volume d’eau dextrose à ajouter au contenu cécal dans chaque tube, divisez le poids du contenu cécal dans le tube par votre concentration désirée en milligrammes par millilitre. Gardez un aliquot d’eau dextrose sur la glace pour la re-suspension du contenu cécal. Ajouter la quantité requise d’eau dextrose au tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant du contenu cécal.Vortex le tube verticalement et horizontalement pendant environ 30 secondes. Observez la présence de particules de plus de quelques millimètres de diamètre et, si elles sont présentes, continuez à vortexer jusqu’à ce que toutes les particules aient été visiblement disparues. Placez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace pour recueillir le filtrate et installer une passoire stérile de 70 micromètres sur le dessus.Pipette quatre millilitres de boue re-suspendue à partir d’un tube de 15 millilitres sur la passoire cellulaire et dans le tube de collecte. Suspendre à nouveau le particulaire en faisant monter et descendre deux à trois fois. Extruder délicatement les bulles pour augmenter la vitesse de filtrage tout en remuant le contenu avec la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide filtré.Cela devrait prendre environ 30 secondes. Changez les passoires cellulaires entre chaque tube de boue cecale, mais mettre en commun tout le contenu dans le même tube de collecte de 50 millilitres. Si votre stock dépasse 40 millilitres, puis vortex pendant 15 secondes, et placer 20 millilitres dans un nouveau tube de centrifugeuse.Divisez le lisier en flacons cryogéniques de 500 microlitres aliquots chacun. Vortex la boue entre tous les trois flacons. Gardez le stock principal dans des flacons sur la glace.En stockant des aliquots à moins 80, la colonie aérobie formant une concentration unitaire dans une préparation de boue cecale ne change pas sur une période de six mois. Maintenant que le lisier cecal est préparé, nous pouvons l’utiliser pour contester une portée de souris âgées de sept à huit jours avec une dose ajustée en poids de boue cecale. La létalité du lisier dépend de la dose.Vous devrez déterminer la dose létale désirée dans votre établissement pour chaque nouveau stock avec une nouvelle titration de dose. Un aliquot d’injection de boue cecal est préparé par portée. Nous normalisons l’inoculum à un volume de 100 microlitres, arrondissant aux 10 microlitres les plus proches pour chaque animal dans la litière.La préparation du défi aliquot nécessite trois calculs, le volume de stock de boue requis, un volume supplémentaire d’eau dextrose, et le volume arrondi pour chaque chiot dans la litière. Les détails sur la façon d’effectuer chaque calcul peuvent être trouvés dans la section trois du protocole. Effectuer ces calculs à la main pour chaque expérience peut prendre beaucoup de temps et contribuera à l’erreur expérimentale, de sorte qu’une feuille de calcul peut être téléchargée avec le protocole où vous entrez votre concentration de stock, dose désirée, et le poids de votre litière, et la quantité de bouillon de boue, le volume d’eau dextrose, et le volume réel par chiot est automatiquement retourné.Vous pouvez imprimer cette feuille et l’emmener avec vous lorsque vous êtes prêt à défier vos animaux. Préparez l’injection aliquot dans un coffret de sécurité biologique et gardez-la sur la glace. Avant de charger la seringue, mélanger le tube de microcentrifugeuse en feuilletant 20 fois.Les chiots sont confrontés à une seringue à insuline de calibre 28. Avant d’élaborer le lisier, mélanger l’aliquot en inspirant et en éjectant 300 à 500 microlitres du défi aliquot dans et hors du tube de microcentrifugeuse. Ensuite, dessinez environ 150 microlitres du défi aliquot.Ceci devrait être plus grand que le volume d’injection pour n’importe quel chiot de sept à huit jours. Feuilletez la seringue pour déloger les bulles du piston et reculez légèrement sur la seringue pour expulser les bulles d’air. Ne touchez pas l’aiguille ou l’arbre du piston pendant ce processus.Distribuez l’excès de boue cécale dans le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce que la quantité calculée de boue cecale pour la souris soit chargée dans la seringue. Le lisier cecal est administré avec une injection intraperitoneal. Effectuez-le selon le protocole de votre établissement de soins aux animaux.Pour minimiser les fuites, inclinez le chiot vers le bas et insérez l’aiguille entre la jambe et les organes génitaux, en gardant l’aiguille peu profonde et sous-cutanée. Après avoir inséré l’aiguille d’environ un centimètre, appuyez vers le bas et vers l’avant jusqu’à ce que vous sentiez l’aiguille percer le péritoine, puis lentement déprimer le piston. Retirez soigneusement l’aiguille en suivant la même route que vous êtes entré, relaxant votre majeur que vous le faites.Notez les fuites dans votre carnet de laboratoire et envisagez d’omettre les animaux avec des fuites importantes de votre résultat final. Dans cette section, nous exposerons les différents niveaux de santé que nous observons chez les souris atteintes de septicémie polymicrobienne et leur point de terminaison humain correspondant. Pour toutes les procédures impliquant des souris néonatales, nous transférons le matériau de literie dans une nouvelle cage.Cela transfère l’odeur de la dame sur vos gants et réduit le stress sur la dame de l’entrée répétée dans sa cage. Nous faisons un deuxième nid dans la nouvelle cage pour retenir les chiots surveillés jusqu’à la fin de la procédure ou de surveillance lorsque toute la litière est prête à être retourné à la cage de la dame. Placez une souris sur son dos et surveillez la capacité de droit dans les quatre secondes.Si c’est le cas, attendez huit secondes de plus pour déterminer le niveau de mobilité. Une souris incontestée ou en convalescence est le plus souvent capable de redresser et d’explorer son environnement en prenant plusieurs étapes d’affilée. Regrouper les souris capables de se redresser et de prendre quelques mesures pour explorer son environnement en tant que léthargiques des droits.Ces souris peuvent tomber tout en faisant un pas et l’air fragile sur leurs pieds. Une souris qui est incapable de droite et a le mouvement de la hanche qui dépasse 90 degrés de l’horizontale, nous groupons comme ne parviennent pas à droite-mobile. Cette souris finira par droite, mais ne peut pas dans les quatre secondes.En raison de ses mouvements de hanche, il est groupé comme ne parviennent pas à droite-mobile. Les chiots qui ont été incapables de droite et ont un mouvement de la hanche inférieur à 90 degrés de l’horizontale sont regroupés comme ne parviennent pas à droite léthargique. Il s’agit d’un autre exemple d’une souris dont les hanches ne dépassent pas 90 degrés de l’horizontale et est regroupée comme ne parviennent pas à droite léthargique.Un chiot qui ne parvient pas à la droite-nonmobile aura des jambes qui peuvent trembler ou vibrer, mais n’ont pas de mouvement de la hanche. Les membres peuvent s’étendre et se rétracter, mais n’auront pas de mouvement latéral. Le chiot est visiblement malade et a atteint le point de terminaison humain.Il s’agit d’un autre exemple d’échec à droite-non mobile chiot. Ses hanches ne tremblent pas de gauche à droite, mais ses pattes vibrent. Lors de la manipulation de la cage de la dame, les chiots peuvent être traînés hors du nid si la dame infirmière fonctionne.Nous les remplaçons et vérifions ensuite si d’autres chiots épars sont loin de leurs compagnons de nidification. Si ces chiots dispersés ne parviennent pas à droit-léthargique, ils sont à un point de terminaison humain. Voici une courbe de survie Kaplan-Meier de notre modèle de septicémie.Les points de temps de surveillance peuvent être trouvés dans le SOP ci-joint. À tout moment le long de la courbe de survie, si une souris ne parvient pas à se démobiliser à droite, elle est à son point de terminaison humain et euthanasié. Entre 12 et 21 heures après le défi, les souris apparaîtront malades et environ la moitié des souris seront en mesure de droite d’un côté, tandis que l’autre moitié ne parviennent pas à droite de l’un ou l’autre de leurs côtés.C’est le délai où les souris vont commencer à digresser dans le score de santé et d’atteindre le point final humain de ne pas à droite-nonmobile. Il s’agit de résultats représentatifs des scores de santé observés au cours de cette période. Les groupes de survivants et de non-survivants ne peuvent pas être différenciés à ce stade en fonction de leurs scores en matière de santé.À ce stade de la maladie, 21 à 48 heures après le défi, nous observons la plus forte proportion de critères d’évaluation sans être humain. Nous avons également observé que la grande majorité des souris qui sont incapables de redresser les deux côtés ne finiront pas par se remettre d’une maladie, qui devient donc un nouveau critère pour un critère d’évaluation humain en plus de l’échec des critères de droit non mobiles. Les scores de santé observés à ce stade de la maladie ont entraîné une séparation des survivants des non-survivants.La grande majorité des souris qui n’ont pas pu se redresser des deux côtés ne se sont pas rétablies de la maladie. Ces données soutiennent qu’un nouveau critère pour le point de terminaison humain commençant à 21 heures après le défi devrait être d’euthanasier toutes les souris qui ne parviennent pas à droite des deux côtés. Plus de 48 heures après le défi de nombreuses souris vont commencer à afficher plus d’activité et un meilleur réflexe de droitage.Même si la proportion de critères d’évaluation humains est plus faible au cours de cette période, les souris peuvent encore s’écarter et devenir plus malades, et elles nécessitent toujours une surveillance du point de terminaison humain. Au cours de cette période, certaines de ces souris qui ont finalement été regroupées comme non-survivantes avaient montré une activité accrue à un moment donné, mais plus tard ont fait pire et ont atteint un point de terminaison humain. Cela nécessite une surveillance continue des animaux malades avec une fréquence accrue s’ils commencent à afficher de pires résultats pour la santé.Les expérimentateurs indépendants qui n’ont pas reçu de formation en personne et qui n’observent que cette vidéo pédagogique ont été testés dans leur capacité d’attribuer le même score que les enquêteurs à l’aide de vidéos de test enregistrées. Cette vidéo pédagogique se traduit par une classification comportementale précise. La capacité d’attribuer le score correct pour ne pas tomber aux souris néonatales droit-non mobiles, qui est une mesure du point final humain, a été déterminée à partir de 60 souris néonatales, et une moyenne de 97% des comportements ont été distingués avec précision, avec seulement 3% étant mal identifiés.Ensuite, la capacité de différencier les souris néonatales qui n’ont pas réussi à droit ou qui ont été en mesure de droit dans les quatre secondes a été testé. Il s’agit d’une autre mesure du point de terminaison humain et a été attribué avec précision chez 97% des souris néonatales, tandis que 3% des chiots ont été incorrectement assignés comme le droitage. Voici des résultats représentatifs pour le changement de poids en pourcentage des souris par rapport à leur temps de défi.Le changement de poids moyen entre les survivants et les non-survivants a commencé à se séparer 24 heures après le défi, mais il y a beaucoup de chevauchement entre les groupes. Certains survivants ont perdu plus de 20 % de leur poids, mais se sont tout de même remis de la maladie. Le changement de poids n’a pas été aussi efficace pour prédire les résultats que par rapport aux différences dans les scores de santé, c’est pourquoi il n’est pas utilisé comme un critère pour déterminer si les souris sont à un critère d’évaluation humain.Pour conclure, vous devriez maintenant être en mesure de préparer un stock de boue cécale congelée, calculer la dose ajustée en fonction du poids. Et injecter et surveiller les souris nouveau-nées pour les critères d’évaluation humains. Nous espérons que ce sera une ressource précieuse pour votre recherche sur la souris.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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