Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit
November 8th, 2018
Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des neurosciences en fournissant une méthode plus simple, moins sujette aux erreurs et plus quantitative pour vérifier les lésions et localiser les emplacements des électrodes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la vérification des lésions et des sites d’électrodes dans l’ensemble du cerveau sans avoir besoin de sectionner. Le produit final est un volume numérique 3D du cerveau et plusieurs cerveaux peuvent être traités en parallèle.
Bien que cette méthode sera démontrée chez le rat, elle peut également être appliquée à d’autres organismes, tels que les souris et les pinsons zébrés. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que certaines étapes nécessitent des soins particuliers pour assurer les meilleurs résultats. Pour commencer, placez un cerveau extrait dans une solution de profusion dans un tube conique de 50 millilitres.
Conserver l’échantillon pendant deux à trois jours avec des secousses douces à quatre degrés Celsius. Assurez-vous que l’osmium est dilué dans l’eau et non dans un tampon. C’est parce que l’eau agira comme un détergent doux, permettant à l’osmium de pénétrer profondément dans le tissu.
Préparer 50 millilitres de 2% de tétoxyde d’osmium dans de l’eau double-distillée. Placez ensuite le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et ajoutez la solution de tétoxyde d’osmium. Fermez le tube et scellez-le avec du film de paraffine pour éviter les fuites.
Conserver le tube scellé à quatre degrés Celsius avec une légère secousse pendant deux semaines. Assurez-vous que le tube est placé horizontalement. Le cerveau est très épais et un long chemin à parcourir par diffusion.
Placer le tube horizontalement permettra à l’osmium de voyager plus profondément dans le tissu. Après l’incubation de l’échantillon pendant deux semaines, lavez-le avec de l’eau doublement distillée cinq fois pour retirer tout le tétoxyde d’osmium non lié de l’échantillon. Ensuite, lavez l’échantillon avec de l’eau doublement distillée pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Remplacer l’eau doublement distillée par quatre dilutions d’éthanol pour déshydrater l’échantillon. Pour commencer le processus d’infiltration de résine, déplacez l’échantillon à travers trois dilutions de résine d’acétone et trois dilutions de résine d’acétone, puis immerger l’échantillon dans 100% résine à température ambiante pour poursuivre le processus d’infiltration. Après cela, transférer l’échantillon dans un moule jetable.
Infuser l’échantillon de résine fraîche à 100 % pendant quatre heures à température ambiante. Dégazer l’échantillon dans un four à vide pendant 15 minutes à 45 degrés Celsius. Puis guérir l’échantillon dans un four pendant 48 heures à 60 degrés Celsius.
Enfin, lorsque l’échantillon a fini de guérir, décoller le moule jetable et le scanner avec la machine Micro-CT. Dans les sections traditionnelles, l’orientation du cerveau doit être prédéterminée. En utilisant cette méthode micro-CT, le volume numérique du cerveau de l’échantillon peut être manipulé en trois dimensions et pratiquement tranché dans n’importe quelle direction.
La microscopie électronique de balayage du cerveau préparé de rat confirment que le tissu n’a pas été sensiblement endommagé aux fins de la formation image de Micro-CT. Un cerveau de pinsons zébrés a également été préparé et scanné selon ce protocole pour tester l’utilité de cette méthode sur d’autres cerveaux de petits animaux. Cette technique peut être utilisée pour trouver des lésions de surface dans le cerveau, ainsi que des lésions profondément dans le cerveau.
Cette technique peut également être appliquée à l’emplacement des tétrodes simples in situ, des lésions électrolytiques, des traces d’électrodes, des réseaux de tétrode in situ et des sondes de silicium in situ. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de permettre au cerveau d’incuber assez longtemps et avec suffisamment d’agitation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’optogénétique et l’imagerie à deux photons peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le rôle que jouent les différentes zones cérébrales dans différents comportements.
Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine des neurosciences de mieux explorer les relations structure-fonction entre le cerveau et le comportement chez les rats, les souris, les oiseaux chanteurs et d’autres petits animaux. N’oubliez pas que travailler avec de l’osmium peut être extrêmement dangereux et des précautions, comme le port de gants et le travail dans une hotte sous vide doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode de préparation de cerveaux d'animaux de petite taille, en particulier de cerveaux de rat, pour l'imagerie micro-CT. La technique vise à quantifier les lésions et à localiser précisément les électrodes sans nécessiter de sectionnement, produisant un volume numérique 3D complet du cerveau.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
- Analyse des lésions
Contexte
- L'imagerie micro-CT permet une analyse non destructive des structures cérébrales.
- Les méthodes de sectionnement traditionnelles peuvent être sujettes à des erreurs et limitent la flexibilité d'orientation.
- Cette méthode améliore la capacité à analyser les lésions et le placement des électrodes.
- Applicable à différents petits animaux comme les souris et les pinsons.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de préparation simplifiée et moins sujette aux erreurs pour l'imagerie micro-CT.
- Fournir une localisation précise des lésions et des électrodes.
- Faciliter la manipulation 3D des échantillons de cerveau pour une analyse améliorée.
Méthodes utilisées
- La plateforme principale utilisée est l'imagerie micro-CT d'échantillons de cerveau préparés.
- Le modèle biologique clé est le cerveau de rat, mais la méthode est adaptable à d'autres petits animaux.
- La méthode implique des périodes d'incubation spécifiques et l'utilisation de tétroxyde d'osmium pour la préparation des tissus.
- Les étapes critiques comprennent le placement horizontal du tube et plusieurs étapes de lavage pour assurer la pénétration de l'osmium.
- La préparation finale inclut le durcissement de la résine et le balayage avec une machine Micro-CT.
Résultats principaux
- Cette méthode permet la visualisation des lésions superficielles et profondes du cerveau.
- Elle permet l'identification précise des pistes d'électrodes et des lésions tout en maintenant l'intégrité des tissus.
- Les échantillons scannés montrent que les dommages aux tissus sont minimes, confirmant l'applicabilité de la technique.
- La procédure peut soutenir d'autres expériences comme l'optogénétique et l'imagerie à deux photons.
Conclusions
- Cette étude démontre une méthode efficace pour préparer les cerveaux d'animaux pour une analyse détaillée en utilisant la micro-CT.
- La technique permet aux chercheurs d'explorer le comportement des neurones et les relations structurelles sans endommager les échantillons.
- Dans l'ensemble, elle améliore les capacités de la recherche en neurosciences pour comprendre la mécanique du cerveau.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
