Name: Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Découvrez une méthode de micro-CT pour localiser précisément les lésions et les électrodes dans le cerveau entier de petits animaux sans sectionnement. Cette technique produit un volume 3D numérique pour une analyse complète des structures cérébrales.

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Les auteurs remercient Greg Lin et Arthur McClelland pour leur expertise avec la machine micro-CT, David Richmond et Hunter Elliott à l’Image et analyse de données Core (IDAC) à la Harvard Medical School pour leur conseils de traitement d’image et William Liberti à Boston Université de fournir gracieusement un cerveau zebra finch. Ce travail a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS est une partie de l’Université Harvard. Ce travail a été soutenu par Richard et Susan Smith Family Foundation et IARPA (contrat #D16PC00002). S.B.E.W. a été soutenu par les bourses de l’Human Frontier Science Program (HFSP ; LT000514/2014) et l’European Molecular Biology Organization (EMBO ; ALTF1561-2013). G.G. a été soutenue par la National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship programme (GRFP).

Tous les soins et la manipulation expérimentale d’animaux ont été examinées et approuvées par la Harvard Institutional Animal Care et utilisation. La perfusion décrite ici est spécifique pour les rats, mais la procédure est applicable à tous les animaux avec des cerveaux plus petits ou de taille similaire.
1. la perfusion
<ol><li>Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour un rat (âge : 0,5 – 1,5 ans, poids : 250 à 600 g), 800 – 1000 mL devrait suffire. 400 mL permet de perfuse l’animal et une autre 400 mL à diluer le fixateur.</li>
	<li>Préparer le fixateur consistant de paraformaldéhyde à 2 % (p/v) (PFA) et de 2,5 % (p/v) de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS 1 x. Pour un rat, 400 mL est suffisante. Économisez 50 mL dans un tube conique de 50 mL pour après fixation du cerveau après la perfusion.</li>
	<li>Anesthésier le rat avec 4 à 5 % isoflurane gaz (à 0,8 L/min O2 à 1,0 bar à 21 ° C) pendant 15 min.</li>
	<li>Injecter une dose létale de pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale (180 mg/kg).</li>
	<li>Test pour la perte de réflexe chez l’animal en procédant à un examen de réflexe orteil-pincée. Attendre pour commencer la perfusion jusqu'à ce que l’animal a perdu sa réponse réflexe.</li>
	<li>Suivez l’intracardial décrite précédemment la perfusion et le cerveau extraction protocole14 avec les solutions suivantes : perfuse l’animal avec 400 mL de PBS 1 x 125 mm Hg pour enlever le sang. Une fois que tout le sang a été supprimé et remplacé par 1 x PBS, commencer perfusant avec 400 mL d’une solution de 2 %, PFA et 2,5 % GA dissous dans la solution de 1 PBS x 125 mm Hg. Remarque : Si la procédure est menée à un animal qui n’est pas un rat, les composants seulement importants de la procédure de perfusion sont l’utilisation de 1 x PBS et 2 % PFA, GA de 2,5 % dans du PBS 1 x. Les volumes de la solution et la pression de perfusion peuvent être réglés selon les espèces.</li>
</ol>2. après fixation
<ol><li>Placer le cerveau extrait chez 2 % PFA, 2,5 % GA dans 1 x solution de PBS (même solution utilisée pour perfuse l’animal précédemment). Assurez-vous que le volume de la solution est au moins 10 x le volume du cerveau. Pour les rats, placer le cerveau dans un tube conique de 50 mL avec 50 mL de solution. Conserver l’échantillon dans après fixation pendant 2 – 3 jours, en secouant légèrement à 4 ° C. Remarque : Si l’échantillon est dans un tube conique de 50 mL, le placer horizontalement dans un agitateur orbital assurera les meilleurs résultats.</li>
	<li>Après que l’échantillon a été post fixé pour longtemps assez, laver l’échantillon dans l’eau bidistillée (ddH2O), de l’eau désionisée (diH2O) ou l’eau ultrapure (voir Table des matières) de quatre fois les durées suivantes : 1, 1, 1 et 15 min. Remarque : Pour ce protocole, ddH2O, diH2O ou eau ultrapure devrait être interchangeable. Pour plus de simplicité, ddH2O servira pour désigner désormais l’eau purifiée.</li>
</ol>3. coloration
ATTENTION : Pour cette étape, procéder à toutes les préparations de solution sous un capot tout en utilisant des gants.
<ol><li>Préparer au moins 10 x le volume du cerveau de la solution de coloration. Cerveau de rat, préparer 50 mL de 2 % (p/v) le tétroxyde d’osmium (OsO4) FD2O en combinant 25 mL de solution mère de4 OsO de 4 % et de 25 mL de ddH2O. ATTENTION : tétroxyde d’Osmium est volatile et peut provoquer une cécité temporaire et des problèmes respiratoires si n’est pas manipulé convenablement. Jeter tous les matériaux qui en contact avec le tétroxyde d’osmium dans un récipient approprié risque chimique dans un conteneur secondaire.</li>
	<li>Placer le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter la solution de4 OsO. Le cerveau devrait commencer à virer au brun comme OsO4 réagit avec des lipides dans les tissus.</li>
	<li>Fermer le tube et sceller soigneusement avec paraffine film (voir Table des matières) pour s’assurer qu’il ne fuit pas durant l’incubation. Remarque : L’osmium est volatile et réagira légèrement avec le plastique du tube, le tube d’étanchéité correctement est donc très important. Les tubes peuvent être enroulées avec du papier d’aluminium pour une protection supplémentaire.</li>
	<li>Rangez le tuyau fermé à 4 ° C, secouant légèrement dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant 2 semaines. Placer le tube horizontalement pour assurer le meilleur mélange. S’assurer que l’échantillon est entièrement immergée dans la solution et en agitant. Remarque : Si l’osmium n’est pas autorisé à circuler en permanence, il ne peut pas pleinement pénétrer l’échantillon, positionnement horizontal sur le shaker est donc très important.</li>
</ol>4. incorporation
<ol><li>Après que l’échantillon a été incubé à l’OsO4 pendant 2 semaines, lavez-le avec FD2O 5 fois à température ambiante (RT) pour les durées suivantes : 1, 1, 1, 15 et 60 min pour enlever tous les indépendant OsO4 dans l’échantillon. Remarque : Les échanges multiples, y compris le dernier échange de 60 min, sont nécessaires pour permettre à tous de l’osmium dans le système circulatoire à diffuser sur.</li>
	<li>Laver l’échantillon avec les ddH2O pendant 30 min à 4 ° C. NOTE : Osmium peut continuer à diffuser de l’échantillon, mais sa quantité devrait être considérablement réduite à l’étape précédente.</li>
	<li>Déshydrater l’échantillon avec de l’éthanol pour finalement il infiltrer avec de la résine. Pour déshydrater, remplacer la ddH2O avec 10 à 20 mL de dilutions suivantes d’éthanol (de 30 min chacun à 4 ° C) : 20 % (v/v) d’éthanol et de 80 % (v/v) FD2O ; éthanol à 50 % (v/v) et 50 % (v/v) FD2O ; l’éthanol à 70 % (v/v) et 30 % (v/v) FD2O ; éthanol à 90 % (v/v) et 10 % (v/v) FD2O ; 100 % d’éthanol.</li>
	<li>Préparer des dilutions de l’acétone/résine comme suit.<ol>
<li>Préparer 100 mL de la résine pour l’enrobage (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Pour rendre la résine 33 % (v/v) - 67 % solution d’acétone, versez 15 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 30 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.</li>
		<li>Pour rendre l’acétone de résine - 50 % 50 % (v/v), verser 22,5 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 22,5 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.</li>
		<li>Pour rendre la résine 67 % (v/v) - 33 % solution d’acétone, verser 30 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 15 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.</li>
		<li>Utiliser le mL 32,5 restant de résine pour la première solution de résine 100 % ci-dessous.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Commencer le processus d’infiltration de résine en déplaçant l’échantillon dans 10-20 mL d’acétone et l’acétone/résine dilutions suivantes : acétone 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; acétone à 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; et l’acétone à 100 % pendant 30 min à température ambiante (RT). NOTE : Le reste du processus d’infiltration aura lieu à température ambiante.</li>
	<li>Immergez l’échantillon à 33 % (v/v) 67 % de résine acétone pendant 3 h à RT, puis acétone résine - 50 % 50 % (v/v) pendant 3 h à RT, acétone 33 % 67 % (v/v) de résine pendant 3 h à RT et 100 % de résine pendant 12 h à température ambiante.</li>
	<li>Faire un lot de frais 50 mL de résine en suivant les instructions sur la bouteille. Transférer l’échantillon dans le récipient dans lequel il sera guéri (e.g., les moules jetables décrits dans la Table des matières). Faire infuser l’échantillon avec une résine 100 % frais pendant 4 heures à température ambiante. Remarque : Si la résine fraîche n’est pas utilisée, la résine faite le jour précédent commencera à durcir prématurément, et l’échantillon sera difficile à manipuler.</li>
	<li>Une solution contenant l’échantillon dans une étuve à vide pendant 15 min à 45 ° C. Remarque : Cette étape permettra d’éliminer les bulles d’air piégées dans l’échantillon, mais il n’est pas essentiel et n’affectera pas la qualité des données.</li>
	<li>Enfin, guérir l’échantillon dans un four pendant 48 h à 60 ° C.</li>
</ol>5. micro-CT
<ol><li>Une fois que l’échantillon a été guérie, décoller le moule jetable et Scannez-le avec la machine de micro-CT. Remarque : Selon l’appareil utilisé, les réglages seront différents. Pour le scanner utilisé par les auteurs énumérés dans la Table des matières, les paramètres recommandés sont 130 kV, µA 135 avec un filtre de 0,1 mm en cuivre et une source de molybdène, une exposition de 1 seconde et une moyenne de 4 images par projection. Cependant, expérimentateurs doivent étalonner le scanner individuellement, car de nombreux facteurs affectera les réglages optimaux au cours d’une session particulière.</li>
	<li>Une fois le scan terminé, reconstruire l’échantillon avec les paramètres recommandés pour combinaison scanner/logiciels de l’expérimentateur sur un ordinateur avec le logiciel du scanner.</li>
	<li>Enfin, visualiser et analyser le volume numérique reconstitué à l’aide du logiciel de l’expérimentateur de choix (voir Table des matières par exemple).</li>
</ol>

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<li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+Phineas+Gage%3A+clues+about+the+brain+from+the+skull+of+a+famous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient.</a> Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).</li>
<li>Kawai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+is+required+for+learning+but+not+for+executing+a+motor+skill%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill.</a> Neuron. 86, 800-812 (2015).</li>
<li>Otchy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+off-target+effects+of+neural+circuit+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acute off-target effects of neural circuit manipulations.</a> Nature. 528, 358-363 (2015).</li>
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<li>Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+exposure+to+combination+paradigm+of+environmental+enrichment%2C+physical+exercise+and+diet+reverses+the+spatial+memory+deficits+and+restores+hippocampal+neurogenesis+in+ventral+subicular+lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).</li>
<li>Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+NBM-+lesion+on+synaptic+plasticity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats.</a> Brain Research. 1655, 122-127 (2017).</li>
<li>Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+visual+motion+representation+in+mouse+area+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex visual motion representation in mouse area V1.</a> Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).</li>
<li>Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28063155">Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).</li>
<li>Wood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeycomb+maze+provides+a+novel+test+to+study+hippocampal-dependent+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation.</a> Nature. , (2018).</li>
<li>Vermaercke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+in+rat+occipital+and+temporal+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li>
<li>Masís, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184(2018).</li>
<li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).</li>
<li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic & Histochemistry. , (1994).</li>
<li>Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy%3A+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li>
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<li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Voici les étapes critiques du protocole : tout d’abord, l’utilisation d’une combinaison de PFA et GA perfuse l’animal et ensuite fixer le cerveau a été primordiale à la réalisation de pénétration d’osmium pleinement cohérente du tissu. Bien que nous n’ai pas tester cela explicitement, une explication plausible est que la fixation de la PFA est réversible15, alors que la fixation GA n’est pas réversible16,17. Parce qu’une période d’incubati...

Les neuroscientifiques ont compté sur les lésions pendant une longue période afin de comprendre la relation entre la fonction et l’emplacement dans le cerveau. Par exemple, notre compréhension de l’hippocampe comme étant indispensable pour l’apprentissage et la mémoire et du cortex préfrontal comme étant la clé pour le contrôle des impulsions était les deux produits de lésions fortuites dans les humains1,2. L’utilisation de modèles animaux, cependant, a permis des neuroscientifiques d’exploiter la puissance des lésions en allant au-delà des serendipity, et la fonction de nombreuses zones du cerveau a été élucidée par le biais des études systématiques des relations structure-fonction à travers lésions3,4.
Pour affecter correctement fonction vers une structure, cependant, les études de lésion exigent des procédures de quantification précise, qui est une région qui a fait défaut. L’étalon-or pour quantifier les lésions actuel est de section, Mont et cerveaux d’image avec un microscope optique. Les tranches imagés sont ensuite mis en correspondance avec les sections plus proche de vous sur un atlas, et les coordonnées approximatives des lésions dans l’ensemble des sujets sont rapportées indirectement, souvent grâce à l’utilisation des images de caméra lucida ou exemple histologique tranches3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Au-delà de l’imprécision des procédures de quantification des lésions actuelles, ces techniques sont fastidieuses et sujettes à l’échec. Petits changements dans la rigidité du cerveau, netteté de la lame et la température peut conduire aux sections bâclées, déformées ou déchirées. Les sections peuvent tacher aussi inégalement et être mal photographiées à cause des bulles d’air dans le milieu de montage. Ce qui est important, à la découpe, le contexte en trois dimensions de l’emplacement de la lésion dans le cerveau est perdu, faire une reconstruction 3D précise de la lésion dans le cerveau des difficiles.
Une autre application courante pour des lésions a été de déterminer l’emplacement des simples et multiples enregistrements d’électrodes dans le cerveau. À la fin de la séance d’enregistrement final, chercheurs provoquent des petites lésions électrolytiques à l’extrémité de l’électrode et processus du cerveau histologiquement comme fait dans une expérience de lésion classique11. Cette technique souffre les mêmes inconvénients décrits ci-dessus, avec des problèmes supplémentaires étant que les lésions électrolytiques sont généralement plus grandes que les électrodes utilisées pour les rendre, mais sont généralement assez petites qu’ils sont difficiles à trouver sur le plan histologique. Lorsque plusieurs électrodes sont insérés, comme dans le cas d’un tableau de la tétrode, vérification par le biais de lésions électrolytiques est encore plus difficile. Une alternative aux lésions électrolytiques est l’utilisation d’un colorant sur l’électrode pour plus tard vérifier histologiquement12, mais cette technique souffre des mêmes inconvénients qui viennent avec l’histologie conventionnelle.
Nous décrivons ici approfondie une méthode décrite récemment13 basé sur la coloration des techniques de microscopie électronique (me) et la radiographie tomodensitométrie (micro-CT) qui quantifie les lésions et localise les électrodes dans le cerveau animal petit mieux que courant Méthodes. Micro-CT est une technique d’imagerie dans lequel les rayons x est tournés en un échantillon qui est orientable à 360° pendant qu’un scintillateur recueille les rayons x n’a ne pas déviés de l’échantillon. Il en résulte une reconstruction 3D numérique à haute résolution de l’échantillon qui peut être visualisée dans n’importe quelle orientation et quantifié précisément. De nombreux établissements universitaires ont micro-tomodensitomètres, qui sont également disponibles dans le commerce.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td>2 % (p/v/) dans 1X PBS</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (GA)</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>2,5 % (p/v) GA dans 1x PBS</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>Travail dans une hotte</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>Koptec</td><td>140, 190, 200 proof</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>EMS</td><td>10015</td><td></td></tr><tr><td>Résine Durcupan ACM</td> distillée en verre <td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td>A, B, C et D, résine pour l’enrobage</td></tr><tr><td>Moules jetables</td><td>Ted Pella</td><td>27114</td> Eau milliQ <td>suggérée</td></tr><tr><td>(eau ultrapure)</td><td>Millipore Sigma</td><td>QGARD00R1 (ou purificateur associé)</td><td>Parafilm suggéré</td></tr><tr><td>(film de paraffine)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td>Film de paraffine suggéré</td></tr><tr><td>Scanner Micro-CT</td><td>Nikon Metrology Ltd., Tring, UK</td><td>X-Tek HMS ST 225</td><td>Utilisé par les auteurs</td></tr><tr><td>Logiciel pour la visualisation et l’analyse des scans micro-CT :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Volume Graphics</td><td>VG Studio Max</td><td>Utilisé par les auteurs</td></tr><tr><td></td><td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Avizo</td><td>Utilisé par les auteurs</td></tr><tr><td></td><td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Amira</td><td>Similaire à Avizo</td></tr><tr><td></td><td>Mark Sutton & Russell Garwood</td><td>Spiers</td><td>Gratuit, http://spiers-software.org/</td></tr> <tr><td></td><td>Pixmeo Sarl</td><td>Osirix Lite Gratuit</td><td>, https://www.osirix-viewer.com/</td></tr> <tr><td></td><td>Open Source</td><td>FIJI</td><td>Gratuit, https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td></td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td>Idéal pour analyser une tranche à la fois</td></tr></tbody></table>

une méthode à base de micro-ct pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau animal petit

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lésion et électrode de vérification d’emplacement sont traditionnellement fait par l’examen histologique des tranches de cerveau tachées, une procédure longue nécessitant manuelle estimation. Nous décrivons ici une méthode simple et directe pour quantifier les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau qui est moins laborieux et donne des résultats plus détaillés. Cerveau entier est colorées au tétroxyde d’osmium, incorporé en résine et photographié avec un micro-tomodensitomètre. Les scans entraînent des volumes 3D numériques des cerveaux avec des résolutions et des épaisseurs de section virtuel dépendantes de la taille de l’échantillon (12 – 15 et 5 – 6 µm par voxel pour rat et zebra finch brains, respectivement). Les lésions superficielles et profondes peuvent être caractérisées et seul tétrodes, baies de tétrode, lésions électrolytiques, et silicium sondes peuvent également être localisées. Logiciels libres et propriétaires permet aux expérimentateurs d’examiner le volume de l’échantillon de n’importe quel avion et segment le volume manuellement ou automatiquement. Parce que cette méthode génère le volume du cerveau, des lésions et des électrodes peuvent être quantifiées à une beaucoup plus grande que les méthodes actuelles, qui aidera à normaliser les comparaisons au sein et entre les études.

Traditionnellement, les cerveaux est sectionnés et colorés pour quantifier les lésions et de localiser les électrodes, mais cette méthode est sujette aux erreurs, il y a beaucoup de travail et nécessite généralement l’estimation des résultats. En préparant toute cervelle d’imagerie micro-CT, la probabilité d’endommager les échantillons est considérablement réduite, caractéristiques d’intérêt peuvent être analysées dans le contexte de l’ensemble du cerveau, et la méthode se prête au traite...

Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.

Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des neurosciences en fournissant une méthode plus simple, moins sujette aux erreurs et plus quantitative pour vérifier les lésions et localiser les emplacements des électrodes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la vérification des lésions et des sites d’électrodes dans l’ensemble du cerveau sans avoir besoin de sectionner. Le produit final est un volume numérique 3D du cerveau et plusieurs cerveaux peuvent être traités en parallèle.Bien que cette méthode sera démontrée chez le rat, elle peut également être appliquée à d’autres organismes, tels que les souris et les pinsons zébrés. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que certaines étapes nécessitent des soins particuliers pour assurer les meilleurs résultats. Pour commencer, placez un cerveau extrait dans une solution de profusion dans un tube conique de 50 millilitres.Conserver l’échantillon pendant deux à trois jours avec des secousses douces à quatre degrés Celsius. Assurez-vous que l’osmium est dilué dans l’eau et non dans un tampon. C’est parce que l’eau agira comme un détergent doux, permettant à l’osmium de pénétrer profondément dans le tissu.Préparer 50 millilitres de 2% de tétoxyde d’osmium dans de l’eau double-distillée. Placez ensuite le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et ajoutez la solution de tétoxyde d’osmium. Fermez le tube et scellez-le avec du film de paraffine pour éviter les fuites.Conserver le tube scellé à quatre degrés Celsius avec une légère secousse pendant deux semaines. Assurez-vous que le tube est placé horizontalement. Le cerveau est très épais et un long chemin à parcourir par diffusion.Placer le tube horizontalement permettra à l’osmium de voyager plus profondément dans le tissu. Après l’incubation de l’échantillon pendant deux semaines, lavez-le avec de l’eau doublement distillée cinq fois pour retirer tout le tétoxyde d’osmium non lié de l’échantillon. Ensuite, lavez l’échantillon avec de l’eau doublement distillée pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Remplacer l’eau doublement distillée par quatre dilutions d’éthanol pour déshydrater l’échantillon. Pour commencer le processus d’infiltration de résine, déplacez l’échantillon à travers trois dilutions de résine d’acétone et trois dilutions de résine d’acétone, puis immerger l’échantillon dans 100% résine à température ambiante pour poursuivre le processus d’infiltration. Après cela, transférer l’échantillon dans un moule jetable.Infuser l’échantillon de résine fraîche à 100 % pendant quatre heures à température ambiante. Dégazer l’échantillon dans un four à vide pendant 15 minutes à 45 degrés Celsius. Puis guérir l’échantillon dans un four pendant 48 heures à 60 degrés Celsius.Enfin, lorsque l’échantillon a fini de guérir, décoller le moule jetable et le scanner avec la machine Micro-CT. Dans les sections traditionnelles, l’orientation du cerveau doit être prédéterminée. En utilisant cette méthode micro-CT, le volume numérique du cerveau de l’échantillon peut être manipulé en trois dimensions et pratiquement tranché dans n’importe quelle direction.La microscopie électronique de balayage du cerveau préparé de rat confirment que le tissu n’a pas été sensiblement endommagé aux fins de la formation image de Micro-CT. Un cerveau de pinsons zébrés a également été préparé et scanné selon ce protocole pour tester l’utilité de cette méthode sur d’autres cerveaux de petits animaux. Cette technique peut être utilisée pour trouver des lésions de surface dans le cerveau, ainsi que des lésions profondément dans le cerveau.Cette technique peut également être appliquée à l’emplacement des tétrodes simples in situ, des lésions électrolytiques, des traces d’électrodes, des réseaux de tétrode in situ et des sondes de silicium in situ. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de permettre au cerveau d’incuber assez longtemps et avec suffisamment d’agitation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’optogénétique et l’imagerie à deux photons peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le rôle que jouent les différentes zones cérébrales dans différents comportements.Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine des neurosciences de mieux explorer les relations structure-fonction entre le cerveau et le comportement chez les rats, les souris, les oiseaux chanteurs et d’autres petits animaux. N’oubliez pas que travailler avec de l’osmium peut être extrêmement dangereux et des précautions, comme le port de gants et le travail dans une hotte sous vide doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Implantation d’un système de microélectrodes bidirectionnelles sans fil dans le cerveau d’un rat

Source : Choi, J. P. et al.  Induction et imagerie micro-TDM de malformations caverneuses cérébrales dans un modèle murin. J. Vis. exp. ( 2017)Cette vidéo montre l’utilisation de l’imagerie micro-TDM pour visualiser les lésions de malformation caverneuse cérébrale (CCM) dans le cerveau d’une souris. Il détaille les étapes de préparation des échantillons, d’imagerie et de reconstruction d’images 3D afin d’évaluer la densité et l’emplacement des lésions CCM dans le tissu cérébral.

Imagerie micro-TDM avec produit de contraste de lésions de malformation caverneuse cérébrale dans le cerveau d’une souris

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Ce protocole montre l’induction de la maladie dans un modèle murin de malformation caverneuse cérébrale et utilisations contraste amélioré micro tomographie par ordinateur pour mesurer le fardeau de la lésion. Cette méthode améliore la valeur établie de modèles de souris pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour malformation caverneuse cérébrale et autres maladies cérébro-vasculaires.

Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin

Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.

Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

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Ici, nous présentons une méthode pour l’évaluation à long terme de la performance et de la sécurité des réseaux d’électrodes sous-durales souples dans un modèle mini-porc, décrivant la méthode et les outils chirurgicaux, l’imagerie par résonance magnétique postopératoire, l’électrophysiologie du cortex auditif, les propriétés électrochimiques de l’implant et l’immunochimie post-mortem.

Implantation d’un réseau d’électrocorticographie molle sous-durale (ECoG) et enregistrement cortical à long terme chez les miniporcs

Cette étude décrit les étapes permettant d’obtenir des images à haute résolution du cerveau de souris néonatales en combinant la micro-tomodensitométrie (micro-TDM) et un agent de contraste dans des échantillons ex vivo . Nous décrivons des analyses morphométriques de base pour quantifier la taille et la forme du cerveau dans ces images.

Imagerie micro-tomodensitométrie et analyse morphométrique du cerveau néonatal de souris

Nous décrivons un protocole d’évaluation des courbes dose-réponse pour la stimulation extracrânienne en termes de mesures du champ électrique cérébral et d’un biomarqueur-flux sanguin cérébral pertinent. Étant donné que ce protocole implique la mise en place invasive d’électrodes dans le cerveau, une anesthésie générale est nécessaire, la respiration spontanée étant préférée aux respirations contrôlées.

Mise en place d’électrodes de stimulation extracrânienne et mesure du débit sanguin cérébral et des champs électriques intracrâniens chez des souris anesthésiées

Un système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique est proposé pour stimuler la stimulation magnétique transcrânienne du cerveau de la souris in vivo. En utilisant des électrodes à vis conventionnelles avec un substrat multi-électrodes flexible sur mesure, l’enregistrement multisite peut être effectué à partir du cerveau de la souris en réponse à la stimulation magnétique transcrânienne.

Système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique pour stimuler transcrânalement le cerveau de la souris in vivo

Ici, nous présentons deux protocoles d’enregistrement par micro-électrocorticographie à haute densité (μEcoG) chez le rat et la souris, y compris les méthodes chirurgicales, d’implantation et d’enregistrement. Les enregistrements μECoG sont effectués en combinaison avec l’enregistrement de polytrodes laminaires dans le cortex auditif du rat ou avec la manipulation optogénétique de l’activité neuronale dans le cortex somatosensoriel de la souris.

Études multi-échelles du traitement cortical par intégration de polytrodes laminaires et d’optogénétique avec micro-électrocorticographie chez les rongeurs

Découvrez une méthode de micro-CT pour localiser précisément les lésions et les électrodes dans le cerveau entier de petits animaux sans sectionnement. Cette technique produit un volume 3D numérique pour une analyse complète des structures cérébrales.

Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

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