Name: Méthanol Expression indépendante de Pichia Pastoris employant des Technologies de la répression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Découvrez une méthode de production de protéines recombinantes sans méthanol dans Pichia pastoris en utilisant des promoteurs réprimés par la source de carbone et un suivi en ligne des paramètres de culture.

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La thèse de doctorat de J. Fischer est cofinancée par une subvention pour la « Thèse de Industrienahe » de l’agence de financement autrichien FFG.
Nous remercions Gernot John (PreSens GmbH) pour des discussions utiles et un apport précieux pour le projet de manuscrit.

1. préparation de support
<ol><li>Préparation des milieux minime tamponnés (BMG avec le glycérol, BMD avec dextrose comme source de carbone) (1 L)<ol>
<li>Autoclave 650 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre 1 L bouchon à vis. Après refroidissement, compléter le milieu en ajoutant 100 mL d’autoclave 10 x YNB (134 g/L levure azote base w/o acides aminés), 200 mL de tampon phosphate de potassium (1 M, pH 6), 30-100 mL de 10 % p/v glucose ou de glycérol (selon la quantité désirée de biomasse généré pendant le traitement par lots), 2 mL stérile 500 x solution de biotine (10 mg/mL) et remplir jusqu'à 1 L avec stérile d’eau distillée. Remarque : Tous les ingrédients doivent être stérilisés à l’autoclave dans des flacons séparés. Biotine est détruit lorsque stérilisés à l’autoclave et doit donc être filtre stérilisé avec filtres à membrane 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mise en mémoire tampon rich média (BYPG) (1 L)<ol>
<li>Autoclave 700 mL d’eau distillée avec 1 % w/v levure extrait et 2 % w/v peptone dans une bouteille de 1 L bouchon à vis. Après refroidissement, ajouter 30-100 mL de l’autoclave séparément glycérol 10 % p/v, 200 mL de tampon phosphate de potassium (1 M, pH 6) et compléter à 1 L avec de l’eau distillée stérile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. secouez la préparation des flacons
<ol><li>Ajouter 5 mL d’eau distillée dans le 250 mL dérouté agiter les flacons, couvrez-la avec deux couches de tissu de coton et le fixer avec des élastiques. Couvrir le tissu avec un morceau de papier d’aluminium.</li>
	<li>Autoclave les fioles à 121 ° C pendant 20 min pour une stérilisation complète.</li>
	<li>Retirez l’eau résiduelle de la fiole et l’aliquote 50 mL des médias préalablement préparées dans chaque fiole.</li>
</ol>3. une nuit Culture Inoculation
<ol><li>Démarrer une culture au jour le jour (ONC) avec une seule colonie fraîche de la souche de l’expression désirée dans 5 mL de la DPJ (1 % w/v extrait de levure, peptone de 2 % p/v, glucose 2 % p/v) dans un tube à centrifuger 50 mL tout en laissant le couvercle légèrement ouvert pour permettre une aération adéquate.</li>
	<li>Laisser pousser pendant la nuit à 28 ° C, 80 % d’humidité, dans un shaker à 100-130 tr/min (diamètre de secousse de 2,5 cm).</li>
</ol>4. mesure d’installation et de la culture de la Culture principale
<ol><li>Pour mettre en place le système de suivi en ligne, suivez les instructions du fabricant pour l’étalonnage des appareils.</li>
	<li>Placer un ordinateur, où il est installé le logiciel approprié pour la surveillance à la plage pour une connexion Bluetooth avec les stations de mesure. Lancez le logiciel pour connecter les périphériques Bluetooth.<ol>
<li>Activer la connexion Bluetooth sur l’appareil de mesure de la biomasse en appuyant sur la touche argentée sur le devant.</li>
		<li>Dans le logiciel, cliquez sur périphériques , puis Trouver des dispositifs. Remarque : Les appareils doivent apparaître sous forme de liste dans la fenêtre au-dessous du seuil de la tâche. S’ils ne le font pas, il est conseillé de vérifier si les piles sont chargées et l’ordinateur est à portée de main pour une connexion Bluetooth.</li>
		<li>Glissez et déposez les périphériques détectés aux carrés sur la droite de l’écran, Bac de mesure.</li>
		<li>Cliquez sur se connecter. Remarque : Lorsque la connexion a réussi, un écran de contrôle s’affiche.</li>
		<li>Pour démarrer un essai de fonctionnement de la connexion Bluetooth, cliquez sur mesure.</li>
		<li>Mettre en place l’expérience.<ol>
<li>Cliquez sur Démarrer mesure, nom de l’expérience et activez tous les paramètres nécessaires au suivi. Remarque : Les licences sont nécessaires pour chacun des paramètres mesurés possibles.</li>
			<li>3 min la valeur intervalle . Remarque : L’intervalle détermine à quelle fréquence points de mesures sont prises, et chaque point de mesure se traduit par une valeur par la suite. Chaque minute de mesure est très précise, mais beaucoup de données est générées, ce qui le rend plus laborieux à évaluer.</li>
			<li>Définissez Les Points de mesure moyenne à 11. Remarque : Ce paramètre détermine le nombre des points de mesure sont effectivement prises toutes les 3 min. Par conséquent, la sortie est la valeur moyenne de 11 points de mesure plus de 11 s.</li>
			<li>Entrez les noms des échantillons.</li>
			<li>Ignorer l’écran suivant, que l’angle était déjà étalonné avant (étape 4.1). Remarque : Un essai de fonctionnement de la connexion Bluetooth avant d’ensemencer la culture principale est conseillé pour assurer des connexions stables et un emplacement approprié de l’ordinateur connecté. En outre, les batteries doivent être chargés.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la densité de la cellule de l’ONC (étape 3.1) dilué dans les milieux de culture (01:20) dans un spectrophotomètre à longueur d’onde de 600 nm. Ensemencer à 50 mL de milieu (recommandé concentration de source de carbone 0,3 à 1 %, possible de différents médias tel que décrit à l’étape 1.) avec l’ONC à une OD600 de 0,05 en utilisant le calcul suivant. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq1.jpg">
</li>
	<li>Placer les flacons dans les détecteurs et l’agiter à 28 ° C, 130 tr/min et 80 % d’humidité. Remarque : Il est très important de donner la culture 5 min d’agitation avant de commencer la mesure afin d’éviter des cellules de coller au fond de la fiole et ce qui donne des valeurs erronées.</li>
	<li>Cliquez sur Démarrer mesure dans le logiciel.</li>
	<li>Prélever des échantillons de 0,2 mL de mesure de densité des cellules 4 h après l’inoculation, et lorsque la source de carbone obtient diminuent (dosage indiqué au point 4.7) dans réanalysés. Diluer les échantillons convenablement dans les milieux de culture (première mesure 1:5, deuxième mesure 01:20) et de mesurer l’absorption à la longueur d’onde de 600 nm dans un spectrophotomètre. Avant d’enlever les flacons et même avant d’arrêter le shaker, toujours mettre en pause la mesure dans le logiciel. Remarque : Les détecteurs sont étalonnés pour enregistrer les paramètres dans des conditions définies de secousses et cède à des mesures de non-sens lors de l’enregistrement des cultures encore. Aussi, assurez-vous de toujours attendre 5 min d’agitation avant de commencer la mesure à nouveau. Les mesures de densité cellulaire sont essentiels parce que le détecteur est des justes valeurs pour la biomasse et de la densité cellulaire non réel. Une fonction de calibrage entre les valeurs de600 OD (valeurs x) et les valeurs obtenues par le système de mesure en ligne (valeurs de y) peuvent être réalisés en plusieurs points de mesure par spectrophotométrie. Les valeurs ne sont pas dans un linéaire mais dans une relation logarithmique selon la fonction de calibrage suivant : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq2.jpg"> y: les valeurs de600 OD obtenus par spectrophotomètre x: valeurs obtenues par le système de mesure en ligne KC : pente d: interception de l’axe La pente et l’intersection de l’axe peuvent ensuite servir pour convertir n’importe quelle valeur de la valeur correspondante de600 OD. Dans Excel, on peut tracer les valeurs de600 OD par spectrophotométrie obtenus par rapport aux valeurs du système en ligne de la même validant. L’ajout d’une courbe de tendance logarithmique et l’équation correspondante donnera la fonction de calibrage indiquée ci-dessus.</li>
	<li>Cultiver jusqu'à ce que la source de carbone est presque épuisés (env. 12-20 h). Pour cela, laissez les cultures poussent jusqu'à ce qu’on voit dans les diagrammes de logiciel que la concentration en oxygène est proche de zéro et les cellules sont en phase de croissance exponentielle. Remarque : C’est le cas pour les concentrations de source de carbone utilisée dans le présent protocole. Le validant d’épuisement de source de carbone peut être déterminée avec le système de suivi en ligne, comme il est indiqué exemplairement dans la Figure 1 dans la section résultats représentant, lorsque le niveau d’oxygène approche zéro et les cellules sont dans la croissance exponentielle phase.</li>
</ol>5. Expression de la protéine par la répression
<ol><li>Lorsque le validant décrit dans étape 4.6 est atteinte, commencer à nourrir les cultures par l’addition de quatre disques alimentation par ballon dans des conditions stériles. Remarque : Dans les conditions décrites, quatre disques d’alimentation de glycérol libérer glycérol 2 mg/h selon le fabricant.</li>
	<li>Continuer la culture pendant 60 à 90 h tout en prenant des échantillons toutes les 24 h de contrôler l’expression de la protéine par une méthode de choix (p. ex.., Bradford dosage15, SDS PAGE16 ou activité dosages) et mesures de la densité de cellules.</li>
</ol>6. culture récolte
<ol><li>Après le 60-90 h de culture, remplir les cultures en tubes de centrifugeuse 50 mL pour la récolte par centrifugation à 4 000 x g, 4 ° C pendant 10 min. Remarque : Le surnageant (pour les protéines sécrétées) ou les cellules (pour l’expression des protéines intracellulaires) peuvent être récoltées par centrifugation à 4 000 x g, 4 ° C pendant 10 min et autres analyses peuvent être faits.</li>
	<li>Exporter les données de mesure en ligne dans un fichier tableur du logiciel pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Remplir les 5-10 mL d’eau distillée à tous les flacons et autoclave pour inactiver les cellules restantes.</li>
</ol>

<ol><li>Bill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Playing+catch-up+with+escherichia+coli%3A+Using+yeast+to+increase+success+rates+in+recombinant+protein+production+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments.</a> Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1385/MB:16:1:23">Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris).</a> Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).</li>
<li>Vogl, T., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Pichia+pastoris+promoters+and+its+consequences+for+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production.</a> New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).</li>
<li>Rußmayer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+organization+of+yeast+methylotrophic+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle.</a> BMC Biology. 13 (1), 80(2015).</li>
<li>Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peroxisomal+proteins+and+organelle+proliferation+by+multiple+carbon+sources+in+the+methylotrophic+yeast%2C+Candida+boidinii%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii.</a> Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).</li>
<li>Hartner, F. S., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+methanol+utilisation+pathway+genes+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 5, 39(2006).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toolbox+of+Diverse+Promoters+Related+to+Methanol+Utilization%3A+Functionally+Verified+Parts+for+Heterologous+Pathway+Expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).</li>
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<li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li>
<li>Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+high-throughput+screening+with+Pichia+pastoris+by+limiting+yeast+cell+death+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena.</a> FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).</li>
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<li>Jeude, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fed-batch+mode+in+shake+flasks+by+slow-release+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+slow+glucose+feed+cultivation+of+Pichia+pastoris+without+repression+of+AOX1+promoter%3A+towards+high+throughput+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).</li>
</ol>

Bien que le protocole présenté est généralement applicable pour la culture et l’induction dans des conditions déréprimées, U.e. bisy déclare avoir un intérêt dans la commercialisation des nouveaux promoteurs déréprimées utilisée dans cette étude.

Cette méthode présente un protocole fiable pour expression inductible indépendant efficace de méthanol par P. pastoris comme alternative à l’expression de la protéine classique méthanol induite par PAOX112. Les promoteurs hors répressibles, comme le P-DC, le PDF ou décrites précédemment muté variantes PAOX1 17, construisent la base moléculaire de ce nouveau concept de production de protéines. Les résultats représentatifs illustrés soulignent l’utilité et la faisabilité d’expression de protéine recombinante dans P. pastoris par promoteurs hors refoulés et dépistage à petite échelle avec une surveillance en ligne simple. D’une part, le méthanol nocif et toxique qui est habituellement utilisé pour l’induction du promoteur AOX1 peut être éliminé de la culture. En revanche, la croissance et la phase de production de protéine sont découplés9 contrairement à l’expression de la protéine constitutive, par exemple., le couramment utilisés PGAP. Ceci est particulièrement utile lorsque les cellules devraient exprimer des protéines toxiques ou nocifs qui affichent un fardeau pour eux.
La possibilité de démarrer les cultures avec des concentrations de carbone différents source permet l’arrêt de combien la biomasse on aimerait gagner avant la phase de production de protéine commence. Lors du choix d’une plus faible concentration de source de carbone dans le lot, limites de transfert d’oxygène en raison de la densité des cellules trop élevé peuvent être réduites, tandis que la densité des cellules en revanche plus élevée peut également entraîner des titres plus élevés de protéine. En contrôlant le développement de la culture en termes de production de biomasse et les concentrations d’oxygène, le point de temps optimal pour l’initiation de la fed-batch peut être déterminé facilement, comme il est indiqué dans la Figure 1.
Pour le suivi en ligne de ces paramètres de culture, un système de mesure approprié doit être appliqué. La biomasse (par exemple, SFR Vario) appareil de mesure est un simple et système de mesure en ligne économique pour la surveillance de la culture en agiter flacons. Le lecteur optoélectroniques détermine la croissance cellulaire dans le ballon par l’intermédiaire de détection de lumière dispersée et visualise le signal de la sonde intégrée dans le ballon. L’optique pour la mesure de la biomasse se composent d’une LED qui émet un signal lumineux, ce qui est dispersé par les particules (cellules) dans le bouillon de culture et détecté avec une photodiode. Les capteurs optiques émettent fluorescence lorsqu’il est excité à la lumière d’une certaine longueur d’onde. Selon la quantité de molécules d’analyte présentes, ce signal de fluorescence change, qui est détecté par l’optique lecteur et convertie en valeurs de concentration. Toutefois, un étalonnage de mesure de la densité cellulaire doit être établi au préalable, étant donné que le système de mesure n'est pas mesurer les valeurs réelles de600 OD. Le taux d’absorption d’oxygène peut être calculé à partir de la pente de la courbe de l’oxygène avec le logiciel de lecteur, et la température, mais aussi les tr/min est enregistrées en continu ainsi que les autres paramètres. Pour activer le suivi avec ce système, les flacons agitateurs doivent être préalablement équipé des capteurs appropriés pour les paramètres souhaités.
Par l’ajout de quatre polymères à libération lente disques fournissant une quantité constante de glycérol pour le bouillon de culture, accumulation de biomasse est presque arrêtée et production de protéines recombinantes se poursuivie. La détermination du point d’alimentation disque addition temps n’est pas une étape cruciale dans cette expérience, mais il convient de considérer qu’un départ prématuré alimentation avant la phase exponentielle de croissance pourrait bloquer l’activation du promoteur comme l’expression commence à Epuisement de source de carbone. En outre, le total de temps en raison des limites de capacité de polymère d’alimentation peut être réduit, tandis que retarder l’aliment après que les cellules ont atteint la phase stationnaire pourrait conduire à la faim et la dégradation des déjà produits protéine. La quantité d’alimentation disques utilisés dans le présent protocole a été déterminée expérimentalement pour la libération de source de carbone optimal garder le promoteur hors refoulé tout en maintenant la production de biomasse faible (données non présentées). De cette manière, les cultures peuvent être effectuées facilement plus de 160-180 h sans aucune intervention.
Les applications principales de ce nouveau protocole sera en clone d’expression préalable, évolution de l’enzyme et la découverte, la caractérisation et l’ingénierie de nouveaux promoteurs employant un protocole de culture exempt de méthanol dans des conditions bien surveillés. En principe, le même protocole devrait être applicable pour les stratégies d’alimentation mixte méthanol et les aliments de source de carbone fermentative limitée telle qu’exposées par Panula-Perälä et al.. en 2014,18.

Amélioration du rendement et des conditions de culture fiables à grande échelle pour la production de protéines recombinantes de micro-organismes comme les bactéries ou levures est un des principaux besoins de biotechnologie1 aujourd'hui et le succès commercial de l’industrie applications. Dueto des procédures simples de culture et médias, avec des rendements élevés et des outils bien caractérisé2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) est une levure non conventionnelles largement utilisée pour la production de protéines recombinantes. Autres outils novateurs sont constamment développés pour cette espèce, comme de nouveaux vecteurs d’expression y compris les nouveaux promoteurs comme solution de rechange à la largement utilisé PAOX1, la région promotrice de l’alcool oxydase 1 gène3, 4,,5. Une 500 bp longue séquence d’ADN en amont du gène CAT1 (CTA1) a été identifié comme la région du promoteur, qui permet à une nouvelle stratégie d’expression sans méthanol et polyvalent dans P. pastoris. Le gène CAT1 est le seul gène de la catalase du P. pastoris et la protéine se trouve dans les peroxysomes. La catalase joue un rôle important dans la détoxication des espèces réactives de l’oxygène, qui se présentent, par exemple., de l’oxydation du méthanol dans la voie MUT peroxysomes ou au cours de l’oxydation de la bêta d’acides gras6,7. L’expression du gène CAT1 est réprimée dans la présence de glucose ou de glycérol dans le milieu de culture et déréprimée sur l’épuisement de ces sources de carbone8. En outre, l’expression du gène catalase peut être induite avec du méthanol et remarquablement aussi avec de l’acide oléique, étant apparemment le seul gène de la voie P. pastoris MUT qui peut être induite par l’acide oléique même d’atteindre les niveaux d’expression semblables comme avec méthanol induction9.
Le fragment de bp 500 de ce promoteur P. pastoris CAT1 , qui s’appelle PDC (parfois abrégé PCAT1-500), a déjà été testé pour la production de protéines dans les cellules expresses et sécrétées et il s’est avéré pour être un alternative intéressante aux deux classiques P. pastoris promoteurs – le fort de P constitutiveGAP et le méthanol inductible PAOX1, qui ont été développés il y a plus de 20 ans. Le PDC réussit à atteindre les 21 % (CalB) et 35 % (HRP) des activités volumétriques par rapport au PGAP dans un milieu enrichi de sucre. Induction de méthanol, le PDC n’a pas seulement répondu plus vite que PAOX1, mais il pourrait aussi clairement surpasser par un titre final supérieur de 2,8 pli de CalB9.
Outre la PDC, un promoteur orthologues (P,DF) avait été identifié en présentant un profil similaire de règlement. Toutefois, il est nettement plus forte que la PDC moins déréprimée comme dans induite par le méthanol des conditions (manuscrit en préparation)3.
Dans le cas où la forte constitutive de PGAP n’a pas à cause des protéines physiologiquement cytotoxiques ou problématiques10,11, la PDC et le PDF représentent une alternative idéale. Dans les expériences de petite échelle, l’expression entraînée par ces promoteurs commence après l’épuisement de la source de carbone initial (e.g., glucose ou glycérol), sans surcharger les cellules avec la surexpression de ce qui facilite la production de biomasse la protéine recombinante dès le début. Tandis que deux de ces promoteurs sont toujours inductibles par le méthanol, l’activation par dérépression rend l’utilisation additionnelle de la phase préinduction par rapport aux expressions employant PAOX1. En outre, la PDC et PDF peuvent être utilisé pour la production de protéines exemptes de méthanol, qui est un objectif souhaitable pour grands procédés industriels12.
Pour le développement de souches de production applicables et constructions de l’expression, plusieurs étapes dans le développement doivent être passés afin de rétrécir vers le bas par un grand nombre de transformants à la personne recherchée pour l’intensification. Projections sont habituellement effectuées à haut débit en plaques multipuits (échelle micro : inférieure à 0,5 mL) afin de capturer une gamme de clones aussi grandes que possible. Nouvelle présélection subséquente et la re-re-screening sont la prochaine étape, suivie de shake fiole (à petite échelle : 50 à 250 mL) ou (micro-) bioréacteur projections12. Toutefois, il est souhaitable d’avoir une méthode qui ressemble le plus entre les différentes échelles de centaines de microlitres en puits profonds plaques jusqu'à plusieurs millilitres en flacons agitateurs jusqu'à plus tard intensification de la production de méthanol libres bien contrôlé bioréacteurs. Bien que les flacons agitateurs peuvent fournir des volumes similaires déjà comme petits bioréacteurs, il y a plusieurs limites, qui sont très pertinents pour la production de protéines à grande échelle tels que l’alimentation constante, d’aération et de surveillance en ligne13 de la croissance et alimentation en oxygène. Optique surveillance employant adapté flacons agitateurs et secouant offrent une alternative rentable pour un matériel plus sophistiqué pour la culture parallèle tout en fournissant toujours constante en ligne informations sur les paramètres de culture principales telles que la biomasse et la concentration d’oxygène dissous. Libération lente de la source de carbone par les transporteurs de polymère peut être appliquée pour garantir un flux constant et contrôlé sans s’appuyer sur des solutions techniques complexes et dispositifs, simulant des conditions plus proches de bioréacteurs que précédemment appliqué pleinement simple appauvrissement de la couche de carbone source9,10, où l’énergie pour l’expression de la protéine en cours devient limitant.
La méthode suivante décrit un petit à l’expression de protéine exempt de méthanol contrôlables de moyenne échelle système dans P. pastoris basé sur les nouveaux promoteurs PDC et PDF. Induction par dérépression comporte deux phases. Une première courte phase d’accumulation de la biomasse sans la production de la protéine d’intérêt, à l’aide d’une source de carbone qui réprime les promoteurs et une deuxième phase de la production de protéines cibles, où une source de carbone est fournie en concentration faible mais constante maintenir le promoteur déréprimé. Suivi en ligne des paramètres de culture plus critiques est appliquée pendant la période entière de la culture. L’objectif était de fournir un méthanol libre, système de culture fiable et évolutive pour P. pastoris.

<table><tbody><tr><td>Extrait de levure Bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Fiole à chicanes 250 mL</td><td>DWK Life Science</td><td>212833655</td><td></td></tr><tr><td>BBL Phytone Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>298147</td><td></td></tr><tr><td>Biophotomètre</td><td>Eppendorf AG</td><td>5500-200-10</td><td></td></tr><tr><td>Certoclav-EL</td><td>CertoClav GmbH</td><td>9.842 014</td><td></td></tr><tr><td>Difco Base d’azote de levure avec o acides aminés</td><td>BD Biosciences</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Disques d’alimentation glycérol</td><td>Adolf Kuhner AG</td><td>315060</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-monohydraté</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6887</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol &ge ; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6875</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard&nbsp ;</td><td>Infors AG</td><td>444-4226</td><td></td></tr><tr><td>SFR Vario v2</td><td>PreSens GmbH</td><td>200001689</td><td></td></tr></tbody></table>

méthanol expression indépendante de pichia pastoris employant des technologies de la répression

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Le méthanol est une source de carbone bien établi et l’inducteur pour la production de protéines efficace utilisant Pichia pastoris (P. pastoris) comme un hôte à l’échelle micro, laboratoire et industriel. Toutefois, en raison de sa toxicité et inflammabilité, il y a un désir d’éviter le méthanol tout en conservant la haute productivité de P. pastoris. Cultures de bioréacteur à petite échelle (0,5 à 5 volume de travail L) sont couramment utilisés pour évaluer une souche et ses caractéristiques de production de protéines puisque microscale culture en plaques puits profond est difficilement maîtrisable ou s’appuie sur des équipements coûteux. En outre, les protocoles traditionnels pour la culture et l’induction de P. pastoris ont été établis pour l’induction de méthanol ou de l’expression constitutive et jusqu’ici, qu'aucun protocole fiable ont été décrits à l’expression de P. pastoris écran souches avec des promoteurs derepressible dans les cultures parallèles (contrôlés et surveillés). Pour simplifier ces cultures initiales pour caractériser et comparer les nouvelles souches de production de protéines, nous avons établi un système de culture secousse simple fiole pour la libre expression de méthanol qui simule les conditions de bioréacteur, y compris un glycérol lent constamment nourrir et suivi en ligne, ainsi se rapprocher des conditions réelles dans des bioréacteurs par rapport aux cultures de lot surtout appliquée à petite échelle. Pour conduire les expression de protéine recombinante dans P. pastoris, la source de carbone réprimée promoteurs PDC et PDF ont été appliqués. Polymère disques avec la source de carbone incorporé, libérant une quantité constante de glycérol, assuré un débit d’alimentation fournissant l’énergie nécessaire pour maintenir les promoteurs actifs tout en maintenant la production de biomasse en bas.

Comme décrit dans la section du protocole, le logiciel enregistre les paramètres de culture important sur la culture entière. La figure 1 illustre la visualisation du développement de la biomasse et la concentration en oxygène au cours d’une culture a commencé avec 0,5 % (Figure 1 a) ou source de carbone de 0,3 % (Figure 1 b) dans le lot, suivi de l’addition de glycérol que se nourrissent des disques. Le système de suivi en ligne est particulièrement utile pour les cultures hors réprimées comme le validant d’épuisement de source de carbone après que le lot peut être déterminé exactement. Comme il peut être vu dans la Figure 1, la concentration d’oxygène dans le milieu est diminué rapidement et proche de zéro, en particulier pour 0,5 % de glycérol dans le lot (Figure 1 a) alors que la biomasse augmente exponentiellement à ce stade. Ici, les cellules sont en phase de croissance exponentielle, et afin de faire un usage optimal de la libération de source de carbone, peu de temps avant que la culture n’atteigne la phase stationnaire, les disques alimentation devraient être ajoutés comme cela est décrit dans le protocole. L’ajout des disques alimentation avant que la concentration d’oxygène n’atteigne zéro est important pour l’expression de la protéine hors refoulé empêcher les cellules d’une limitation de l’oxygène. Des concentrations plus faibles de glycérol réduisent l’effet des limitations d’oxygène à court terme car il peut être vu dans la Figure 1 b et sont donc recommandées pour l’expression de la protéine hors refoulé.
Par la suite, les résultats de deux cultures différentes expériences – employant le protocole décrit et illustré à la Figure 1 le système de surveillance – sont décrites. Dans la première expérience, une souche P. pastoris produisant la glucose-oxydase d' Aspergillus niger (a. niger) sous le contrôle du PDC et dans le second, une souche P. pastoris produisant l’hormone de croissance humaine sous contrôle du PDF est indiqué.
Dans cette expérience, la production de glucose oxydase sous le contrôle de PDC a été étudiée. Par conséquent, la culture différentes stratégies ont été comparées : glycérol pulsé, glycérol constant de l’alimentation par l’ajout de disques alimentation et culture sans tout se nourrissent ou "pulsé". La culture a été faite en milieu minimal dans la mémoire tampon de 50 mL avec 0,5 % de glucose comme seule source de carbone en flacons de 250 mL agitateurs (tableau 1).
Sur culture de 160 h, les plus fortes concentrations de biomasse ont été obtenues, quand une stratégie d’alimentation à l’aide d’un lot de glucose pour la production de biomasse (38 h) et de glycérol pulsé (glycérol de w/v de 0,25 % après 38 h, 61 h et culture h 86) a été employé (0,21 g/L au total sécrétoire protéine, 8,4 U/mL). Bien qu’une facteur 2 la réduction de la concentration de la biomasse et de la quantité totale de protéine sécrétée ont été obtenus, lorsque les disques d’alimentation ont été ajoutés après lot de glucose h 38, l’activité volumétrique était même 1 U/mL plus élevé par rapport à la culture à l’aide de glycérol pulsé . Cela signifie qu’une quantité importante de protéine sécrétée ne contribue pas à l’activité volumétrique dans le surnageant et peut être sécrétée sous une forme inactive. Par conséquent, des concentrations plus élevées de glycérol à partir d’impulsions de glycérol a apparemment favorisent la formation de la biomasse plutôt que la production de protéines cibles et libération de glycérol faible constante a conduit à une plus grande productivité spécifique de plus de deux fois.
Une autre expérience qui emploient la méthode d’expression hors refoulés a été faite en exprimant l’hormone de croissance humaine (hGH) sous contrôle de PDF. La construction a été intégrée de façon stable dans le génome de la souche BSYBG11 P. pastoris . Ici, 50 mL de BYPG, mis en mémoire tampon un milieu enrichi, dans 250 mL flacons agitateurs dérouté a été utilisé avec 0,3 % (p/v) de glycérol comme source de carbone dans le lot. Après épuisement de glycérol, l’expression de la protéine avec glycérol constant d’alimentation a été assurée par l’ajout de 4 disques d’alimentation par flacon et comparativement à aucune glycérol d’alimentation (Figure 2).
La figure 2 montre la comparaison entre l’expression de hGH et le développement de la biomasse de la même souche cultivée avec ou sans constante glycérol se nourrissent. Sandwich de dosage ELISA a été utilisée avec l’anticorps secondaire fusionné au HRP et détection a été réalisée avec 3,3′, 5, 5′-tétraméthylbenzidine (TMB) comme substrat. Spécialement pour cette protéine, cela semblait être le cas, que sans les nourrir, les cellules commencent à dégrader la protéine produite après environ 30 h (carrés bleus clair), alors qu’en se nourrissant, cette dégradation pourrait être empêché (triangles bleus foncés) et même la teneur en protéines par la biomasse a augmenté encore après 150 h de culture. Comme déjà souligné pour Hansenula polymorpha14, ce résultat montre comment passer du lot, comme il est généralement utilisé à l’échelle de fiole de shake, fed-batch mode permet d’optimiser les cultures P. pastoris .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig1.jpg"> Figure 1 : visualisation en ligne enregistrées paramètres au cours de deux cultures avec des concentrations différentes de glycérol dans le lot. Les cultures ont débuté avec 0,5 % p/v (A) et du glycérol p/v (B) 0,3 % dans le lot, suivi de la phase de la répression où les cellules ont été nourris en appliquant 4 disques alimentation par flacon (débit de 0,5 mg/h de sortie/disque selon le fabricant). Les lignes tiretées indiquent la concentration d’oxygène dans le milieu, alors que les lignes continues montrent la densité cellulaire (OD600). Barres d’erreur indiquent que l’écart de six réplicats (2 biologique, trois techniques). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig2.jpg"> Figure 2 : comparaison de l’hormone de croissance humaine (hGH) expression en mode batch et nourris-lot. contenu de l’hGH est indiquée par les valeurs d’absorption à 405 nm par une technique ELISA où l’anticorps de 2nd est une fusion de HRP et TMB a été utilisé comme substrat pour la détection. Le résultat de deux cultures différentes est indiqué : lumière bleu affichage ligne et carrés, la densité cellulaire et la concentration de hGH normalisée par la densité des cellules d’une culture sans n’importe quelle alimentation après le lot, par rapport à une culture, où le glycérol nourrissent des disques ont été appliquées (lignes bleus foncés et triangles). Barres d’erreur indiquent que l’écart de six réplicats (2 biologique, trois techniques). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">PDC- GOX au moment de la culture de 160 h</td>
			<td colspan="2">OD600</td>
			<td colspan="2">activité de vol. [U/mL]</td>
			<td colspan="2">quantité totale de protéine sécrétée [mg/mL]</td>
			<td>activité volumétrique par densité cellulaire</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyenne</td>
			<td>SD</td>
			<td>Moyenne</td>
			<td>SD</td>
			<td>Moyenne</td>
			<td>SD</td>
			<td>Moyenne</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lot de BMD1 % + glycérol pulsé</td>
			<td>74,6</td>
			<td>2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0,21</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lot de BMD1 % + glycérol constant d’alimentation</td>
			<td>32,5</td>
			<td>0,3</td>
			<td>9.4</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lot de BMD1 %</td>
			<td>18,8</td>
			<td>0,6</td>
			<td>3.7</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : résultats de méthanol indépendant GOX expression sous le contrôle du promoteur refoulé hors PDC .

Cette méthode pour la première fois décrit les procédures expérimentales fiables pour la production de protéines recombinantes exempt de méthanol inductible efficace dans Pichia pastoris (Komagataella phaffii), qui emploient les promoteurs de source réglementé du carbone P DCet PDF dans des expériences à petite échelle tandis que la culture des paramètres peuvent être surveillés en ligne, et un flux constant de glycérol est appliqué.

Méthanol Expression indépendante de Pichia Pastoris employant des Technologies de la répression

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Cette méthode peut aider à la présélection des clones chromosomiques par pichia pastoris souches exprimant des protéines recombinantes dans des conditions dépressées par une simple secousse flacon cultures avant l’échelle. Le principal avantage de cette technique est que l’expression des protéines libres de méthanol de haut niveau peut être réalisée à l’aide de Pichia pastoris, qui est soutenu par la surveillance en ligne exacte des paramètres de culture importants. En général, les personnes nouvelles à cette méthode peuvent avoir du mal parce que le point de temps pour démarrer l’alimentation de culture du verre doit être adapté aux caractéristiques de croissance de la souche de production spécifique.Avant de mettre en place la culture principale, ensemencer une seule colonie fraîche de la souche d’expression d’intérêt dans 5 ml de pepto de levure et de bouillon dextrose dans un tube conique de 50 ml. Laissez le couvercle légèrement ouvert pour permettre une bonne aération. Que, placer la culture dans un shaker à 28 degrés Celsius, 80% d’humidité et 100 à 130 RPM pendant la nuit.Le lendemain matin commencer le logiciel pour connecter les appareils via Bluetooth. Ensuite, appuyez sur le bouton argent sur le devant de l’appareil de mesure de la biomasse pour activer la connexion Bluetooth à l’appareil et cliquez sur trouver des appareils dans le logiciel de surveillance informatique. Faites glisser et déposer les périphériques trouvés sur les carrés du plateau de mesure et cliquez sur connectez-vous.Lorsqu’une connexion réussie est effectuée, un écran de contrôle s’affiche. Pour configurer une expérience, cliquez sur démarrer la mesure. Nommez l’expérience et vérifiez si tous les paramètres requis pour la surveillance sont activés.Réglez l’intervalle à trois minutes et la moyenne des points de mesure à 11. Entrez les noms des échantillons et sautez l’étalonnage d’angle. Mesurer la densité cellulaire de la culture nocturne diluée à un rapport d’un à vingt dans le milieu de culture dans un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.Inoculer 50 ml de milieu avec la culture du jour au lendemain à un OD 600 de 05. Que, placer les flacons dans les détecteurs à 28 degrés Celsius, 130 RPM et 80% d’humidité pendant cinq minutes. Cliquez sur la mesure de démarrage dans le logiciel.Quatre heures après l’inoculation, utilisez un échantillon de 2 ml pour mesurer la densité cellulaire comme nous venons de le démontrer. Lorsque la concentration d’oxygène approche de zéro et que les cellules sont en phase de croissance exponentielle, ajoutez quatre disques d’alimentation glycérol à chaque flacon dans des conditions stériles. Que, retourner les flacons à l’incubateur secouant pour un supplément de 60 à 90 heures.Prélevez des échantillons toutes les 24 heures pour surveiller la densité cellulaire et l’expression des protéines par l’analyse de choix. À la fin de la culture, transférer les cultures en tubes coniques de 50 ml pour centrifugation. Exportez les données de mesure en ligne comme un fichier de feuille de calcul à partir du logiciel pour une analyse plus approfondie.Dans cette culture représentative, la concentration de glycérol de départ était de 5%Bien que les disques d’alimentation aient été ajoutés lorsque la biomasse augmentait de façon exponentielle, l’oxygène a diminué à presque zéro. Des concentrations plus faibles de glycérol ont réduit l’effet des limitations à court terme d’oxygène et sont donc recommandées pour l’expression dépressée de protéine. Dans cette expérience représentative dans laquelle l’hormone de croissance humaine a été exprimée sous le contrôle d’une source de carbone réprimée promoteur sur l’épuisement du glycérol l’expression protéique par la répression a été assurée par l’ajout de quatre disques d’alimentation par flacon.Comme prévu, l’expression de l’hormone de croissance humaine et le développement de la biomasse ont augmenté au fil du temps en présence des disques d’alimentation glycérol, tandis que l’expression des protéines a diminué au fil du temps et la biomasse est restée constante en l’absence du supplément de glycérol. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’observer attentivement les paramètres de culture pour déterminer une heure de début d’expression optimale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse des taches occidentales de détermination de la concentration protéique ou des analyses d’activité peuvent être effectuées pour l’évaluation du rendement protéique ainsi que des expériences bioréacteurs à petite échelle pour répondre à d’autres questions sur la performance de la souche individuelle à plus grande échelle.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’expression des protéines recombinantes libres de méthanol pour explorer une alternative prometteuse au promoteur AOX1 dépendant du méthanol couramment utilisé sur Pichia pastoris.

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