Name: Récupération de la biocytine et Reconstructions 3D des interneurones CA2 hippocampe rempli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Découvrez la récupération de la biocytine et les reconstructions 3D d'interneurones CA2 hippocampiques après enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode optimise la préservation de l'ultrastructure neuronale pour des analyses anatomiques précises.

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Cette recherche a reçu un financement de Novartis Pharma (Bâle) et le Medical Research Council, adjugé à Prof Alex Thomson, Biotechnology and de Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la société de physiologie, l’Union européenne Horizon 2020 Programme-cadre pour la recherche et l’Innovation au titre de la subvention spécifique contrat n° 720270 (Human Brain Project SGA1) et au titre de la subvention spécifique contrat n° 785907 (Human Brain Project SGA2). Nous sommes extrêmement reconnaissants à Prof Alex Thomson pour la mise en place du protocole dans d’autres régions corticales, d’obtenir des fonds et pour son soutien continu pour ce projet. Contributions de lab-membres, qui a contribué à l’optimisation du protocole de récupération et reconstruit CA2 neurones sont tient à reconnaître : J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
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<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des enregistrements électrophysiologiques in vitro (Figure 1 Ac,d et Bc, d) combiné avec histochimiques et immunohistochemical procédures permettent la morphologie détaillée, la teneur en calcium binding protein et identité des interneurones corticaux adultes enregistrés pour être révélé. Dans la région CA2, cette technique a permis l’étude des circuits locaux pour la première fois et a révélé des sous-classes des interneurones qui n’avaient pas été précédemment décrits dans CA1 ou CA3 : cellules de panier large dendritiques et axonales arbor (Figure 1 b), les cellules bistratified et interneurones SP-SR.
Le protocole décrit ici a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Étapes critiques comprend l’utilisation de la technique de fixation double pour renforcer le contraste pour la microscopie photonique26 et l’addition de solution de glutaraldéhyde et d’acide picrique à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver les neurones l’ultrastructure27. Doux gel-dégel perméabilisation donne meilleure préservation de la structure fine, tandis qu’osmication et résine enrobage réduisent rétrécissement plan z28. En outre, la visualisation des mêmes structures fines (fine des axones avec petits boutons par exemple) est améliorée en incubant les sections avec H2O2 et de NaBH4 afin de réduire la coloration de fond. Contraste peut également être augmentée avec l’ajout de NiCl2 à la réaction de HRP.
La procédure histologique détaillée ici donne d’excellents résultats en termes de fiabilité et de reproductibilité. Toutefois, la durée des enregistrements électrophysiologiques déterminera la qualité de la biocytine/fluorescence coloration, avec des enregistrements plus courts habituellement associés aux pauvres coloration axonale. Le choix de l’enregistrement des protocoles (enregistrements intracellulaires utilisant des électrodes pointus vs cellule entière patch serrage) peut-être influencer également la biocytine rétention et la préservation de l’anatomie fine.
Alors que les difficultés rencontrées en préservant la structure fine pendant traitement histologique décrits ici et le temps pris pour reconstruire au grossissement X 100 (1-4 semaines selon la complexité de l’axone) sont appréciés, cette méthode donne une représentation précise des diamètres dendritiques et axonales. L’utilisation de moins exigeants des protocoles pour révéler la biocytine-étiquetage est compréhensible, ceux-ci empêchent cependant souvent visualisation claire des fines branches axonales. Détergents, afin de faciliter l’accès de l’avidine-HRP pour révéler la biocytine et anticorps, sont souvent nécessaires en épaisseur importante, mais peuvent perturber la structure fine. Neuroscientifiques recherche constamment des méthodes semi-automatiques de reconstruction, mais, pour aujourd'hui et pour les axones en particulier, la biocytine-HRP avec reconstruction manuelle demeure l' étalon-or31.
Très détaillées des reconstructions neuronales, notamment des dessins précis de boutons axonales et nœuds, la présence ou l’absence de myéline et plus généralement le dessin d’arbor axonale complet, avec la représentation d’axone-diamètre exact change le long de ses longueur, fournir des informations pour identifier avec précision d’un type distinct d’interneurone complémentaires. Bien que nombreux interneurones peuvent ne pas correspondre exactement à une classe spécifique, la technique décrite ci-dessus fournit des données corrélées sur propriétés électrophysiologiques neuronales, la plasticité à court terme associées à un type de connexion spécifique et détaillée reconstructions neuronales, permettant ainsi le schéma de câblage, dans la région CA2, par exemple, d’étudier en détail.
Structure fine et détaillée est souvent simplifiée dans des modèles de calcul. Bien que compréhensible, cela se traduit par la perte de l’information qui pourrait s’avérer cruciale dans l’avenir. Analyse des reconstructions 3D détaillées avec données synaptiques en parallèle permettra l’ajout d’autres critères de classification interneuronales. Données peuvent être déposées dans les dépôts publics et utilisées par les modélisateurs pour découvrir le résultat de changements sporadiques dans le diamètre de l’axone et la myélinisation sur la propagation des potentiels d’action par le calcul.

Le cortex et l’hippocampe sont des structures d’une telle complexité que la classification des neurones sous-types1,2,3,4, cartes des inter-connexions5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 et comment ce circuit prend en charge les fonctions cognitives12,13,14,,15 sont encore à l’étude intense et l’objet de poursuite du débat. Par exemple, pour comprendre les détails et la complexité des circuits et de coordonner les données obtenues à partir de nombreuses études différentes, il est extrêmement utile d’être capable de définir et de décrire les composants, mais il reste matière à débat comment beaucoup d’autres classes de neurones existent, ou même s’il est possible de définir tous les neurones comme appartenant à une classe spécifique. Outils informatiques qui peuvent construire et tester des circuits avec des degrés de complexité sont développés16,17,18, mais centrale de ces efforts est la nécessité pour des études détaillées des types de cellules et des propriétés des connexions entre eux. Une grande quantité d’informations sur les circuits locaux du néocortex de rats adultes ont déjà été collectée en utilisant le protocole décrit ici10,19,20,21, 22. bien que le « schéma de câblage » est loin d’être achevée, certains clairement motifs ou règles sont apparues. En outre, bien que certains détails varient, ces règles sont communes aux deux espèces de mammifères (rat et chat) et dans plusieurs régions néocorticales, permettant le développement de modules de base qui sont susceptibles de s’appliquer également au néocortex humain. La technique décrite ici permet d’étendre nos connaissances sur le plan fonctionnel des circuits corticaux en identifiant les neurones présynaptiques et postsynaptiques impliqués dans les connexions dans les régions qui n'ont pas été étudiées en détail avant, à l’aide d’un protocole qui permet la préservation des tissus excellent et remarquable reprise de coloration dans les tissus du cerveau adulte. Données sur les circuits locaux Ca2 et propriétés neuronales dans ce sous-domaine ont été recueillies grâce à cette méthode en combinant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires (enregistrements appariés avec des microélectrodes pointus) avec la biocytine remplissage, immunofluorescence, procédures histologiques et reconstitutions neuronales très détaillées, ce qui permet une comparaison directe avec les voisins CA régions23,24,25.
La technique décrite dans cet article a été mis au point au cours des années pour obtenir l’anatomie détaillée neuronal permettant le classement correct des cellules et de haute qualité et des reconstructions précises des deux leurs arbres dendritiques et axonales, données qui peuvent être en corrélation avec données électrophysiologiques des enregistrements appariés à l’aide d’électrodes pointus. Le protocole histologique a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Par exemple, le principe de la technique de double fixation par tout d’abord en plongeant dans une solution de fixation et deuxièmement après fixation au tétroxyde d’osmium donne un bon contraste pour la microscopie photonique,26. Une petite quantité de solution d’acide picrique et de glutaraldéhyde sont ajoutés à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver l’ultrastructure des cellules comme suggéré dans une précédente étude27. La perméabilisation des tranches de cerveau en utilisant la méthode de gel-dégel, combinée à la cryo-protection avec saccharose, plutôt qu’un détergent classique, fournit également une préservation optimale des tissus pour une analyse morphologique détaillée des cellules enregistrées. En outre, la visualisation en particulier de très beaux structures est améliorée en réduisant à la coloration de fond, avec les incubations avec peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le borohydrure de sodium (NaBH4). Ajout de chlorure de nickel (NiCl2) à la peroxydase de raifort (HRP) réaction pour obtenir un produit de réaction du pigment noir augmente également le contraste.
Le protocole suivant décrit les procédures utilisées pour s’assurer la préservation des tissus excellent et très détaillées reconstructions 3D neuronales après des enregistrements intracellulaires in vitro. La description de la préparation de la tranche, enregistrements intracellulaires de paires à l’aide de tranchant électrodes et les procédures suivantes histologiques utilisés dans notre laboratoire ont été rapportées antérieurement28. Bien que le protocole s’applique aux cellules remplis dans les cellules de la biocytine en tranches épaisses de 450 à 500 μm, le même protocole peut être utilisé après les enregistrements de cellules entières. Cependant, l’utilisation de plus minces tranches entraînera des reconstructions moins complètes des cellules.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-acide avidine-7-amino-4-méthylcoumarine-3-acétique (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL</td><td>Laboratoires Vecteurs</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine&nbsp ; &ge ; 98 % (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 diaminobenzidine (DAB) comprimé, Pour préparer 5 mL</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan résine époxy A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan résine époxy B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan résine époxy C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan résine époxy D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, puriss. p.a., absolu, &ge ; 99,8 %</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde, grade I, 25 % dans H2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol, &ge ; 99 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine de chèvre anti-souris (FITC)- 14,3 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Anti-lapin de chèvre Texas Red (TR)- 3,3 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène, solution à 30 %</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion, viscosité 1,250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de nickel (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium, pour microscopie électronique, 4 % dans H2O&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, qualité réactif, cristallin&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Acide picrique, humidifié avec de l’eau, &ge ; 98 %</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène (C3H6O), 99 %</td><td>Alfa Aesar&nbsp ;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydroborate de sodium</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Trizma, &ge ; 99.0 %</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma, &ge ; 99,9 %</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium de montage, , indice de réfraction 1,45</td><td>Laboratoires Vecteurs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit HRP</td><td>Laboratoires Vecteurs</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Matériel utilisé&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Planchettes en aluminium bombées&nbsp ;</td><td>GA-MA & ASSOCIÉS, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica DMR&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp ; source lumineuse à fluorescence&nbsp ;</td><td>Excelitas Technologies&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo microscope numérique Leica DFC450</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylo de dessin technique Rapidograph 0.18mm&nbsp ;</td>Centre <td></td><td></td><td>graphique de Londres</td></tr><tr><td>Pointe de rapidographe 0,18 mm</td><td>Centre</td><td></td><td></td>graphique de Londres</tr><tr><td>Stylo de dessin technique Rapidographe 0,25 mm</td>Centre <td></td><td></td><td>graphique de Londres</td></tr><tr><td>Pointe de rapidographe de 0,25 mm</td><td>Centre</td><td></td><td></td>graphique de Londres</tr><tr><td>Système Neurolucida comprenant une station de travail PC, une scène, une caméra et un joystic pour le contrôle de la scène XYZ</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida version 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de montage vidéo&nbsp ;</td><td>Flacons en verre Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 mL</td><td>Fisher scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

récupération de la biocytine et reconstructions 3d des interneurones ca2 hippocampe rempli

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Comment l’activité réseau cortical traite information est d’importance pour un grand nombre de questions scientifiques fondamentales et cliniques. Le protocole décrit ici identifie les éléments de base de ce circuit. Les études approfondies des régions corticales fournira finalement autres scientifiques avec les composants du circuit nécessaires pour comprendre comment le cerveau acquiert, traite et stocke les informations et ce qui ne va pas dans la maladie, tandis que l’électrophysiologiques et les données morphologiques sont largement utilisées par les chercheurs en neurosciences computationnelles dans la construction de réseaux de modèle qui explorent le traitement de l’information. Le protocole décrit ici décrit comment les cellules remplies de la biocytine recensés dans la région CA2 de l’hippocampe sont récupérés et reconstruits ensuite en 3D. En outre, le protocole décrit la démonstration de calcium liaison protéique ou peptidique contenu dans des interneurones enregistrés.

Neurones dans l’hippocampe CA2 étaient remplis de la biocytine suite à des enregistrements électrophysiologiques (Figures 1Ac, Ad et 1Bc, Bd). Les tranches ont été fixées pendant la nuit après les enregistrements et la neurochimie et caractérisation morphologique des neurones ont été révélés suivant le protocole décrit ici.
La protéine calcium ou la teneur en protéines des interneurones remplis a été déterminée en incubant les tranches tout d’abord avec des anticorps primaires, puis avec des anticorps secondaires fluorescent étiquetés. Les caractéristiques de mise à feu des interneurones durant les enregistrements vont dicter le choix des anticorps primaires utilisés. L’avidine-AMCA a été utilisé pour visualiser les interneurones remplis de la biocytine et anti-souris fluorescéine isothiocyanate (FITC) et anti-lapin de chèvre Texas Red (TR) ont été utilisées pour caractériser la neurochimie interneuronales (Figure 1).
Après la visualisation de la fluorescence, un protocole HRP fut utilisé pour révéler la biocytine (Figure 1Ab). La fine anatomie détaillée des interneurones CA2 a été ensuite dessiné en 3D à l’aide d’un logiciel de reconstruction de neurone (Figure 2 et Figure 3 a). Une vidéo d’une reconstruction 3D d’une cellule de panier enregistré et renseigné CA2 apparaît dans la vidéo. Les reconstructions neuronales étaient considérées comme complet si les deux axes dendritiques et axonales ont été confinés dans la profondeur de la tranche de 450-500 μm. Arbor axonale mauvaise coloration a été évaluée par la présence de branches tronquées avec des terminaisons ouverts en haut ou en bas de la tranche ou par une coloration qui se limitait au segment initial de l’axone et des branches très proximales. La figure 4 représente les exemples d’une bonne et une mauvaise visualisation de la biocytine suivante coloration de HRP.
Analyse morphométrique des reconstructions 3D (Figure 3) peut être effectuée afin de démontrer la complexité de la branche, superficie soma et la surface et le volume de l’arbres dendritiques et axonales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Figure 1 : Reconstructions neuronales des deux types de cellules de panier enregistrement et remplis dans la région de l’hippocampe CA2 et corrélation des données électrophysiologiques obtenues suite à des enregistrements intracellulaires in vitro. De précédentes études23,24, ce chiffre a été modifié. Oui Stratum Oriens, SP strate Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM strate Lacunosum Moleculare. (A) Aa : Reconstruction d’une cellule de panier CA2 avec restreint arbor dendritique et axonale à l’aide d’un tube à dessin (1000 X). Les dendrites sont en noir, et l’axone est en rouge. AB : Image de la cellule de panier rempli de la biocytine suivant le protocole de l’avidine-HRP décrit ici. AC : Trace représentative des réponses de la tension à hyperpolarisant et dépolarisantes injection de courant d’une cellule de panier CA2 avec restreint arbor dendritique et axonal. Ad : Exemple d’une pyramide de CA2 d’étroites relations de cellule pour le panier arbor enregistrées à l’aide d’électrodes pointus. Composite potentiel post-synaptique excitateur (PPSE) moyennes montrent train brève dépression apparente lors de réponses aux trains de trois crampons. (B) Ba : reconstruction 2D d’une cellule de panier CA2 avec tonnelles large dendritiques et axonales à l’aide d’un tube à dessin (1000 X). L’arbre dendritique de cette cellule de panier (en noir) étendu radialement à travers toutes les couches de la région CA2 et horizontalement en SO SP des régions CA2 et CA3. Une dendrite horizontale a également atteint la région CA1. L’axone (en rouge) étendu aux régions CA3 et CA1. BB : Les remplis de la biocytine (AMCA tachant) panier cellule était PV-immunopositifs (FITC coloration) et CB-immunonegative (coloration rouge-Texas). BC : Trace représentative des réponses de la tension à hyperpolarisant et injection de courant d’une cellule de panier CA2 avec large dendritique et axonal arbor de dépolarisation. BD : Composite RPEB moyennes montrent train bref facilitation apparent lors de réponses aux trains de trois crampons. On trouvera des exemples d’autres types d’interneurones enregistrés en CA2 dans précédentes études25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Figure 2 : Reconstruction 3D du corps cellulaire. (A) le suivi 3D du corps cellulaire. Affichage des contours différents tracés à des positions différentes z tout en mettant l’accent à travers le corps de la cellule. (B) vue 3D des différents contours. (C) la vue 3D du corps cellulaire à un angle différent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Figure 3 : Analyses de morphométrie des reconstructions neuronales 3D. (A) la reconstruction 3D d’une cellule de panier CA2 arbor étroit. Chacune des branches dendritiques sont représenté par une couleur (vert, bleu, rouge et rose) et axon est en bleu clair. Dendrogramme (B) de la cellule de panier qui représente le nombre de ramifications dendritiques et la longueur de chaque segment contenu dans les sphères concentriques avec soma et à 100 μm intervalles de soma. Les couleurs sur le dendrogramme correspondent à celles des dendrites en a. (C) exemple d’analyse morphométrique effectuée sur des cellules pyramidales CA2 (adaptés d’une précédente étude23). Le nombre de ramifications dendritiques a comploté contre la distance entre le soma des cellules pyramidales CA2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Figure 4 : Exemples de bon (A) et pauvres (B) HRP piqueté. (A) la biocytine récupération a révélé un interneurone très bien remplie en CA2. Le corps de la cellule (CB) est taché de sombre et a des contours clairs. Les dendrites sont perlés et affichent quelques épines (représentées par des étoiles rouges). L’arbre axonale (A) est dense et présente de petits boutons. (B) exemple d’une mauvaise dendritiques et axonales coloration des 2 cellules pyramidales Ca2. La coloration de la CB est faible avec aucun contour clair. Coloration pauvre est souvent associée liée des enregistrements électrophysiologiques plus courtes résultant en présence de très peu la biocytine remplis de branches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
Vidéo 1 : Reconstruction neuronale 3D d’une cellule de panier CA2 avec arbor dendritique restreint (également dénommée cellule de panier étroit arbor CA2) avec ses soma de strate pyramidale, dendrites s’étendant sur tous les calques et axone en CA2 stratum pyramidale et strate adjacentes oriens et radiatum. Branches très peu atteint la proximale CA3 strate oriens et CA3 strate pyramidale. Cette cellule a été remplie de la biocytine suite enregistrements électrophysiologiques et sections ont été traitées avec l’avidine-HRP, suivant le protocole décrit ici. En raison de tranchage, seulement l’axone dans la profondeur de la tranche a été retrouvé, bien que les dendrites sont intacts. Dendrites sont en rose foncé et axone en blanc. Limites de couche et de la région ont été ajoutées au début de la vidéo. Reconstruction 3D par Georgia Economides-3D vidéo Svenja Falk. La vidéo a été enregistrée avec un logiciel de reconstruction de neurone, comme indiqué dans l’étape 2.17 et éditée avec un logiciel de montage vidéo. Lien vers la vidéo :30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solutions utilisées</td>
			<td>Composition/Instructions</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de fixation</td>
			<td>paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % saturé de solution d’acide picrique, solution de glutaraldéhyde 0.025 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 M tampon Phosphate pH 7,6</td>
			<td>Ajouter 100 mL de stock tampon 1 M Phosphate dans 900 mL d’eau distillée</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4/7.5</td>
			<td>Ajouter 10 mL de tampon phosphate 0,1 M à 0,2 g de KCl et 8,76 g de NaCl à 990 mL d’eau distillée</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon TRIS pH 7.5</td>
			<td>Dissoudre 5,72 g de chlorhydrate de Tris et 1,66 g de Tris Base dans 50 mL d’eau distillée. Ensuite, faire à 1 L avec de l’eau distillée.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution tampon glutaraldéhyde et paraformaldéhyde fixateur</td>
			<td>paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % saturé de solution d’acide picrique, solution de glutaraldéhyde 0.025 % dans un tampon Phosphate 0,1 M.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de l’ABC</td>
			<td>Solution à apporter au moins 30 min avant utilisation de la trousse de l’ABC. Ajouter 1 goutte de la solution A et 1 goutte de solution B à 2,5 mL de PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Résine époxy de Durcupan :</td>
			<td>Pour faire 20 pots : 20 g de composant A, 20 g de composant B, 0,6 g de composant C et 0,4 g de composant D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protéger l’équilibre contre les déversements en recouvrant la plaque avec un cercle de papier filtre. Soigneusement peser les réactifs dans un bécher de tripour dans les proportions indiquée ci-dessus. Bien mélanger en remuant vigoureusement à l’aide de deux bâtons de bois pendant au moins 5 min. Le mélange doit devenir une couleur brun foncé de densité uniforme. Placer le bécher dans le four à environ 50 ° C pendant un maximum de 10 min pour enlever les bulles d’air autant que possible. Remarque : La résine commence à guérir, si vous laissez le bol dans le four de plus de 10 min. décanter la résine dans des pots en plastique ou des seringues de 5 mL, dater et stockez dans le congélateur-20 ° C prêt à l’emploi.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Tableau des solutions.

Le protocole décrit ici décrit immunofluorescence analyse, récupération de la biocytine et reconstitutions de haute qualité d’hippocampe CA2 interneurones suivant le permettant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vitro, neuronale caractérisation et finalement fine anatomie neuronale à étudier.

Récupération de la biocytine et Reconstructions 3D des interneurones CA2 hippocampe rempli

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Cette méthode peut aider à classer les sous-types neuronaux et à étendre notre compréhension de la carte fonctionnelle des circuits corticals. Ce protocole a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir une excellente récupération des tonnelles dendritiques et axonales, permettant des reconstructions de haute qualité. À la fin d’un enregistrement électrophysiologique, transférer la tranche contenant la cellule enregistrée dans un petit plat d’ACSF.Tout en travaillant dans un capot de fumée, rouler la tranche sur un petit morceau de papier filtre de qualité fine et placer un autre morceau de papier filtre humidifié sur la tranche. Placer le tissu dans une petite casserole en plastique contenant de 5 à 10 millilitres de solution fixative et conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, transférez le tissu du récipient avec la solution fixative à un récipient avec deux millilitres de tampon de phosphate molaire de 0,1 afin de rincer, et coupez n’importe quel tissu excédentaire avec une lame de scalpel.Enlever l’excès de tissu en plaçant la tranche dans une boîte de Pétri, et couper l’excès de tissu avec une lame de scalpel. Transférer le tissu coupé dans une boîte de Pétri propre, en s’assurant qu’il se trouve à plat sans plis ou plis. Retirer l’excédent de tampon à l’aide d’un pinceau sec.Couvrir le tissu d’une solution de gélatine chaude et placer la boîte de Pétri sur un bloc congelé pour refroidir rapidement la solution. Ensuite, déplacez le plat de gélatine à 4 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Dans une hotte de fumée, utilisez une lame de scalpel pour découper un petit bloc de 1 X 1 centimètre contenant le tissu gélatineux incorporé.Soulevez le bloc à l’aide d’une petite spatule et transférez soigneusement vers une solution fixative fraîche. Laisser fixer pendant au moins 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après cette deuxième fixation, laver le bloc de gélatine en cinq millilitres de PB trois fois.Après le lavage, séchez le bloc à l’aide d’un morceau de papier. Ensuite, utilisez une petite quantité de colle cyanoacrylate pour coller le bloc, orienté avec le tissu en haut, sur un camion vibratoire à l’aide de colle super. Sectionner la tranche à 50 microns d’épaisseur à l’aide d’un vibratome et placer soigneusement chaque section dans un flacon de verre contenant 10 pour cent de saccharose.Après la section, ramasser soigneusement une section du flacon et la placer à plat dans un couvercle de boîte de Pétri. Ensuite, utilisez une lame de scalpel frais pour enlever la gélatine autour de la section. Placez les sections dans un flacon contenant 2 millilitres de saccharose frais de 10 pour cent dans PB, et agitez pendant 10 minutes pour commencer le processus de cryoprotection.Après la cryoprotection, placer les sections à plat sur un petit rectangle de papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau. Retirer tout excès de liquide des sections et plier délicatement le papier d’aluminium dans une parcelle. Maintenez la feuille d’aluminium près de la surface de l’azote liquide sans toucher la surface pendant 30 secondes.Et puis laisser les sections décongeler complètement pendant environ 30 secondes. Répétez le gel décongeler encore deux fois. Retirez toutes les sections du papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau et placez-les dans un flacon de verre contenant deux millilitres de PB pour laver l’excès de saccharose sous agitation constante.Après immunostaining pour l’imagerie de fluorescence, placez la glissière dans une boîte en verre de Petri contenant PBS, et retirez soigneusement le glissement de couverture. Ensuite, lavez les sections de la lame à l’aide d’impulsions douces de PBS à partir d’une pipette Pasteur. Placez les sections dans un flacon de verre propre contenant du PBS.Effectuez la réaction Avidin HRP en incubant d’abord les sections du complexe de biotine Avidin ou ABC, pendant au moins deux heures pour amplifier le produit de réaction HRP. Ensuite, lavez les sections avec PBS 3 fois pendant 10 minutes, puis avec le tampon tris deux fois pendant 10 minutes. Après avoir enlevé le dernier lavage tampon tris, ajoutez rapidement une goutte de huit pour cent de solution de chlorure de nickel à la solution de diaminobenzidine ou solution DAB.Ensuite, pipette la solution dans et hors de mélanger et d’ajouter rapidement un millilitre de cette solution sur les sections. Incuber les sections de cette solution pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 1 % à la solution DAB.Laissez la réaction se poursuivre dans l’obscurité sous une agitation constante pendant environ une à deux minutes jusqu’à ce que les cellules soient étiquetées. Dans une hotte de fumée, placer un petit cercle de papier filtre dans une boîte de Pétri et l’humidifier avec PB. Soulevez les sections une à la fois du flacon de verre à l’aide d’un pinceau et placez-les soigneusement à plat sur le papier. Couvrez les sections d’un autre cercle humidifié de papier filtre et retirez l’excès de tampon en touchant doucement le papier de soie à la surface.Appliquer huit ou neuf gouttes d’un pour cent de tétoxyde d’osmium dans PB sur le papier supérieur. Couvrir le plat et le conserver dans le capot des vapeurs pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une heure. Après le rinçage, le montage et la couverture des sections, déshydrater à travers une série de 50 pour cent, 70 pour cent, 95 pour cent, et 100 pour cent des solutions d’alcool.Après l’étape de déshydratation, transférer les sections dans un flacon de verre contenant 100 pour cent d’éthanol sur un shaker pendant environ cinq minutes. Remplacer la solution d’alcool par de l’oxyde de propylène et laver trois fois pendant cinq minutes. Après le dernier lavage, conserver environ deux millilitres d’oxyde de propylène dans le flacon et ajouter de la résine à un rapport de 1:1.Assurez-vous que la résine est dissoute et gardez les sections sous agitation constante pendant 30 minutes. Après 30 minutes, utiliser un bâton en bois pour placer chaque section dans une planchette en aluminium contenant de la résine époxy, et incuber pendant la nuit. Le lendemain, déposer la planchette sur une plaque chaude pendant environ 10 minutes.Ensuite, prenez chaque section avec un bâton en bois et placez-le sur une lame propre. Une fois que toutes les sections ont été transférées sur la diapositive, visualisez la diapositive sous un microscope disséquant pour vérifier l’orientation des tranches et placer un coverslip sur les sections. Guérir au four pendant 48 heures à 56 degrés Celsius.Utilisez un objectif de grossissement faible pour vous concentrer sur la section d’accueil contenant le corps cellulaire. Ensuite, utilisez un objectif 100x, concentrez-vous sur le corps cellulaire, et cliquez au centre pour marquer le point de référence. Pour tracer le soma en 3D à l’aide de l’objectif 100x, sélectionnez le contour de l’onglet trace et sélectionnez le contour du corps cellulaire.Utilisez le joystick pour déplacer la mise au point vers le haut du corps cellulaire. Placez les points en cliquant autour du périmètre de la pièce qui est actuellement au point. Cliquez à droite et sélectionnez le contour étroit pour terminer ce premier contour.Répétez ce processus à différentes positions z jusqu’à ce que le fond du corps cellulaire soit atteint. Pour tracer la tonnelle dendritique, sélectionnez le dendrite ou le dendrite apical, dans le menu neurone. Tout d’abord, tracez un court segment initial pour chaque dendrite à l’aide de la roue de défilement de la souris pour ajuster le diamètre du curseur pour correspondre au diamètre du dendrite.Tracez le long de chaque dendrite. Lorsqu’un nœud de l’arbre est atteint, cliquez à droite et sélectionnez le nœud bifurquant ou le nœud trifurquant du menu dropdown. Pour identifier les points correspondants entre les dendrites dans une section qui correspond à la section terminée, cliquez sur l’onglet déplacer et sélectionnez les points de correspondance.Sélectionnez le nombre de points à apparier, puis appuyez sur OK. Cliquez sur la fin d’une branche terminée, puis cliquez sur la branche. Répétez cette demande pour chaque point de match. Une fois que tous les dendrites de chaque section ont été tracés, tracez l’axon en utilisant le même processus Montré ici est une reconstruction d’une cellule de panier CA2 avec arboration dendritique et axonale restreinte à l’aide d’un tube à dessin.Les dendrites sont en noir et l’axon est en rouge. Il s’agit d’une image d’exemple de la cellule de panier remplie de biocytine suivant le protocole Avidin HRP décrit ici. Voici une vidéo d’une reconstruction neuronale 3D de la cellule de panier CA2.Les dendrites sont en rose foncé et l’axon est en blanc. Enfin, cette image montre un dendrogram de la cellule panier CA2. Il faudra du temps pour devenir compétent avec ce protocole.Cependant, cette approche optimisée peut générer des images à haute résolution de structures corticales et hippocampales complexes in vitro.

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Cette vidéo démontre le processus de visualisation d’un interneurone rempli de biocytine dans une coupe d’hippocampe de rat, mettant en évidence son identité neurochimique grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques et de la microscopie à fluorescence.

Immunocoloration des interneurones dans une coupe d’hippocampe de rat

Cette vidéo montre la procédure de coloration de tranches de cerveau de rat fixes contenant des interneurones remplis de biocytine. Le protocole comprend l’incubation avec le complexe avidine-biotine (ABC), la coloration avec HRP et substrat chromogène, la préservation des structures avec du tétroxyde d’osmium et l’intégration du tissu dans de la résine pour l’imagerie.

Marquage d’interneurones remplis de biocytine dans des tranches d’hippocampe de rat pour visualisation

Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d'étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l'architecture dendritique et axonale.

Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Les cultures à faible densité de neurones primaires de l’hippocampe nécessitent généralement une couche nourricière gliale pour fournir des facteurs neurotrophiques et maintenir la longévité. Nous décrivons ici une méthode simplifiée de culture de neurones à ultra-faible densité sur des lamelles de verre en présence d’une couche nourricière neuronale à haute densité, ce qui facilite l’étude de mécanismes neuronaux autonomes spécifiques.

Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

Ce protocole présente un procédé pour la récupération morphologique des neurones corrigés lors des enregistrements électrophysiologiques en utilisant le remplissage de la biocytine et de post-traitement immunohistochimique ultérieure. Nous montrons que les sections de biocytin rempli d'épaisseur qui ont été colorées et sous une lamelle peuvent être recolorées avec un deuxième jours ou des mois d'anticorps primaires plus tard.

Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Ici, nous présentons des protocoles pour la préparation des tranches aigues de cerveau contenant le noyau génuulé latéral et l'investigation électrophysiologique de la fonction de synapses de rétinogeniculate et de corticogeniculate. Ce protocole fournit un moyen efficace d'étudier les synapses avec la probabilité de libération élevée et faible dans les mêmes tranches de cerveau aigus.

Investigations électrophysiologiques de la fonction de synapse de rétinogeniculate et de Corticogeniculate

Nous présentons un protocole pour préparer des tranches aiguës de l’hippocampe dorsale-intermédiaire des souris. Nous comparons cette préparation transversale avec le tranchage coronal en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.

Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

La combinaison de la transduction du vecteur viral et de l’élimination du cerveau à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément un grand nombre de neurones et d’astrocytes.

Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés

Découvrez la récupération de la biocytine et les reconstructions 3D d'interneurones CA2 hippocampiques après enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode optimise la préservation de l'ultrastructure neuronale pour des analyses anatomiques précises.

Récupération de la biocytine et Reconstructions 3D des interneurones CA2 hippocampe rempli

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