Solution de la structure de la protéine fluorescente Cerulean à l’aide de MeshAndCollect

Le protocole automatisé MeshAndCollect a été développé pour combiner la cristallographie en série avec la collecte standard de données de rotation pour mesurer les petits cristaux à partir d’échantillons de rondelle. La méthode identifie d’abord la position des cristaux montés sur le même support d’échantillon pour ensuite diriger la collecte d’ensembles de données partiels qui seront ensuite fusionnés et utilisés pour la solution de la structure. MeshAndCollect est convaincant car il vous permet de faire des expériences rapidement et avec la même configuration, solution de structure, criblage ligand, et tout cela avec de minuscules cristaux.

La méthode est compatible avec le VMX de synchrotron beamline idéalement équipé d’un flex photon élevé, d’un petit diamètre de faisceau et d’un détecteur de recharge rapide. Tout d’abord, connectez-vous au système d’information étendu pour la base de données de beamline de cristallographie protéique et choisissez MX.Connectez-vous avec le numéro d’expérience et le mot de passe du formulaire A. Ensuite, sélectionnez Envoi Ajouter neuf et remplir les informations demandées.

Sélectionnez Ajouter partiellement et remplissez les données pertinentes. Sélectionnez Ajouter le conteneur, choisissez une rondelle SC3 et remplissez l’information requise, y compris les positions des porte-échantillons dans la rondelle. Dans le clapier expérimental, chargez la rondelle dans le faiseur de changeur d’échantillon et notez sa position.

Ensuite, connectez-vous au système d’information pour la base de données de beamline de cristallographie protéique. Sélectionnez Préparer l’expérience, trouvez l’envoi, sélectionnez Suivant et indiquez la position de la ligne de faisceau et de la rondelle dans le changeur d’échantillon. Connectez-vous au logiciel de contrôle de la ligne de faisceau avec le numéro expérimental et le mot de passe fournis sur le formulaire A.

Appuyez sur Synchronisez pour synchroniser le logiciel de contrôle de la ligne de faisceau avec le système d’information pour la base de données de beamline de cristallographie protéique. Utilisez le logiciel de commande de faisceau pour monter le support de l’échantillon sur le goniomètre. Cliquez ensuite à droite sur une position dans la zone de changeur d’échantillon et sélectionnez l’échantillon de montage.

Sélectionnez le bouton central, puis trois clics au centre au milieu du bord de la pointe de la boucle. Enregistrez la position centrée en sélectionnant Enregistrer. Sous Advanced, ajoutez la réorientation visuelle du flux de travail à la file d’attente de collecte de données.

Lancez ensuite le flux de travail en cliquant sur Collect Queue. Ensuite, sélectionnez l’une des positions maîtresses enregistrées en cliquant dessus. Cliquez à nouveau sur le bouton central, puis un centre de trois clics au milieu du début de la tige de la boucle.

Enregistrez la deuxième position en cliquant sur Enregistrer. Et puis cliquez sur Continuer. Une fois que le flux de travail aligne le plan du support de l’échantillon avec l’axe de rotation du goniomètre, centrez à nouveau le support de l’échantillon quelque part au milieu du maillage.

Orientez le support de l’échantillon de sorte que la face du maillage soit perpendiculaire à la direction du faisceau de rayons X en tournant l’axe omega à l’aide du logiciel de commande de la ligne de faisceau. Dans le logiciel de contrôle de la ligne de faisceau, cliquez sur le menu de dropdown Aperture et sélectionnez une valeur. Cliquez ensuite sur l’icône de l’outil maillage pour faire monter la fenêtre de l’outil en maille.

Dans la vue d’échantillon du logiciel de commande de faisceau, dessinez le maillage en cliquant à gauche et en faisant glisser la souris au-dessus de la zone contenant des cristaux sur le support de l’échantillon. Pour enregistrer le maillage, cliquez sur le bouton plus dans la fenêtre de l’outil en maille. Dans le champ de résolution du logiciel de contrôle de la ligne de faisceau, entrez la résolution à laquelle les images de diffraction doivent être collectées.

Si aucune information préalable n’est connue sur la qualité de diffraction des cristaux, une valeur comprise entre deux et 2,5 est recommandée. Sélectionnez MeshAndCollect dans l’onglet Collecte de données avancée. Ajoutez-le à la file d’attente et cliquez sur Recueillir la file d’attente.

Dans la fenêtre de paramètre, utilisez les paramètres par défaut dépendants de la ligne de faisceau. Dans l’expérience décrite ici, les paramètres par défaut sont 0,037 seconde temps d’exposition par point de balayage en maille, transmission à 100%, et une oscillation degré par ligne de balayage maille. Cliquez sur Continuer.

L’analyse de maille s’exécute et les images de diffraction recueillies à chaque point de grille sont analysées et classées en fonction de la force de diffraction avec le logiciel Dozer. Après l’analyse Dozer, une carte thermique est générée et l’ordre des collectes partielles ultérieures de données est attribué automatiquement en fonction de la force de diffraction. Enfin, cliquez sur Continuer à lancer les collectes partielles de données.

MeshAndCollect tel qu’il a été mis en œuvre dans MXCuBE a été utilisé pour la collecte d’ensembles de données de diffraction partielle à partir de petits cristaux de Cerulean situés sur le même porte-échantillon dans lequel l’identification visuelle des cristaux était difficile. Pour filtrer le support de l’échantillon, une grille a été dessinée au-dessus du centre de la boucle de maille et, sur la base de la carte de chaleur du score Dozer, 85 ensembles partiels de données de diffraction ont été automatiquement collectés. Ceux-ci ont été intégrés individuellement puis fusionnés pour produire un ensemble de données avec 99,8% d’exhaustivité à une résolution de 1,7 angstroms.

Comme prévu, la structure cristalline de Cerulean pourrait être résolue par remplacement moléculaire à l’aide de l’ensemble de données générées. Après raffinement, un travail de R de 22,8% et un R libre de 25,4% ont été obtenus. La super position de la structure précédemment déterminée montre un RMSD global sur des positions c-alpha de 0,1 angstroms.

Pour les projets où l’optimisation de la phase de croissance du cristal, MeshAndCollect offre la possibilité d’obtenir un ensemble de données complet basé sur la combinaison de ces ensembles de données partielles amorphes obtenus à partir de cristaux plus petits. Cette technique a ouvert la voie aux biologistes structurels pour résoudre une structure à partir d’échantillons de pièces où seuls quelques dixièmes de micro cristaux ne pouvaient pas être produits.