Détection de Tilapia lac Virus à l’aide de RT-PCR classique et SYBR Green RT-qPCR

Bienvenue à tous. Je m’appelle Win Surachetpong. Je suis professeur adjoint à la Faculté de microbiologie vétérinaire et d’immunologie de médecine vétérinaire de l’Université Kasetstart, en Thaïlande.

Mon équipe et moi nous spécialisons dans les maladies virales émergentes dans le tilapia. Nous travaillons maintenant sur le virus du lac tilapia qui cause une mortalité élevée dans le tilapia. Étant donné que le tilapia est la deuxième espèce de poisson la plus importante qui est la culture dans le monde, il fournit une source de protéines pour un million de personnes et joue un rôle important pour la sécurité alimentaire.

Ainsi, la récente éclosion du virus du lac tilapia a eu un impact socioéconomique qui a amené de nombreux scientifiques à essayer de trouver une solution à ce problème. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’une méthode très sensible, rapide et précise pour détecter le virus. Dans cette vidéo, nous vous montrerons étape par étape pour détecter le virus du lac tilapia dans les tissus des poissons à partir de la collecte d’échantillons, de la population d’échantillons et de l’analyse pcr en temps réel.

Tout d’abord, solubiliser le surdosage d’huile de tissu dans l’eau pour euthanasier le poisson. Placez le poisson mort sur un plateau, stérilisez l’équipement à l’aide de 95 % d’éthanol, puis brûlez avec un brûleur d’alcool. Coupez lentement le poisson du bas-ventre vers le haut, pour recueillir le foie.

Recueillir une partie du foie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. La première partie de l’extraction de l’ARN doit être effectuée dans un capot d’écoulement Laminar, et porter de l’équipement de protection. Ajouter un millilitre de réadage d’extraction d’ARN dans le tube.

Pulvériser le foie à l’aide d’un pilon tissulaire en homogène. Ajouter 200 microlitres de chloroforme dans le tube. Ensuite, mélanger délicatement en inversant le tube plusieurs fois.

Réserver pendant trois minutes à température ambiante. Centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 12 000 RCF pendant 15 minutes. Recueillir soigneusement les tubes de la centrifugeuse.

Transférer délicatement 500 microlitres de la phase incolore supérieure aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter un volume d’isopropanol dans le tube. Chauffer à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures ou jusqu’à la nuit pour précipiter l’ARN.

Après l’incubation, centrifuger la solution à la même condition de centrifugeuse. Recueillir les tubes de la centrifugeuse, puis jeter le supernatant. La pastille d’ARN peut être considérée comme pointée par la flèche.

Ajouter un millilitre de 75 % d’éthanol dans le tube pour laver la pastille d’ARN et inverser plusieurs fois. Centrifugeuse à 4 degrés Celsius, à 10 000 RCF pendant 15 minutes. Recueillir les tubes de la centrifugeuse, puis jeter le supernatant.

Sortir les restes d’éthanol à l’aide du tuyau automatique et sécher à l’air sec à température ambiante pendant cinq à dix minutes. Ajouter 30 à 60 microlitres d’eau libre RNase, préchauffé à 55 à 60 degrés Celsius pour solubiliser la pastille d’ARN. Utilisez un à deux microlitres de solution ARN pour mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre à micro volume.

Les résultats s’afficheront à l’écran. Diluer la concentration à 200 nanogrammes par microlitre à l’aide d’eau libre RNase. Effectuez la synthèse de l’ADN à l’aide des produits chimiques et des conditions énumérés comme suit.

Utilisez un thermocycleur pour convertir l’ARN en ADND avec des conditions suggérées. Ce qui suit sont les produits chimiques et les conditions utilisées pour déterminer la charge TiLV en utilisant pcr en temps réel. Distribuez six millilitres du mélange principal qPCR dans chaque flacon de tube blanc de bande qPCR.

Par la suite, quatre millilitres d’échantillon d’ADNC sont chargés dans le puits. À ce stade, une nouvelle pointe de tuyau doit être changée dans chaque puits, afin d’éviter la contamination d’un échantillon à l’autre. Scellez hermétiquement la bande qPCR avec un bouchon de bande qPCR transparent.

Mélanger délicatement la solution en feuilletant à une pointe de la bande. Puis tourner vers le bas à l’aide de micro centrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond des navires. Utilisez l’état en deux étapes comme indiqué dans la vidéo, sélectionnez le puits dans 96 plaque de puits que vous allez utiliser.

Sélectionnez cyber vert comme la flore pour teindre. Sélectionnez inconnu comme type d’échantillon, et insérez un nom dans une boîte de nom d’échantillon. Ouvrez le couvercle d’une machine PCR en temps réel et placez la bande qPCR dans le puits assigné.

Ensuite, fermez le couvercle. Exécutez la machine avec la condition sélectionnée. La machine démarre et fonctionne après que le couvercle ait atteint la température désirée.

Après la fin des conditions qPCR, la courbe d’amplification est affichée. Ici, la flèche de taux indique où le seuil se coupe entre la phase exponentielle et la phase linéaire qui se traduit par une valeur CT. La valeur CT est ensuite extrapolée dans le numéro de copie de journal de virus pour calculer un certain nombre de restes de virus en utilisant la courbe standard.

Le pic de fonte est également affiché pour identifier si le virus détecté par qPCR est, en effet, TiLV dans lequel les pics de fonte varient généralement entre 79,5 et 80,5 degrés Celsius. Nous espérons donc que cette méthode sera un outil important pour les agriculteurs et l’organisation du monde entier, qui peuvent avoir besoin de mettre en œuvre un contrôle et de limiter la propagation de l’infection tilv.