Name: Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Découvrez une méthode de livraison d'oligonucléotides utilisant des nanotubes de carbone monoparoi pour traiter le myélome multiple. Cette technique améliore l'efficacité thérapeutique in vivo avec une toxicité limitée.

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Les auteurs remercient l’Institut de recherche Lerner de protéomique, génomique et carottes d’imagerie pour leur aide et soutien. Financement : Ce travail a été soutenu financièrement par subvention de NIH/NCI R00 CA172292 (pour J.J.Z.) et fonds d’amorçage (à J.J.Z.) et la clinique et translationnelle Science Collaborative (CNTC) de la Case Western Reserve University Core utilisation pilote Grant (à J.J.Z.). Ce travail a utilisé le microscope confocal Leica SP8 qui a été acheté grâce à un financement des instituts nationaux de santé SIG grant 1S10OD019972-01.

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été pré-approuvé par le Cleveland Clinic IACUC (Comité de l’emploi et animalier institutionnel).
1. synthèse du simple couche fonctionnalisés
<ol><li>Mélanger 1 mg de simple couche, 5 mg de DSPE-PEG2000-Amine et 5 mL d’eau exempte de nucléase stérilisée dans un flacon en verre de scintillation (20 mL). Secouez bien pour dissoudre tous les réactifs complètement.</li>
	<li>Laisser agir le flacon dans un sonicateur de bain d’eau à un niveau de puissance de 40 W pendant 1 h à température ambiante (RT, 20 min x 3, changez l’eau toutes les 20 min pour éviter les surchauffes). Ensuite, il centrifuger à 24 000 x g pendant 6 h et recueillir le surnageant. Cette solution SWCNT fonctionnelle peut être conservée à 4 ° C pendant 2 mois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution de NCM à l’étape 1.2 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau stérilisée exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT pour supprimer supplémentaire DSPE-PEG2000-amine. Répétez l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation 5 x. Plus de 0,5 mL de solution SWCNT reste seront laissé dans le filtre après chaque centrifugation.</li>
	<li>Mesurer la concentration de la solution SWCNT reste dans le filtre à l’aide d’un spectromètre UV/VIS à 808 nm après le lavage final. La concentration finale est généralement environ 50 mg/L (calculé selon la méthode développée par Kam et al.18). Remarque : Assurez-vous que la simple couche DSPE-PEG-fonctionnalisés est solubles dans l’eau après l’étape 1.4 et est stables dans les différentes solutions biologiques sans agrégation visible après quelques semaines.</li>
</ol>2. conjugaison de l’Anti-MALAT1 Gapmer ADN flanqué de 2'-O mis à jour le RNAs à SWCNT fonctionnalisé
<ol><li>Ajouter 0,5 mg de Sulfo-LC-DPS dans 450 µL du DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Ajouter 50 µL de PBS de x 10 et puis incuber pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Pour supprimer des Sulfo-LC-DPS supplémentaire, ajouter la réaction de l’étape 2.1 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT. Repeat l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation x 5.</li>
	<li>Ajouter 200 nM thiols modifiés anti-MALAT1-Cy3 gapmer ADN dans 1,5 mL de solution commerciale de DTT et incuber pendant 90 min à RT. purifier le produit avec une colonne de NAP-5, suivant le protocole du fabricant. Éluer les anti-MALAT1-Cy3 avec 500 µL de stérilisé sans nucléase 1 x PBS. Remarque : Le NCM fonctionnalisé peut être stocké avec TNT supplémentaire, qui pourrait se clivent disulfures formés lors du stockage de la thiolés anti-MALAT1 gapmer ADN. La TNT ajoutée peut être retirée par l’aNAP-5 colonne avant la conjugaison avec le NCM.</li>
	<li>Recueillir la solution DSPE-PEG2000-amine SWCNT sulfo-LC-DPS-traités a laissé dans le filtre et le diluer avec 500 µL de solution d’anti-MALAT1-Cy3. Ensuite, il incuber à 4 ° C pendant 24 h. Le conjugué SWCNT-anti-MALAT1 peut être stockés à 4 ° C pendant 3 semaines. Suivant la même procédure, le NCM conjugué avec oligo antisens scramble peut être synthétisé et utilisé comme SWCNT-contrôle.</li>
</ol>3. queue Injection dans la veine de SWCNT-Anti-MALAT1
<ol><li>
Générer un modèle de souris disséminée de MM.
	<ol>
<li>Pour obtenir les meilleurs résultats de la comparaison, au hasard organiser 14 clin de œil. Souris CB17-Prkdcscid/J (8 semaines) en groupes de l’essai ou de contrôle (sept dans chaque groupe) avec le même ratio homme/femme.</li>
		<li>Nettoyer le banc de l’opération et stériliser à l’alcool à 70 %.</li>
		<li>Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer la souris pour aider la queue veineuse pour apparaître. Immobiliser la souris correctement avec une drisse d’injection de queue.</li>
		<li>Injecter des cellules de 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry dans 50 µL de PBS dans la veine de la queue sans anesthésie. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s. marque la souris injectée et remettez-le dans une cage propre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Commencer le traitement sur le 7e jour après l’injection de cellules MM.1S.
	<ol>
<li>Injecter 50 µL de PBS contenant SWCNT-anti-MALAT1 dans la veine de la queue de la souris. Utilisation PBS contenant SWCNT-contrôle comme un contrôle.</li>
		<li>Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s.</li>
		<li>Observez le saignement local sur la queue et le comportement général de la souris pendant 1 min et puis la remettre à une cage propre. Observez tout injecté de souris à nouveau avant de retourner la cage sur le rack, pour s’assurer que les injections sont bien tolérées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Renouveler l’injection tous les 7 jours jusqu'à la fin de l’expérience.
	<ol>
<li>Mettre fin à l’expérience lorsque la souris les soins de santé se dégrade : quand ne pas manger ou boire, l’apparition des pattes pâles, tout saignement sous-cutanés, un essoufflement, diminution de l’activité, une paralysie des membres inférieurs, et/ou une masse palpable dans le abdomen est observée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. evaluation de la Progression de la maladie
<ol><li>Évaluer l’état général des souris tous les jours après l’injection de cellules MM.1S-Luc-mCherry. Accorder une attention particulière si les souris se paralyse des membres inférieurs.</li>
	<li>
Évaluer la croissance de la tumeur à l’aide d’un appareil d’imagerie in vivo 1 x par semaine, avant l’injection SWCNT-anti-MALAT1.
	<ol>
<li>Préparer les frais 15 mg/mL D-luciférine avec du PBS 1 x.</li>
		<li>Anesthésier les souris avec un vaporisateur isoflurane (3 à 5 % pour l’induction et 1 à 3 % pour l’entretien, selon l’état des souris).</li>
		<li>Injecter par voie intrapéritonéale de 150 mg/kg D-luciférine dans chaque souris, 5 min avant l’imagerie ; Ensuite, l’image les souris dans une position couchée avec un spectre de système d’imagerie.</li>
		<li>Recueillir des images séquentielles des souris toutes les 2 min, jusqu'à ce que la saturation de la luminescence est atteint. Régler l’intervalle de temps selon l’absorption D-luciférine/signal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 permet de sacrifier les souris après avoir atteint la fin de l’expérience.</li>
	<li>
Puisqu’il s’agit d’un modèle de diffusion de MM, traiter les souris comme suit.
	<ol>
<li>Peser la souris avant la dissection.</li>
		<li>Recueillir le sang périphérique du fond du cœur pour un dosage de la numération formule sanguine (CBC) interprété par une machine de compteur de cellules sanguines. Les comtes de globules rouges et les globules blancs, ainsi que le taux de lymphocytes, est les principaux index.</li>
		<li>Isoler la rate et pesez-le. Calculer le ratio de rate/poids ; envisager de > 0,5 % comme l’élargissement de la rate.</li>
		<li>Recueillir les tissus de la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, rein et les tissus présentant des métastases visible.</li>
		<li>Recueillir la colonne vertébrale si la souris a développé une paralysie des membres inférieurs.</li>
		<li>Extraire l’ARN et des protéines des échantillons de moelle osseuse.</li>
		<li>Fixer tous les tissus restants dans du formol.</li>
		<li>D’un détartrage, immergez les échantillons osseux dans la solution d’EDTA 0.25 M (pH 8,0) pendant 5 jours après 24h de fixation.</li>
		<li>Plongez tous les échantillons dans 75 % d’alcool pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comparer l’intensité du signal de la luciférase dans les points dans le temps même dans les deux groupes. Des deux groupes, enregistre les dates de sacrifice de chaque souris et on calcule les courbes de survie des deux groupes avec le logiciel. Remarque : Toutes les procédures sont résumées dans la Figure 1.</li>
</ol>

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<li>Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+reduction+of+disulfide+bonds+in+lysosomes%3A+characterization+of+a+gamma-interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).</li>
<li>Lelimousin, M., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+carbon+nanotube+insertion%3A+pathways+to+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization.</a> Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).</li>
<li>Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+mechanism+and+stability+of+boron+nitride+nanotubes+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers.</a> J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).</li>
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<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cellular+uptake+and+expulsion+of+single-walled+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de nombreuses procédures physiologiques et physiopathologiques dans les cancers, y compris MM7,8,9; Ils ont le potentiel d’être la cible pour le traitement du cancer, qui peut être réalisé par oligonucléotides antisens20,21,22. La U.S. Food and la Drug Administration (FDA) a ...

Le NCM est un nanomatériau roman qui peut fournir différents types de médicaments, comme les acides nucléiques, protéines et petites molécules stablement et efficacement avec la tolérabilité idéale et toxicité minimale1 de la vitro et in vivo2. Un SWCNT fonctionnalisé a grande solubilité de biocompatibilité et de l’eau, peut être utilisé comme un service de navette pour les molécules plus petites et peut transporter pour pénétrer la membrane de la cellule3,4,5.
lncRNAs sont un amas d’ARN (> 200 nt) qui sont transcrits à partir du génome à l’ARNm, mais ne peut pas être traduit en protéines. Augmentant la preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de l' expression de gène6 et sont impliqués dans l’apparition et la progression de la plupart des types de cancer, y compris MM7,8,9. MALAT1 est une transcription non codante nucléaire enrichi 2 (NEAT2) et un lncRNA hautement conservée10. MALAT1 est initialement reconnu métastatique pulmonaire non à petites cellules (NSCLC) le cancer11, mais a été surexprimé dans nombreuses tumeurs5,12,13; Il est l’un de le lncRNAs plus fortement exprimée et est corrélé à un mauvais pronostic en MM8,14. Le niveau d’expression de MALAT1 est significativement plus élevé chez les cours fatal extramédullaire MM par rapport à ceux diagnostiqués uniquement sous la forme MM15.
Dans une étude précédente, nous avons confirmé qu’anti-MALAT1 oligos conduire fermement pour dommages à l’ADN et l’apoptose dans MM16 en utilisant des oligonucléotides antisens d’ADN gapmer ciblage MALAT1 (anti-MALAT1) dans les cellules MM. L’ADN de gapmer est composé d’ADN antisens et relié par 2'-OMe-ARN, qui pourrait inciter un clivage MALAT1 par la RNase H activité liée une fois17. L’efficacité de livraison in vivo des oligonucléotides antisens limite toujours son utilisation clinique.
Pour tester la livraison effet de SWCNT pour anti-MALAT1 gapmer oligos, l’anti-MALAT1 gapmer ADN est conjugué à la DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Le NCM-anti-MALAT1 est ensuite injectée par voie intraveineuse dans un modèle de souris disséminée MM ; On observe une inhibition frappante après quatre traitements.

<table><tbody><tr><td>SWCNTs</td><td>Millipore-Sigma</td><td>704113</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000-Amine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td></td></tr> bain <tr><td>sonicateur</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr><tr><td>Filtre centrifuge 4 mL</td> Spectromètre UV/VIS <td>Millipore-Sigma</td><td>Z740208-8EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>accuSkan GO Spectrophotomètre</td> <td>à microplaques UV/Viscoefficient d’extinction de 0,0465 L/mg/cm à 808 nm</td></tr><tr><td>Sulfo-LC-SPDP</td><td>ProteoChem</td><td>c1118</td><td></td></tr><tr><td>Solution DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>NAP-5 colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD. Souris CB17-Prkdcscid/J</td><td>Charles River lab</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>Becton Dickinso</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine2000</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 moyen</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>MALAT1-QF :</td><td>synthétisé par IDT Compagnie</td><td></td><td>5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'</td></tr><tr><td>MALAT1-QR :</td><td>synthétisé par IDT Company</td><td></td><td>5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'</td></tr><tr><td>GAPDH-QF :</td><td>synthétisé par la société</td><td></td> IDT <td>5'- CAAGAGCACAAGAGGAGAGAG - 3'</td></tr><tr><td>GAPDH-QR :</td><td>synthétisé par IDT Company</td><td></td><td>5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'</td></tr><tr><td>PCR quantitative à l’aide de SYBR Green PCR master mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc de premier rang RevertAid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>anti-MALAT1</td><td>synthétisé par IDT Company</td><td></td><td>5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*A*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'</td></tr><tr><td>Kit d’analyse de viabilité cellulaire</td><td>Promega Corporation</td><td>G7570</td><td>CellTiter-GloLuminescent Kit d’analyse de viabilité cellulaire</td></tr><tr><td>accuSkan GO Spectrophotomètre à microplaques UV/Vis Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre centrifuge</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>logiciel SPSS</td><td>IBM</td><td>version 24.0</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr></tbody></table>

répression de la croissance de cellules de myélome multiple in vivo par nanotube de carbone monoparoi (ncm)-livré malat1 oligonucléotides antisens

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

Le nanotube de carbone monoparoi (NCM) est un nouveau type de nanoparticules, qui a été utilisé pour livrer plusieurs sortes de drogues dans les cellules, tels que des protéines, des oligonucléotides et médicaments à petites molécules synthétiques. Le NCM a dimensions personnalisables, une vaste zone superficielle et peut se lier avec souplesse avec des médicaments par le biais de différentes modifications sur sa surface ; par conséquent, c’est un système idéal pour transporter les médicaments dans les cellules. ARN long non codantes (lncRNAs) est un amas d’ARN non codant plu de 200 nt, qui ne peut pas être traduit en protéine, mais joue un rôle important dans les processus biologiques et physiopathologiques. Associées aux métastases pulmonaires adénocarcinome transcription 1 (MALAT1) est une lncRNA hautement conservée. Il a été démontré que des niveaux plus élevés de MALAT1 concernent le mauvais pronostic de divers cancers, notamment le myélome multiple (MM). Nous avons révélé que MALAT1 régule l’ADN réparation et la mort cellulaire en MM ; ainsi, MALAT1 peut être considéré comme une cible thérapeutique pour MM. Cependant, l’efficience de l’oligo antisens pour inhiber/knockdown MALAT1 in vivo est toujours un problème. Dans cette étude, nous modifier le NCM avec PEG-2000 et conjugué un oligo anti-MALAT1 à elle, tester la livraison de ce composé in vitro, injecter par voie intraveineuse dans un modèle de souris MM disséminé et observer une inhibition significative de la progression de MM, ce qui indique cette SWCNT est une navette de livraison idéal pour anti-MALAT1 gapmer ADN.

Pour démontrer l’effet d’inhibition de l’anti-MALAT1 gapmer ADN en MM, nous renversé l’expression de MALAT1 et utilisé dans les cellules H929 et MM.1S. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été prélevés pour l’analyse de l’efficacité de la précipitation et le statut de l’apoptose dans les cellules transfectées avec gapmer anti-MALAT1 ou contrôle ADN. résultats qRT-PCR ont montré que les anti-MALAT1 gapmer ADN renversé efficacement l’expression de MALAT1 dans les cellules H929 e...

Ce manuscrit décrit la synthèse d’un nanotube de carbone monoparoi (NCM)-conjugué MALAT1 gapmer antisens ADN d’oligonucléotide (SWCNT-anti-MALAT1), qui montre la remise fiable du NCM et le puissant effet thérapeutique de anti-MALAT1 in vitro et in vivo. Méthodes utilisées pour la synthèse, de modification, de conjugaison, et injection de SWCNT-anti-MALAT1 sont décrites.

Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens

The single-wall carbon nanotube (SWCNT) is a new type of nanoparticle, which has been used to deliver multiple kinds of drugs into cells, such as ...

La méthode que nous utilisons ici peut aider à emballer l’oligonucléotide avec nanotube de carbone à paroi unique, qui est un nouveau type de nanoparticule pour l’administration de médicaments. Le principal avantage de cette technique est la livraison plus efficace de médicaments oligonucléotides dans les cellules in vivo. Les implications de cette technique s’étendent à la recherche myélome multiple, parce qu’il est introduit nanoparticule pour améliorer la livraison de médicaments oligonucléotides.Grâce à cette méthode peut fournir un aperçu du traitement du myélome multiple. Il peut également être appliqué à d’autres maladies et conjugué avec d’autres cargaisons, telles que les protéines et les petites molécules. Tout d’abord, mélangez un milligramme de nanotubes de carbone à paroi unique, cinq milligrammes d’amine DSPE-PEG 2000 et cinq millilitres d’eau stérilisée sans nucléase dans un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres.Sonicate le flacon dans un sonicator bain d’eau à un niveau de puissance de 90 watts pendant une heure à température ambiante. Après la sonication, centrifuger le flacon à 24 000 fois g pendant six heures. Ensuite, collecter la solution supernatant.Ajoutez un millilitre de la solution nanotube de carbone à paroi unique à un dispositif de filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons suivi de quatre millilitres d’eau nucléase-libre stérilisée. Centrifugeuse pendant 10 minutes à 4000 fois g à température ambiante pour enlever l’excès d’amine. Ajouter 0,5 milligramme de Sulfo-LC-SPDP à 450 microlitres du nanotube de carbone à paroi unique fonctionnalisé par amine.Ajouter ensuite 50 microlitres de 10x PBS, et incuber pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange de réaction à un dispositif de filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodalton, suivi de quatre millilitres d’eau sans nucléase. Centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 4000 fois g à température ambiante pour enlever l’excès Sulfo-LC-SPDP.Recueillir la solution nanotube de carbone à paroi unique Sulfo-LC-SPDP laissée dans le filtre et la diluer avec 500 microlitres de solution anti-MALAT1-Cy3 précédemment préparée. Puis incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour obtenir les meilleurs résultats de comparaison, organisez au hasard 14 souris en groupes d’essai ou de contrôle avec sept dans chaque groupe, et avec le même rapport homme-femme dans chaque groupe.Ensuite, nettoyez le banc d’opération et stérilisez-le avec 70% d’alcool éthylique. Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer l’une des souris pour aider la veine de la queue à apparaître. Retenez la souris correctement à l’aide d’un restrainer d’injection de queue.Injecter des cellules MM.1S-luc/mCherry dans 50 microlitres de PBS par la veine de la queue. Appuyez sur le site d’injection avec un écouvillon d’alcool pendant 30 secondes. Ensuite, marquez la souris injectée et retournez-la dans une cage propre.Le septième jour, après l’injection de cellules MM1S, injectez 50 microlitres de PBS contenant un nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1 dans la veine arrière de la souris. Appuyez ensuite sur le site d’injection avec un écouvillon d’alcool pendant 30 secondes. Observez le saignement local sur la queue et le comportement général de la souris pendant une minute, puis retournez-le dans une cage propre.Observez à nouveau toutes les souris injectées avant de retourner la cage sur la grille pour vous assurer que les injections sont bien tolérées. Pesez chaque souris avant la dissection. Recueillir le sang périphérique du cœur pour un test complet de dénombrement du sang effectué par une machine de compteur de cellules sanguines.Ensuite, recueillir les tissus de la moelle osseuse, la rate, le ganglion lymphatique, les reins, et le tissu avec des métastases visibles. Extraire l’ARN et les protéines des échantillons de moelle osseuse. Fixer tous les tissus restants dans la formaline.Après 24 heures de fixation, plonger les échantillons d’os dans une solution EDTA 0,5 molaire pendant cinq jours pour la décalcification. Plongez ensuite tous les échantillons dans de l’alcool éthylique à 75 % pour un entreposage à long terme. Les résultats de PCR de QRT ont prouvé que l’ADN gapmeR anti-MALAT1 a renversé l’expression malat1 et induit l’apoptose de manière significative dans les cellules H929 et MM.1S.Nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 a été livré dans le noyau des cellules MM, et significativement supprimé le niveau endogène MALAT1 dans les cellules H929 et MM.1S. La viabilité de la cellule BMEC-1 n’a pas de différence significative après le traitement du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 ou le contrôle à différents dosages et points de temps. Cela indique que la toxicité du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1-Cy3 a une toxicité limitée et acceptable pour les cellules normales à forte dose.Un modèle humain de souris disséminées par MM a été établi pour évaluer les effets de traitement du nanotube de carbone à paroi unique anti-MALAT1 in vivo. Les signaux luciferon des souris dans le groupe de traitement anti-MALAT1 de nanotube de carbone à paroi unique étaient remarquablement inférieurs comparés au contrôle après 21 jours de traitement. De ces résultats, il a été conclu que le traitement anti-MALAT1 à nanotube de carbone à paroi unique par injection intraveineuse pourrait fournir efficacement les oligos anti-MALAT1 aux cellules tumorales.Aucun effet secondaire significatif du traitement n’a été observé, indiquant que l’injection anti-MALAT1 de nanotube de carbone à paroi unique est un traitement sûr pour des souris. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la composition de molécule cellulaire influencera la livraison, l’efficacité, et l’effet thérapeutique des drogues d’oligonucléotide. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la conjugaison de protéines ou de petites molécules peuvent être réalisées afin de répondre à d’autres questions.Comme l’utilisation de nanotubes de carbone à paroi unique pour livrer d’autres médicaments.

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Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens (Vidéo) | JoVE Journal

Répression de la croissance de cellules de myélome Multiple In Vivo par Nanotube de carbone monoparoi (NCM)-livré MALAT1 oligonucléotides antisens

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