Estimation du nombre de néphron dans le rein entier à l’aide de la méthode de macération acide

La méthode de macération acide peut aider à répondre à des questions clés sur le rein et comment des gènes spécifiques contribuent ou influencent le développement du néphron ainsi que la façon dont des conditions spécifiques, comme le diabète ou l’hypertension, affectent le nombre de néphrons. Ceci est important car un nombre total de néphrons d’un individus nés avec est déterminé pendant le développement foetal et la perte des néphrons a été associée à la pathologie rénale. Les principaux avantages de la méthode de macération acide sont qu’elle est plus rapide, plus reproductible, peu coûteuse et moins longue que d’autres méthodes de comptage du néphron, comme l’imagerie par résonance magnétique.

Cette technique facilite la corrélation de l’impact du nombre de néphrons sur la fonction rénale, ce qui est important pour mieux comprendre comment des gènes spécifiques influencent la fonction et le développement du néphron. L’étude des gènes ou des facteurs qui influencent le nombre global de néphrons jouera un rôle déterminant dans le développement d’approches pharmacologiques ou génétiques conçues pour limiter la perte de néphron associée à la maladie. Avec une bonne technique expérimentale et la pratique, les individus nouveaux à cette méthode devraient facilement gagner la maîtrise de la méthode de macération acide permettant des estimations fiables et reproductibles des nombres entiers de néphron de rein.

Commencez par utiliser de fins ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale de la souris le long de la ligne médiane. Déplacez soigneusement les intestins et l’adipeux reproducteur sur le côté droit de l’animal. À l’aide d’une dissection grossière, isoler le rein gauche et couper l’artère rénale gauche et la veine pour enlever soigneusement le rein plaçant l’organe dans un bateau de peseuse dûment étiqueté de PBS.

Recueillir le rein droit de la même manière et placer les deux reins sur une gaze chirurgicale pré-humidifié avec PBS. Retirez rapidement tout tissu non rénal adhérent et les capsules rénales. Weightez ensuite chaque rein en enregistrant individuellement le poids de l’organe gauche et droit séparément.

Après pesage, remettre chaque rein dans un bateau de pesage dûment étiqueté sans PBS et utiliser une lame de rasoir propre pour couper chaque organe en deux dans le sens de la longueur. Placer chaque rein à moitié coupé côté vers le bas et couper chaque moitié en deux millimètres ou en petits morceaux. À l’aide de la même lame de rasoir, transférer délicatement les morceaux de rein hachés dans un tube conique de 15 millilitres dûment étiqueté.

Dans un capot de fumée bien ventilé, ajouter cinq millilitres de six acides chlorhydriques molaires à chaque tube. Ensuite, agitez doucement les mélanges d’acide rénal avant de placer les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. À la fin de la macération acide, fixez une aiguille de calibre 18 à une seringue de cinq millilitres par rein et retirez soigneusement les pistons de seringue.

Placez les seringues dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres dans le capot de fumée et versez les solutions rénales dans l’extrémité ouverte de chaque seringue en mettant les tubes vides de côté dans une grille de tube à essai. Remplacez ensuite soigneusement les pistons pour la lente extrusion de chaque solution à travers les aiguilles dans les tubes de 50 millilitres. Lavez les tubes coniques de 15 millilitres avec cinq millilitres de solution PBS par tube tourbillonnant le PBS pour solubiliser tout tissu rénal restant.

Extrudez le contenu du lavage dans le tube approprié de 50 millilitres comme il vient de le démontrer. Après avoir extruder le troisième lavage, équiper chaque seringue d’une aiguille de calibre 21. Extrudez le contenu des tubes de 50 millilitres en un deuxième ensemble de tubes de 50 millilitres à travers le plus petit lavage de l’aiguille de forage et en extrudant trois fois le contenu du premier tube de 50 millilitres avec du PBS frais, comme démontré.

Après le troisième lavage et l’extrusion, porter le volume total dans chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec PBS supplémentaire et placer les tubes dans une grille sur une plaque à bascule à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Dans les cinq jours suivant le traitement, placez une grille contenant 16 sections distinctes au fond de six puits d’une plaque de puits de 12 puits. Inversez doucement les tubes de solution rénale plusieurs fois pour résuspendre les tissus granulés.

Ajouter soigneusement trois aliquots de 500 microlitres de chaque solution homogénéisée par rein à chacun des trois puits de la plaque de puits 12. Diluer le contenu de chaque puits avec un volume égal de PBS. Placez la plaque sur la scène d’un microscope inversé.

Identifiez le glomeruli par leur structure sphérique, leur teinte rougeâtre et les artères pré ou post fixées aux corps du glomeruli individuel. Comptez le nombre de glomeruli par section quadrillée pour résumer le nombre par grille pour le calcul du nombre total de glomeruli par puits. Ensuite, multipliez le nombre de glomeruli par puits fois 100 pour obtenir le nombre moyen de glomeruli par rein.

Dans cette expérience représentative, le nombre total de néphrons chez les souris infusées avec le véhicule pendant 14 jours était d’environ 12 500 néphrons par rein. L’angiotensine deux infusion cependant, a augmenté la pression atriale d’approximativement 40 millimètres de mercure et a été associée à une réduction significative de presque 26% du nombre total de néphron. Dans ce modèle génétique de l’agénésie rénale de rat, les animaux nés avec deux reins ont été calculés pour contenir environ 27.500 néphrons par rein après macération acide comme démontré, alors que les rats nés avec un rein solitaire se sont trouvés pour avoir des nombres totaux sensiblement inférieurs de néphron.

Les estimations des deux expériences étaient compatibles avec les gammes précédemment rapportées chez les rats. La méthode de macération acide est idéale pour estimer les nombres de néphrons dans les reins entiers, en particulier dans les laboratoires non équipés de techniques plus intensives en main-d’œuvre et de coût prohibitif pour compter les néphrons, tels que la méthode de fractionneur disector ou l’imagerie par résonance magnétique. Cette méthode permet une estimation élevée, efficace et reproductible du nombre entier de néphrons rénaux qui se trouvent à moins de 5 % des nombres déterminés par imagerie par résonance magnétique.

L’évaluation du nombre de néphrons est d’une pertinence clinique, car la réduction du nombre de néphrons a été associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires, comme les maladies rénales chroniques. N’oubliez pas que travailler avec de l’acide chlorhydrique peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent être prises, comme le port de gants, de lunettes de protection et d’un manteau de laboratoire.