Name: Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Découvrez la détection et le sous-typage rapides de Salmonella dans les aliments par séquençage quasi-métagénomique. Cette méthode combine séparation immunomagnétique et amplification pour réduire le temps d'analyse.

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Les auteurs aimeraient remercier Mark Harrison et Gwen Hirsch de l’Université de Georgie pour aimablement la souche bactérienne et autres formes de soutien à cette étude.

1. préparation de l’échantillon
Remarque : Des échantillons d’aliments sont préparés pour pré-enrichissement selon microbiologie laboratoire Guidebook (MLG), du US Department of Agriculture Food Safety et Inspection Service (USDA-FSIS)11 et manuel analyse bactériologique (BAM) de la U.S. Food et Drug Administration (FDA)12.
<ol><li>Placer une portion de 25 g d’échantillon d’aliments tels que le poivre noir, poitrine de poulet, boeuf haché et les germes de luzerne ou un tampon imbibé d’environnement en conditions aseptiques dans un sac de mélangeur de laboratoire stérile avec un filtre intégré. Préparer un tampon imbibé d’environnement de façon aseptique humidifier une éponge avec du bouillon d’enrichissement (Rappaport-Vassiliadis, RV). Ensuite, faites glisser l’écouvillon sur toute surface ou zone prédéterminée et placez-le dans un sac de mélangeur de laboratoire.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58612/58612fig1.jpg"> Figure 1 : aliments représentatifs et les échantillons environnementaux pour la détection de la quasi-métagénomique et sous-typage des Salmonella. Échantillons sont placés dans des sacs stomacher filtre stérile avec bouillon de RV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58612/58612fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2"><li>Bien mélanger chaque 25 g d’échantillon avec 225 mL d’enrichissement RV bouillon à l’aide d’un massage de main ou mélangeur de laboratoire pendant 30 s. Remarque : Les variantes de bouillon RV tel que recommandé par MLG et BAM peuvent être utilisés selon les types d’échantillons.</li>
	<li>Incuber le mélange de bouillon d’enrichissement de l’échantillon dans un incubateur de laboratoire à 42 ° C pendant 4 à 24 h.</li>
	<li>Après incubation, recueillir un sous-échantillon de 50 mL de bouillon d’enrichissement du côté filtrée du sac dans un tube à centrifuger séparé de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 100 x g pendant 10 min enlever les débris solides dans l’homogénat.</li>
	<li>Récupérer le surnageant avec soin pour centrifuger de 50 mL nouveau tube et centrifuger les tubes à 3 000 – 6 000 x g pendant 10 min récupérer le culot cellulaire.</li>
	<li>(Facultatif) Jeter le surnageant et le culot de lavage par remise en suspension dans 5 mL de l’eau peptonée tamponnée (EPT) et centrifuger les tubes à 3 000 – 6 000 × g pendant 10 min. NOTE : BPW peut préparer en dissoudre 10 g de peptone, 5 g de chlorure de sodium, 3,5 g de disodium phosphate, et 1,5 g de phosphate monopotassique dans 1 L d’eau distillée. Le pH final doit être ajusté à 7,2 ± 0,2 à 25 ° C. À l’autoclave à 121 ° c pendant 15 min. BPW disponible dans le commerce peut également être utilisé.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans 5 mL d’EPT.</li>
</ol>2. Immunomagnetic Separation (IMS) et multiples déplacements Amplification (MDA)
Remarque : Pour éviter la contamination croisée entre les échantillons, travailler dans une cabinet de biosécurité, changer les pointes de pipette pour chaque tube, évitez de toucher le tube avec la pipette et ne pas placer tubes rapprochés sur support magnétique au cours de l’étape de lavage.
<ol><li>Décongeler à l’avance la solution tampon et le tampon de la réaction de la trousse MDA sur glace ou à 4 ° C.</li>
	<li>Mélanger 1 mL de remises en suspension cellulaire de granule dans BPW avec 20 μL d’anti - perles deSalmonella dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et placez-le sur le mélangeur rotatif pendant 30 min à température ambiante. NOTE : Flore compétitive, particules de graisse et de protéines dans l’extrait concentré peuvent interférer avec IMS. Dilution des remises en suspension culot dans BPW est utile pour réduire la perte des perle -Salmonella complexes du support magnétique au cours d’étapes de lavage.</li>
	<li>Insérer les tubes dans le support magnétique et laisser 3 min pour la récupération correcte des perles en retournant la grille plusieurs fois à concentrer les perles dans une boulette sur le côté du tube.</li>
	<li>Garder les lampes sur le support magnétique. Aspirer et jeter le surnageant de chaque tube, ainsi que le liquide restant dans capuchon de chaque tube. Remarque : Veillez à ne pas déranger le culot de perles d’IMS sur la paroi du tube contre l’aimant.</li>
	<li>Retirez le porte-tube du support magnétique et ajouter 1 mL de tampon de lavage (PBS contenant 0,05 % (v/v), polysorbate 20) et inverser plusieurs fois pour éliminer les non spécifiquement les bactéries de liaison du complexe.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,3 – 2,5 deux fois.</li>
	<li>Après le lavage 3rd , effectuer la séparation magnétique finale des perles en répétant les étapes 2,3 à 2,4. Retirer les tubes de support magnétique et placez-les dans un microtube pour 1 s pour filer vers le bas de perles. Ensuite, placer les tubes dans la grille magnétique pendant 3 min avant de retirer n’importe quel tampon de lavage résiduelle.</li>
	<li>Remettre en suspension lesSalmonella complexes de perle - en 9 μL de tampon et incuber à 95 ° C pendant 3 min pour dénaturation.</li>
	<li>Après refroidissement à 4 ° C sur la glace, combiner avec 9 μL de tampon de réaction plus 1 μl d’enzyme mélanger et garder sur la glace.</li>
	<li>Dans un thermocycleur, incuber les tubes à 30 ° C pendant 2 h pour l’amplification, suivie par chauffage à 65 ° C pendant 10 min pour inactiver les enzymes et refroidir à 4 ° C sur la glace.</li>
	<li>Évaluer la quantité et la qualité des produits MDA en mesurant la concentration d’ADN et de la pureté (260/280 ratio &gt; 1.8) sur un instrument de fluorospectromètre. Remarque : En raison de la liaison non spécifique des perles de l’IMS, l’ADN génomique d’organismes autres que les salmonelles est susceptible d’être présents dans les produits MDA, mais elle n’affecte pas l’analyse en aval.</li>
	<li>Stocker les produits finis (20 μL) à-20 ° C jusqu'à l’utilisation de la PCR en temps réel et/ou préparation de bibliothèque pour l’ordonnancement de la quasimetagenomics.</li>
</ol>3. Real-time PCR
Remarque : Cette étape est facultative pour la détection des salmonelles sans le sous-typage, 1) et 2) évaluer la qualité de l’échantillon avant le séquençage de le quasimetagenomics.
<ol><li>Préparer 18 μL de mélange PCR par échantillon, contenant universel PCR Master Mix (10 μL), avant l’apprêt (2 μL, 900 nM), inverser l’apprêt (2 μL, 900 nM), sonde (2 μL, 250 nM) et l’eau de qualité moléculaires (2 μL). Remarque : Salmonella-amorces oligonucléotidiques spécifiques (vers l’avant : CTCACCAGGAGATTACAACATGG, inverse : AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) et la sonde sont conçues pour amplifier une séquence 94-PB du gène ttr (GenBank accession no. AF 282268)13.</li>
	<li>Mélanger le produit de la MDA de l’étape 2.12 par pipetage doucement et descendre perleSalmonella complexes ainsi que du liquide pour créer une suspension. Ajouter 2 μl de la suspension dans 18 μL de mélange PCR.</li>
	<li>Exécuter une PCR en temps réel en utilisant un protocole optimisé de la PCR en temps réel, en spécifiant deux périodes de détention, une à 50 ° C pendant 2 min et l’autre à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 60 s.</li>
	<li>Calculer le cycle seuil (Ct), qui est le nombre de cycles requis pour la fluorescence de l’ADN amplifié de franchir la ligne de seuil. Remarque : La ligne de seuil se trouve dans la phase linéaire entre la ligne de base et du plateau des parcelles amplification des échantillons. Résultats négatifs correspondent aux valeurs de Ct sur 40 ou échantillons avec des valeurs de Ct plus élevées que celle du témoin négatif.</li>
</ol>4. Bibliothèque préparation pour l’ordonnancement de la Quasimetagenomic
Remarque : Les produits MDA peuvent être séquencés par les deux courtes lire et bien lire (nanopore) plateformes de séquençage. Utilisez la dernière version de trousses de préparation ADN bibliothèque fournies par les fabricants des plateformes de séquençage. Effectuer la préparation de bibliothèque d’ADN conformément aux instructions des fabricants. Utiliser le protocole d’ADN génomique 2D low input pour la préparation de la bibliothèque pour le séquençage de long lire plateforme5. Pour préparation de bibliothèque pour la plate-forme de séquençage court à lire, des modifications mineures au protocole du fabricant sont fournies ci-dessous.
<ol><li>Suivre les méthodes de préparation de bibliothèque standard en ajoutant des solutions tampons et réactifs aux produits MDA. Transférer 40 μL des produits MDA séquençage préparé à une nouvelle plaque et ajouter 20 μL de perles de PCR purification dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber les plaques à température ambiante pendant 10 min sans agitation.</li>
	<li>Laver les billes avec 80 % d’éthanol et sécher les perles pendant 12 min.</li>
	<li>Une nouvelle suspension perles séchées dans 53 μL de tampon de resuspension et incuber pendant 2 min sans agiter.</li>
	<li>Diluer et bibliothèques en suivant les instructions du fabricant de la piscine. Remarque : Un 22:00 mis en commun et bibliothèque dénaturé est maintenant prêt à être séquencé.</li>
</ol>

<ol><li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li>
<li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety%3A+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li>
<li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Level+Discrimination+of+Shiga+Toxin-Producing+Escherichia+coli+in+Spinach+Using+Metagenomic+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing.</a> PLoS One. 11 (12), e0167870(2016).</li>
<li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li>
<li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li>
<li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+to+prepare+samples+of+leafy+green+vegetables+for+preenrichment+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual+Salmonella+culture+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method.</a> Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).</li>
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<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+subtyping+methods+against+a+whole-genome-sequencing+standard+for+Salmonella+enterica+serotype+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).</li>
<li>Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook">https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook</a> (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella. , Available from:
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<li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li>
<li>June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+from+raw+flesh+and+other+highly+contaminated+foods%3A+precollaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study.</a> Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).</li>
<li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46(2014).</li>
<li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="https://peerj.com/articles/cs-20/?utm_source=TrendMD&utm_campaign=PeerJ_TrendMD_0&utm_medium=TrendMD">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li>
<li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864(2009).</li>
<li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+%28VBNC%29+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

En raison du souvent faible abondance et homogène en présence de Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux, enrichissement de la culture avant IMS-MDA est encore nécessaire pour la détection de Salmonella et de sous-typage ; C’est donc une étape cruciale du protocole. Pour identifier les conditions optimales d’augmenter l’abondance des salmonelles par rapport à la flore fond échantillon, milieux d’enrichissement différents peut-être être évaluées pour des exemples spécif...

Séquençage métagénomique permet théoriquement concertée de détection et de sous-typage des pathogènes d’origine alimentaire. Cependant, des échantillons d’aliments présentent des défis pour l’analyse de l’agent pathogène par séquençage direct du microbiome alimentaire. Tout d’abord, pathogènes d’origine alimentaire sont souvent présents à de faibles concentrations dans les échantillons d’aliments. La plupart des méthodes de détection rapide disponible dans le commerce encore exigent 8 à 48 h de culture afin d’enrichir les cellules pathogènes à un niveau détectable1. Deuxièmement, beaucoup d’aliments contiennent des cellules de microflore abondante et/ou aliments ADN, faisant ADN du pathogène d’origine alimentaire une petite fraction des aliments métagénome et une cible insaisissable pour la détection et le typage métagénomique séquençage directement.
Modification des aliments microbiomes a signalé afin de permettre une concentration importante de pathogènes d’origine alimentaire ADN afin de faciliter la détection basée sur le séquençage des Escherichia coliproductrices de toxine Shiga2,3 et Salmonella enterica4. Parce que les aliments modifiés microbiomes sont toujours des mélanges de différentes espèces microbiennes, leur séquençage est nommé comme quasi-métagénomique analyse4. Microbiome modification peut être effectuée par la culture enrichissement seuls2,3 , ou en combinaison avec séparation immunomagnétique (IMS) et de multiples déplacements amplification (MDA)4,5. IMS peut capturer sélectivement les cellules pathogènes de la culture d’enrichissement par l’intermédiaire de billes magnétiques revêtus d’anticorps. MDA peut produire une quantité suffisante d’ADN génomique pour l’ordonnancement par le biais de l' ADN polymérase de ɸ29 très efficace6. IMS-MDA a permis la détection des pathogènes indépendants de la culture des échantillons cliniques7et le raccourcissement de l’enrichissement de la culture pour la détection de quasi-métagénomique et sous-typage des salmonelles dans les échantillons de nourriture4.
L’objectif général de cette méthode est de préparer la quasi-métagénomiques ADN provenant d’échantillons de nourriture pour permettre la concentration ciblée de l’ADN génomique de Salmonella et de détection ultérieure et de sous-typage du contaminant Salmonella par séquençage. Par rapport aux méthodes standards pour la détection de Salmonella 8,9 et sous-typage de10, l’approche de quasimetagenomic peut raccourcir considérablement le temps d’immobilisation des aliments contaminés et les échantillons environnementaux sous-types moléculaires de l’agent pathogène en unifiant les deux généralement séparés des analyses dans un seul flux de travail. Cette méthode est particulièrement utile pour des applications telles que la riposte aux flambées épidémiques d’origine alimentaire et d’autres investigations arrière de trace où le sous-typage pathogène robuste est nécessaire en plus de la détection des pathogènes et rapide revirement analytique est important.

<table><tbody><tr><td>Sac mélangeur de laboratoire avec filtre</td><td>VWR</td><td>10048-886</td><td></td></tr><tr><td>Eau peptonée tamponnée</td><td>Oxoid Micorbiology Products</td><td>CM0509</td><td></td></tr><tr><td>Rappaport Vassiliadis broth</td><td>Neogen Acumedia</td><td>7730A</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20&nbsp ;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Mélangeur Stomacher</td><td>Seward&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30010108 Centrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>75005194</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Techne Prime</td><td>EW-93945-13</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur StepOne Real-Time</td><td>Applied Biosystems</td><td>4.76357</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>billes de purification PCR ; bien mélanger avant utilisation ; Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nextera XT kit de préparation de bibliothèque</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Stocker à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>MinIon kit de préparation de bibliothèque</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK108</td><td>Stocker à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dynabead Perles anti-Salmonella</td><td>Applied Biosystems</td><td>71002</td><td>Vortex bien avant utilisation</td></tr><tr><td>Illustra GenomiPhi V2 Kit d’amplification de l’ADN (kit MDA) -Tampon d’échantillon -Tampon de réaction -Mélange d’enzymes</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-30</td><td>Stocker à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>HulaMixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag support magnétique</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR mastermix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td>Bien mélanger avant utilisation ; conserver à 4 & deg ; </td></tr><tr><td>C Microfuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr></tbody></table>

quasi-métagénomique analyse des salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-métagénomique séquençage se réfère à l’analyse basée sur le séquençage de mis à jour le microbiomes des aliments et les échantillons environnementaux. Dans ce protocole, microbiome modification vise à concentrer l’ADN génomique d’un contaminant de pathogènes d’origine alimentaire cible afin de faciliter la détection et le typage de l’agent pathogène dans un seul flux de travail. Ici, nous expliquer et démontrer les étapes de préparation d’échantillon pour l’analyse de quasi-métagénomique de Salmonella enterica de nourriture représentatif et les échantillons environnementaux, y compris les germes de luzerne, de poivre noir moulu, boeuf haché, poitrine de poulet et les échantillons environnementaux. Les échantillons sont d’abord soumis à l’enrichissement de la culture de Salmonella pour une durée raccourcie et réglable (4 à 24 h). Cellules de Salmonella sont ensuite sélectivement capturés dans la culture d’enrichissement par séparation immunomagnétique (IMS). Enfin, plusieurs amplification de déplacement (MDA) est effectuée afin d’amplifier l’ADN de cellules IMS-capturé. La sortie de l’ADN du présent protocole peut être séquencée par des plateformes de séquençage à haut débit. Une analyse PCR quantitative en option peut être effectuée pour remplacer le séquençage pour la détection de Salmonella ou évaluer la concentration de Salmonella ADN avant de séquençage.

Avant quasimetagenomic le séquençage, la quantité globale et la pureté des produits IMS-MDA peuvent être évaluées par la fluorospectromètre (tableau 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Temps de l’enrichissement (h)</td>
			<td>Valeur de CT</td>
			<td>Concentration (ng/ul)</td>
			<td>Pureté (260/280)</td>
		</tr>
...

Nous présentons ici un protocole pour préparer des échantillons d’ADN provenant des aliments et environnement microbiomes détection concertée et sous-typage des Salmonella par séquençage de quasimetagenomic. L’utilisation combinée de l’enrichissement de la culture, séparation immunomagnétique (IMS) et le déplacement de plusieurs amplification (MDA) permet une concentration efficace de l’ADN génomique de Salmonella provenant des aliments et les échantillons environnementaux.

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Cette méthode peut être utilisée pour détecter Salmonella à partir d’échantillons d’aliments et identifier l’agent pathogène au niveau de la souche grâce à la prise d’empreintes génétiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la détection et le sous-dypage de Salmonella en un seul flux de travail et réduit considérablement le délai d’exécution de l’échantillon d’aliments contaminés par Salmonella à l’empreinte digitale de l’agent pathogène. Pour commencer, placez de façon aseptique un échantillon de 25 grammes d’aliments à l’intérieur d’un sac de mélangeur de laboratoire stérile avec un filtre intégré ou préparez en option un écouvillon environnemental en humidissant aseptiquement une éponge avec du bouillon d’enrichissement, en la faisant glisser sur une surface prédéterminée et en la plaçant à l’intérieur d’un sac de mélangeur.À l’aide d’un mélangeur de laboratoire, bien mélanger chaque échantillon avec 225 millilitres de bouillon d’enrichissement rv. Puis incuber le mélange à 42 degrés Celsius pendant quatre à 21 heures. Après cela, recueillir un sous-échantillon de 50 millilitres de bouillon d’enrichissement du côté filtré du sac.Puis centrifuger le sou

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Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble...

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l'antigène O et la flagelline d'un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l'apparence des amplicons spécifiques de taille, (produit de PCR) correspondant à l'allèle cible.

Une PCR pour l&#39;identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

Salmonella spp /Shigella spp sont pathogènes courants attribués à la diarrhée. Ici, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de  l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

L'immunoprécipitation de chromatine couplée au séquençage de prochaine génération (ChIP-seq) est une méthode employée pour établir des interactions entre des facteurs de transcription et les séquences génomiques qu'ils contrôlent. Ce protocole décrit les techniques d'exécution du ChIP-seq avec des biofilms bactériens, en utilisant Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bactérien à titre d'exemple.

Découverte des cibles réglementaires de csgD dans le biofilm de Salmonella utilisant l'immunoprécipitation de chromatine et le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

L’amplification isothermale à base de boucle (LAMP) est un test isothermal d’amplification de l’acide nucléique (iNAAT) qui a suscité un grand intérêt dans le domaine de la détection des pathogènes. Ici, nous présentons un protocole Salmonella LAMP validé en laboratoire comme une méthode rapide, fiable et robuste pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de salmonella présumée de l’isolement culturel.

Amplification isothermale à médiatographie en boucle pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de Salmonella de l’isolement culturel

Cette plate-forme informatique analytique fournit des conseils pratiques aux microbiologistes, aux écologistes et aux épidémiologistes intéressés par la génomique des populations bactériennes. Plus précisément, les travaux présentés ici ont démontré comment effectuer: i) une cartographie guidée par la phylogénie des génotypes hiérarchiques; ii) l’analyse des génotypes fondée sur la fréquence; iii) analyses de la parenté et de la clonalité; iv) l’identification des loci accessoires différenciant...

Exploration heuristique des génotypes hiérarchiques et des loci du génome accessoire dans les populations bactériennes

Salmonella envahit et se réplique à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales à la fois dans les vacuoles spécifiques de Salmonella et libres dans le cytosol (hyper-réplication). Un protocole basé sur la microscopie à fluorescence à haut débit est décrit ici pour quantifier les phénotypes intracellulaires de Salmonella par deux analyses d’images complémentaires via ImageJ, atteignant une résolution et un score unicellulaires.

Analyse automatisée des phénotypes intracellulaires de Salmonella à l’aide d’ImageJ

La faisabilité de stratégies de séquençage du génome entier (SGE) à l’aide d’instruments de paillasse a simplifié l’interrogation du génome de chaque microbe pertinent pour la santé publique en laboratoire. Une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquençage bactérien est décrite et un pipeline bioinformatique pour l’analyse est également présenté.

Caractérisation d’une souche pathogène d’Escherichia coli dérivée d’Oreochromis spp. Fermes utilisant le séquençage du génome entier

Découvrez la détection et le sous-typage rapides de Salmonella dans les aliments par séquençage quasi-métagénomique. Cette méthode combine séparation immunomagnétique et amplification pour réduire le temps d'analyse.

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

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