Microscopie 4D de levure

Cette méthode suit les structures des cellules de levure en trois dimensions pendant de nombreuses minutes, ce qui nous permet d’étudier la dynamique des organites et compartiments intracellulaires. L’imagerie 4D nous permet de tirer des conclusions fiables sur la dynamique intracellulaire, en particulier pour les structures ou les marqueurs qui peuvent être transitoires. La démonstration de la procédure sera Natalie Johnson, un postdoc de mon laboratoire.

Commencez par cultiver une culture nocturne de la souche de levure d’intérêt dans cinq millilitres de synthétique non fluorescent défini, ou NSD, moyen, dans un flacon déconcerté de 15 millilitres avec une bonne aération, à 23 degrés Celsius. Trois à quatre heures avant l’analyse, diluer la culture de levure de phase logarithmique dans le milieu NSD frais, de sorte que la densité optique finale à 600 nanomètres, ou OD600, sera de 0,5 à 0,8 au moment de l’imagerie. Au moins une heure avant que la culture soit prête, centrifugez un aliquot d’un concanavalin de deux millilitres par millilitre Une solution pendant cinq minutes à pleine vitesse, pour granuler tous les particules, et ajouter 250 microlitres du supernatant dans un plat propre de microscopie de fond de verre de 35 millimètres.

Après 15 minutes, laver le plat deux à trois fois avec deux millilitres d’eau distillée par lavage, en ajoutant 250 microlitres de la culture de levure au plat enduit de Concanavalin après qu’il soit séché. Attendez 10 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer, avant de laver doucement le plat deux à trois fois de plus avec deux millilitres de milieu NSD frais. Couvrez ensuite les cellules de deux millilitres de NSD frais.

Pour imager les cellules de levure, sélectionnez une lentille d’immersion d’huile 63X avec une ouverture numérique d’au moins 1,4 sur un microscope à lumière confoccale. Ici, un objectif 100X peut également être utilisé au lieu d’un objectif 63X. Ensuite, placez le plat sur la lentille objective, repéré avec de l’huile d’immersion.

Dans le menu dropdown de l’onglet Mode Acquisition, sélectionnez xyzt. Sous l’onglet XY, formater la taille du cadre à 256 largeur par 128 hauteur. Utilisez la vitesse maximale de balayage, qui est généralement de l’ordre de huit kilohertz.

Activez la numérisation bidirectionnelle X si elle est disponible, et ajustez le facteur de zoom à neuf, ce qui se traduira par une taille de pixel d’environ 80 nanomètres. Si un objectif 100X est utilisé, ajustez le facteur de zoom en conséquence pour maintenir une taille de pixel d’environ 80 nanomètres. Réglez ensuite l’accumulation de ligne à quatre ou six.

Réglez le sténopé à 1,2 unités Airy, et allumez le laser de lumière blanche, si disponible. Réglez ensuite la longueur d’onde d’excitation et la puissance laser en pourcentage pour chaque canal de fluorescence. Si disponible, activer l’utilisation du mode de comptage des photons sous l’onglet configuration en désélectionnant le temps d’intégration maximum.

Pour chaque canal de fluorescence, assignez un détecteur de haute sensibilité, réglez la plage de longueur d’onde des émissions et activez le mode de comptage des photons, s’il est disponible. Réglez la fenêtre de gouttillon de temps à 0,6 à 10 nanosecondes pour chaque canal de fluorescence, pour éviter de capturer la lumière réfléchie du plat en verre. Ensuite, activez l’imagerie par champ lumineux et sélectionnez un détecteur de faible sensibilité pour la collecte de données.

Activez le mode d’imagerie en direct et activez le gain dans le canal de champ lumineux jusqu’à ce que les cellules soient clairement visibles. Si vous êtes en mode comptage photon, modifiez la plage de valeurs grises du manuel à l’automatique pour afficher le signal fluorescent. Réglez la pile Z pour l’image de l’ensemble du volume des cellules de levure et spécifiez la directionnalité de l’imagerie de telle sorte que vers le bas se déplace vers le glissement de couverture.

Réglez l’intervalle z-step à 0,25 à 0,35 micromètres pour obtenir environ 20 à 25 sections optiques par pile Z, et allumez le flux Galvo s’il est disponible. Pour un film typique, réglez l’intervalle de temps entre z-stacks à deux secondes, et réglez la durée du film à cinq à 10 minutes. Ensuite, enregistrez le film sous forme de fichier LIF.

Pour la déconvolution des films, lancez un logiciel de déconvolution approprié qui utilise l’algorithme classique d’estimation maximale de probabilité et ouvrez la série de données. Sélectionnez l’assistant de déconvolution et l’éditeur de paramètres pour confirmer que les paramètres d’imagerie sont détectés et correctement affichés. Modifiez la valeur de l’indice réfractif moyen d’intégration à 1,4 pour rapprocher le cytoplasme de levure.

Utilisez ensuite l’éditeur pour estimer la position du bordereau de couverture. Sélectionnez Définir tous vérifiés et cliquez sur Accepter, et sélectionnez Saisir l’assistant. Cliquez sur la flèche suivante pour contourner la sélection des fonctions de propagation de point et les étapes de pré-traitement de recadrage, et passez par l’assistant de déconvolution pour chaque canal de fluorescence.

Sélectionnez la fonction de cartographie verticale logarithmique de calcul et inspectez le profil d’intensité de fluorescence des données brutes. Définissez le manuel comme mode pour l’estimation d’arrière-plan, entrez une valeur d’arrière-plan et cliquez sur Accepter. Laissez la valeur maximale des itérations à 40 et entrez un rapport signal/bruit estimé.

Ensuite, éteignez la correction d’eau de Javel, et cliquez sur Deconvolve. Sélectionnez Accepter le canal suivant dans la fenêtre de résultat de déconvolution, si le bruit est suffisamment enlevé sans éliminer la fluorescence authentique des structures sombres. Une fois que tous les canaux fluorescents ont été déconstructurés de manière satisfaisante, cliquez sur Tout fait et arrangez d’abord le canal rouge, suivi des canaux verts, bleus et lumineux, pour un montage ultérieur dans ImageJ.

Enregistrez ensuite la séquence d’image sous forme de fichier TIF de huit bits et sélectionnez un fichier par canal et un étirement de contraste comme mode de conversion. Pour la correction de l’eau de Javel, importez les séquences d’images déconcentrales en ImageJ et cliquez sur Image, Hyperstacks et Stack en Hyperstack pour convertir les images en hyperstack. Sélectionnez xyzct dans le menu dropdown et entrez le nombre de canaux, de tranches Z-stack et de délais.

Pour corriger les canaux de fluorescence pour le blanchiment photo, sélectionnez Image, Couleur, Canaux fractionnants, et pour les canaux fluorescents, sélectionnez Plugins, EMBLtools, Bleach Correction et Exponential Fit. Sélectionnez ensuite les canaux image, couleur et fusion pour fusionner le champ lumineux et les canaux de fluorescence corrigés à l’eau de Javel en hyperstack, et enregistrer l’hyperstack corrigé déconcentré et blanchi pour la génération et le montage de films suivants sous forme de fichier TIF de huit bits. Pour convertir l’ensemble de données corrigées déconcentrales et blanchies en montage à l’échelle, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Make Montage Series, et sélectionnez l’hyperstack de huit bits pertinent.

Cliquez sur Ouvrir et OK pour accepter que toutes les tranches seront utilisées pour créer le montage, et cliquez à nouveau sur OK pour accepter la valeur suggérée du facteur d’échelle. Enregistrez le montage original sous forme de fichier TIF de huit bits et sélectionnez Plugins, IJ_Plugins, Montage Series à Hyperstack et OK, pour créer une hyperstack 4D à partir du montage original qui inclut tous les délais. Pour générer le film projeté moyen d’origine, sélectionnez d’abord Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack et OK, pour accepter les paramètres par défaut ZProjection.

Enregistrez le film projeté en moyenne sous la forme d’un fichier TIF de huit bits et inspectez le film pour identifier les structures individuelles qui peuvent être suivies pendant toute la durée de leur période d’étiquetage. L’identification d’une structure qui peut être suivie de manière fiable pendant toute la durée du film, et l’isolement de cette structure pour analyse, sont les étapes les plus critiques de la procédure. Suivez ensuite les instructions dans le guide utilisateur plugin, pour isoler les structures d’intérêt en éditant le montage.

Créez une hyperstack 4D à partir du montage édité pour la période, y compris les structures d’intérêt, et enregistrez l’hyperstack édité. Pour quantifier l’intensité de fluorescence au fil du temps pour la structure isolée de l’hyperstack 4D édité, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Analysez le film édité, entrez l’intervalle de temps entre les piles Z et cliquez sur OK. Pour créer un film final de la structure isolée, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Project Hyperstack, spécifiez les tranches Z-stack qui doivent être incluses, sélectionnez Intensité moyenne comme type de projection et cliquez sur OK. Pour créer une hyperstack 4D avec les données d’origine sur les données modifiées, sélectionnez plugins, IJ_Plugins, Fusionnez deux hyperstacks et placez-les d’abord au-dessus de la deuxième place. Pour générer un film à partir de l’hyperstack 4D avec les données d’origine sur les données modifiées, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Project Hyperstack, spécifiez les tranches Z-stack qui doivent être incluses, sélectionnez Intensité moyenne comme type de projection et cliquez sur OK. Ici, la première image d’une projection z-stack de données brutes peut être comparée aux mêmes données décontrales et corrigées de l’eau de Javel.

Ces images du même film déconseillé et corrigé à l’eau de Javel montrent deux cisternae qui ont été analysées, qui d’abord l’étiquette avec la protéine verte de glycosylation de résistance de Vanadate 4 ou le marqueur de Vrg4, et plus tard avec le marqueur rouge de protéine de transport de gène de Sécrétion 7 ou sec7. Ce montage, créé à partir d’une hyperstack déconseillée et corrigée à l’eau de Javel, montre toutes les sections optiques à un seul moment avant et après l’édition, pour permettre l’isolement du signal de l’une des cisternae choisies. Dans ce chiffre, plusieurs images du film final des piles Z projetées sont montrées avec les projections originales en haut de la figure et des projections éditées en bas.

Quantification des signaux fluorescents verts et rouges de la cisternae Golgi choisie révèle que le marqueur vert Vrg4 arrive et persiste pendant environ 80 secondes, après quoi, le marqueur rouge Sec7 arrive et persiste pendant environ 60 secondes, avec un bref chevauchement entre les deux marqueurs. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’identifier les structures qui peuvent être suivies sans ambiguïté tout au long de leur vie. Le même type d’analyse peut être effectué après avoir fait une mutation ou un autre type de perturbation spécifique.

Cette technique a ouvert la voie à l’étude du comportement dynamique des citernes Golgi et des sites de sortie de réticulum endoplasmique utilisant la levure comme système modèle.