Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines lymphatiques et hépatiques, tels que la façon dont les cellules endothéliales lymphatiques, ou LEC, répondent à des stimuli spécifiques et comment cela contribue à la pathogénie de la maladie. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer le phénotype et la fonction des cellules endothéliales lymphatiques hépatiques sur une base par cellule, et peut être utilisé pour des applications en cours d’eau après le tri cellulaire. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la biologie lymphatique du foie, elle peut également être utilisée pour évaluer les cellules endothéliales lymphatiques de différents tissus, tels que la peau et la glande mammaire.

Jeffrey Finlon, assistant de recherche professionnel de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour préparer une suspension à cellule unique à partir de cellules hépatiques isolées, commencez par pulvériser la souris avec soixante-dix pour cent d’éthanol, et en sécurisant les pattes à un tableau de dissection. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper la peau à environ un centimètre au-dessus de l’anus et utilisez des forceps denté pour soulever la peau loin du corps.

Insérez les pointes de ciseaux entre la peau et le péritoine et ouvrez les ciseaux pour séparer les tissus avant de poursuivre l’incision cutanée jusqu’au cou. Fixez la peau à la planche de dissection sous chaque membre antérieur et au-dessus de chaque limite postérieure, et tirez le sac péritonéal vers le haut pour étendre l’incision vers le cou. Saisir les lobes du foie et couper juste en dessous du sternum pour permettre la dissection autour du foie.

Ensuite, transférez l’organe en quatre millilitres du milieu EHAA de Click. Utilisez le scalpel pour couper le foie en morceaux d’environ un millimètre de diamètre et digérer les morceaux en cinq cents microlitres de solution de digestion fraîchement préparée et cinq cents microlitres de DNase 1. Après quinze minutes à trente-sept degrés Celsius, utiliser un tuyau de cinq cents millilitres pour bien mélanger les tissus et retourner le récipient à l’incubateur pendant encore quinze minutes.

À la fin de l’incubation, transférer l’échantillon digéré à travers une passoire de cent microns dans un tube conique de cinquante millilitres et utiliser le piston à partir d’une seringue d’un millilitre pour presser doucement les morceaux de tissu restants à travers le maillage. Lavez le filtre avec cinq millilitres de tampon d’isolement et appuyez doucement sur tout tissu restant à travers la passoire. Recueillir les cellules hépatiques isolées par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en quatre millilitres de tampon de lyse des globules rouges.

Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules en dix millilitres de tampon d’isolement et compter les cellules sur l’hémocytomètre pour déterminer le nombre total de foies. Suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres d’iodixanol de vingt pour cent et superposer la suspension cellulaire avec un millilitre de PBS. Séparez les cellules par séparation du gradient de densité et récoltez la couche entre le PBS et l’iodixanol.

Filtrez ensuite les cellules à travers une passoire de cent micromètres dans un nouveau tube conique de cinquante millilitres. Lavez les cellules en dix millilitres de tampon d’isolement frais et suspendez la pastille résultante dans cinq cents microlitres de PBS, complétées par le sérum bovin foetal de deux pour cent, ou FBS. Après comptage, aliquot environ cinq fois dix à la sixième cellules non parenchymales dans chaque puits de contrôle et expérimental d’une plaque de puits de quatre-vingt-dix-six pour centrifugation et de suspendre à nouveau les granulés dans quatre-vingt-dix microlitres de PBS plus FBS par puits.

Ajoutez les cocktails d’anticorps primaires expérimentaux et de contrôle appropriés à chaque puits et entacher tous les puits avec un marqueur de viabilité approprié. L’étape la plus importante de cette procédure est la titration appropriée des anticorps et l’utilisation de contrôles de type glace et de contrôles de fluorescence-1 pour valider la coloration. Après trente minutes à quatre degrés Celsius, centrifugeuse laver les cellules avec une centaine de microlitres de PBS plus FBS par puits et transférer les cellules de chaque puits dans des tubes individuels de cytométrie à fond rond de cinq millilitres à un volume final de quatre cents microlitres de PBS plus FBS par tube.

Ensuite, utilisez un petit volume de cellules pour régler le laser et les paramètres de compensation sur le cytomètre d’écoulement et lire tous les événements pour chaque tube. Lorsque tous les tubes ont été lus, importez les données dans un programme approprié d’analyse de cytométrie de débit. Porte sur les cellules vivantes en fonction du colorant marqueur de viabilité où l’expression négative est considérée comme vivante.

Porte sur les cellules vivantes en fonction de la taille et de la granularité des cellules ainsi que de leur expression de colorant marqueur de viabilité, suivie d’un gating sur la population de cellules CD31 négatives CD31 en utilisant les données appropriées sur le contrôle de l’isotype et la fluorescence-1 pour déterminer les populations positives et négatives. Ensuite, portez les cellules cd31 négatives CD45 positives selon leur CD16/32 et l’expression podoplanine pour permettre l’identification du CD31 négatif CD45 positif, CD16/32 négatif podoplanine positive lymphatic endothelial, et CD45 négatif CD31 positif, CD16/32 positif podoplanin négatif foie sinusoïdien populations de cellules endotheliales. Les cellules endothéliales emphatiques expriment le vaisseau lymphatique et l’hyaluronan endothélial, mais pas CD146.

Les cellules positives CD16/32 positives isolées par CD31 isolées comme démontré sont également cd146 positives et podoplanin positives, tandis que les cellules négatives CD16/32 positives cd31 sont principalement négatives cd146 et soit podoplanine positives ou négatives. La positivité a été déterminée basée sur la coloration de fluorescence-1. Les cellules endothéliales lymphatiques hépatiques sont négatives cd146 et PDPN positives.

Ni l’endothélium vasculaire ni les macrophages hépatiques murins n’expriment la podoplanine. La coloration à la podoplanine peut également être utilisée pour distinguer les cholangiocytes des vaisseaux lymphatiques en fonction des structures nucléaires distinctes des canaux biliaires ainsi que de la coloration de la cytokératine 7. Comme seules les cellules endothéliales lymphatiques co-expriment le récepteur vasculaire du facteur de croissance endothéliale 3 et la protéine Prospero homeobox 1 dans le foie, ces marqueurs peuvent être utilisés pour confirmer la pureté de la population de cellules endothéliales lymphatiques du foie triés.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement et de garder les cellules sur la glace. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le tri des débits des populations de LEC peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, telles que le profilage transcriptionnel des LEC. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie lymphatique spécifique au foie pour explorer l’impact lymphatique des maladies hépatiques chez les souris et les humains.

Généralement, les individus nouveaux à cette méthode lutteront parce que les cellules endothéliales lymphatiques sont une population peu fréquente et graduelle dans un foie et la méthode doit être exécutée rapidement.