Haute résolution Patterned Biofilm dépôts en utilisant pDawn-Ag43

Nous avons mis au point une méthode appelée lithographie biofilm pour faire briller la lumière sur une surface, et les bactéries s’accumulent là où se trouve la lumière. Cette méthode nous permettra de répondre à la question clé de la recherche sur les biofilms, par exemple, comment les structures spatiales affectent les fonctions communautaires. Cette méthode présente de nombreux avantages.

Par exemple, il fonctionne à très haute résolution de 25 micromètres, il ne nécessite pas de pré-modelage de surface, et fonctionne également à l’intérieur des dispositifs fluides fermés. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la relation structure-fonction des biofilms naturels, elle peut également être appliquée à d’autres disciplines, telles que l’ingénierie des biofilms, les biomatériaux et la biologie synthétique multicellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il y a des étapes préliminaires clés pour préparer la configuration de culture optique et l’échantillon bactérien avant le modelage de biofilm.

Tout d’abord, transformer le plasmide pDawn-Ag43 en souche d’intérêt E.coli, et plaquer sur une plaque d’agar LB complétée par de la spectinomycine. Inoculer une seule colonie dans le bouillon LB avec de la spectinomycine dans un tube de culture, et le faire pousser à une phase exponentielle dans un incubateur secouant à 250 rpm et 37 degrés Celsius. Après l’inoculation, préparer un stock de 25% de glycérol de la souche pDawn-Ag43 transformé en mélangeant un millilitre de glycérol stérile à 50% avec un millilitre de culture dans un cryo-tube.

Conserver le bouillon dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius. Ensuite, commencez à préparer la configuration optique en plaçant un projecteur portatif au fond d’un incubateur bactérien avec l’ouverture pointant directement vers le haut au plafond, où la chambre de culture de biofilm sera attachée. Connectez un ordinateur portable via le câble d’affichage au projecteur à l’intérieur de l’incubateur.

Utilisez du ruban adhésif pour fixer un plat de culture factice vide au plafond de l’incubateur. Ajustez l’accent mis sur le projecteur en tournant le bouton de mise au point de sorte que le plan de focalisation coïncide avec la surface inférieure du plat de culture biofilm fixé au plafond de l’incubateur. Le projecteur doit éclairer une image nette et non floue sur le fond du plat de culture.

Retirez le plat de culture factice une fois que la projection a été optimisée. À l’aide d’un logiciel portable, dirigez le projecteur pour éclairer tout le champ de vision avec un éclairage bleu maximum en présentant une diapositive bleue complète. Mesurez l’intensité d’éclairage du projecteur à l’aide d’un compteur de puissance optique en plaçant la tête du photodétecteur au plafond de l’incubateur et en lisant l’intensité du compteur de puissance correspondant calibré en longueur d’onde lumineuse de 460 nanomètres.

Ensuite, ajustez l’intensité de l’éclairage à l’aide d’un filtre de densité neutre réglable placé à l’ouverture du projecteur. Faites pivoter le filtre pour ajuster l’intensité d’éclairage mesurée par le compteur de puissance jusqu’à ce que l’intensité de l’éclairage au centre de la région projetée à lumière bleue se lit 50 microwatts par centimètre carré. Il est important de s’assurer que l’intensité de l’éclairage est réglée à un niveau approprié à l’aide du photodétecteur calibré placé au plafond de l’incubateur.

Cela permet un réglage précis de l’intensité de l’éclairage en tournant le filtre de densité neutre. Dessinez maintenant des motifs arbitraires à l’aide du logiciel de projecteur de présentation sur l’ordinateur portable, et affichez ces motifs sur le plafond de l’incubateur, à l’aide du projecteur. Avant l’illumination, stries d’une souche pDawn-Ag43 du stock de glycérol sur une plaque d’agar LB-plus-spec.

Permettre aux colonies de croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Inoculer une colonie de bactéries pDawn-Ag43 à partir d’une plaque d’agar dans le bouillon LB-plus-spec, et faire croître la culture du jour au lendemain à la phase stationnaire dans un incubateur secouant à 250 rpm et 37 degrés Celsius. Le lendemain, subdilute la culture à un rapport de un à 1000 dans le bouillon LB avec spectinomycine.

Permettre à la culture sous-diluée de croître dans un incubateur secouant à six heures à 250 rpm et 37 degrés Celsius jusqu’à la fin exponentielle, phase stationnaire précoce. Il est important de diluer la culture du jour au lendemain et de passer à la phase exponentielle tardive avant l’illumination. Cela garantit que les bactéries sont fiables en bonne santé et actives lors de l’induction.

Après incubation, subdilute la culture de phase exponentielle tardive à un rapport de un à 100 avec les médias M63 précédemment préparés complétés avec la spectinomycine de 50 microgrammes par millilitre. Ensuite, introduire la dilution dans un plat de culture biofilm. Comme les échantillons sont maintenant prêts pour l’éclairage, tapisser le plat de culture au plafond de l’incubateur, en veillant à ce que la surface au fond du plat est transparente pour l’éclairage d’en bas par le projecteur.

Après la croissance du jour au lendemain des échantillons de biofilm, retirez le plat de culture de l’incubateur. Le plat aura des bactéries biofilm attachées à sa surface inférieure où il a été éclairé, ainsi que des bactéries planctoniques dispersées dans le liquide ci-dessus. Jetez les cellules planctoniques en enlevant le liquide du plat de culture.

Ensuite, rincez l’échantillon deux fois avec PBS pour enlever les cellules planctoniques restantes en pipetting doucement dans PBS, suivi de l’aspiration. Si les cellules sont étiquetées fluorescentement, imagez directement les échantillons à l’aide d’une microscopie de fluorescence. Comme on le voit ici, les bactéries pDawn-Ag43 ont été utilisées pour produire des biofilms modelés dans des plaques de puits en polystyrène avec éclairage du projecteur.

Les biofilms peuvent être visualisés à l’aide de taches de violette cristalline ou alternativement par microscopie de fluorescence si vous utilisez des bactéries fluorescentes. Des échantillons fluorescents de biofilm peuvent également être photographiés utilisant la microscopie confoccale pour obtenir des images du biofilm en 3D. Le modelage haute résolution est possible à l’aide d’un photomask de film pour fournir un éclairage à motifs à l’échantillon de biofilm.

Des exemples de modelage sur des surfaces de verre et de PDMS, ainsi que des chambres de culture PDMS fermées, sont montrés ici et illustrent les différents types d’environnements où le modelage pDawn-Ag43 peut être appliqué. Tout en essayant cette procédure, il est important de transformer d’abord pDawn-Ag43 en votre souche d’intérêt, puis bien se concentrer et calibrer votre projecteur, et enfin suivre la culture requise et les étapes de dilution arrière pour préparer vos bactéries à l’illumination. Suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être déployées, par exemple, la surveillance du biofilm à long terme dans différentes conditions de culture.

De cette façon, nous pouvons comprendre comment une structure de biofilm affecte sa fonction. Cette technique sera largement applicable, par exemple, pour la biologie synthétique et la recherche sur les matériaux, pour concevoir des biofilms vers diverses applications.