Name: Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez l'analyse du métabolisme énergétique dans le tissu rétinien de souris en utilisant un analyseur de flux extracellulaire. Cette méthode permet de mesurer la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel.

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Nous remercions le Dr Alexander Kolesnikov et Dr Vladimir Kefalov pour fournir des Gnat1- / -souris, de conseil et d’informations utiles et pour la lecture du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par NIH EY025269 (RR), le centre de recherche du diabète à l’Université de Washington - NIH DK020579 (JRM et RR), un Career Development Award de la recherche pour prévenir la cécité (RR), la Fondation Horncrest (RR), une bourse de développement de carrière du (de la FRDJ JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) et DK114233 (JRM).

Protocoles de suivi de l’Association pour la recherche en Vision et ophtalmologie énoncé sur l’utilisation des animaux et ont été approuvés par l’Université de Washington.
1. la préparation animaux
<ol><li>Garder animaux dans le logement standard avec un 12 heures sombres au cycle de lumière de 12 heures. Begin expériences à normalisés afin d’éviter les effets circadiennes, généralement le matin, peu après les lumières sont allumées.</li>
</ol>2. préparation de la solution
<ol><li>Préparer la base médias en dissolvant 8,4 mg de poudre médias bidistillée H2O (ddH2O) et ajuster le pH à 7,4 avec HCl ou NaOH, pour un volume final de 1 L. filtre stériliser cette solution avec un filtre de vitroplants de 0,22 µm.<ol>
<li>Ajouter 1 M de glucose et de pyruvate de sodium 100 mM aux médias pour atteindre la concentration finale de 5 mM de glucose et de pyruvate de 1 mM.</li>
		<li>Place une portion de 50 mL de base médias dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la solution de lyse, pour le dosage de tissus à la fin de l’analyse de flux, en ajoutant tris base à 10 mM, éther de polyéthylèneglycol tert-octylphényle à 0,2 % (v/v) et EDTA 1 mm, tous en FD2Mix O. jusqu'à ce que tous les composants complètement dissous et ajuster pH 8.0.</li>
	<li>Pour le protocole de stress mitochondrial, préparation d’un stock de 11 µM de l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP Synthase, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparation d’un stock de 11 µM de cyanure de carbonyle - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un agent découplant, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparer un cocktail des inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons, la roténone et l’antimycine A (RAA) en ajoutant la roténone à 11 µM et l’antimycine A à 22 µM, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de roténone 1 µM et 2 µM antimycine A dans le bien.</li>
	<li>Pour le protocole de la glycolyse, préparation d’un stock de 220 mM de glucose dissous dans les médias de base, de cibler une concentration finale de 20 mM dans le puits. Aussi, préparer un stock de 1,1 M de 2-désoxyglucose (2-DG), un inhibiteur compétitif de la glucose et antagoniste de la glycolyse, en dissolvant dans les médias de base. Cela s’adressera à une concentration finale de 100 mM 2-DG dans le puits.</li>
</ol>3. instrument Calibration
<ol><li>Pour calibrer les instruments pour une analyse de flux extracellulaire, ajouter 1 mL de solution d’étalonnage pour chaque puits de la cartouche de capteur (total de 24 puits) et incuber à 37 ° C dans un CO2-libre incubateur pendant la nuit (ou au moins 8 h).</li>
	<li>Charger des additifs pour le stress mitochondrial ou le protocole de la glycolyse dans chaque port de l’injecteur, A à D, de la cartouche de sonde, ajustement pour les changements de volume dans le puits. Remarque : À titre d’exemple, un essai typique comprend 45 µL d’un additif dans le premier port de l’injecteur, 49,5 µL dans le second, 54,5 µL dans la troisième et 60 µL dans le dernier, en supposant un volume bien initial de 450 µL.</li>
	<li>Pendant les premières expériences de plusieurs, charger base médias dans port A de mesurer combien le tissu mouvement/artefact se produit après une injection de port.</li>
	<li>Laissez la plaque de capteur chargé à incuber à 37 ° C dans une étuve à non-CO2 pendant au moins 60 min.</li>
</ol>4. isolement des frais souris tissu rétinien
Remarque : Cette étape est une adaptation de la technique du Dr Barry Winkler15.
<ol><li>Après avoir fait une anesthésie profonde à l’aide d’un cocktail de kétamine/xylazine standard, euthanasier souris par dislocation cervicale.</li>
	<li>Utilisez une paire de pinces courbes moyennes pour saisir le monde postérieur au nerf optique et exercez une légère pression vers l’avant à proptose l’oeil (Figure 1 a).<ol>
<li>Avec une lame de rasoir propre, créer une incision de limbe à Limbe à travers la cornée à l’aide d’un pass unique et délibéré de la lame.</li>
		<li>À l’aide de très bien, angle pince McPherson-style, pincer le globe postérieur pour exprimer l’objectif et les membranes hyaloïde antérieures hors de l’incision cornéenne. Jetez ces tissus.</li>
		<li>Répétez la manœuvre pincement avec une pince pour exprimer la rétine neurale.</li>
		<li>À l’aide de la pince comme une cuillère pour soulever la rétine, plutôt que de saisir le tissu, transférer la rétine loin de l’incision cornéenne et déposez directement dans les médias chauds dans un plat de 3 cm ou une plaque de cluster 6 puits culture de tissus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser deux paires de pinces de type McPherson fine, inclinée à disséquer doucement restant vitré de la rétine. C’est mieux fait en saisissant le corps vitré à la périphérie de la rétine coupe et en tirant vers le centre, avec un disinsertion final du corps vitré du centre dans son ensemble. À l’aide de la pince, retirez tout épithélium pigmentaire rétinien résiduel de la surface des photorécepteurs de la rétine.<ol>
<li>Couper un embout P1000 avec une lame de rasoir pour créer une ouverture d’environ 4 mm afin d’éviter un traumatisme abusif le tissu rétinien délicat lors des manoeuvres de transfert.</li>
		<li>Transvaser le tissu rétinien isolé dans les supports neufs en utilisant un embout de pipette P1000 coupé.</li>
		<li>Couper les poinçons de 1 mm de la rétine autour du nerf optique avec une biopsie de 1 mm punch équipé d’un piston pour déloger le tissu dans le cas où il se loge dans le trou (Figure 1 b). Définissez les poinçons rétiniennes côté dans les médias propres détenus dans un bloc de 37 ° C ou coussin chauffant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. protocole
<ol><li>Transfert individuels poinçons à une îlot de 24 puits capture microplaque utilisant un embout P1000 coupé, aspirer 450 µL de médias ainsi que le tissu.</li>
	<li>Utiliser correctement, pinces droites pour manipuler doucement les coups de poing au centre de la microplaque. Garder les poinçons orientées dans le même sens (p. ex., ganglion cell côté vers le haut).<ol>
<li>Reposer la plaque de capture sur un coussin chauffant ou chauffage bloc réglé à 37 ° C que ces étapes sont répétées pour les échantillons restants. Remarque : Pour chaque expérience, mis de côté 3-4 puits vides avec 450 µL de base médias pour servir de témoins négatifs. Dans les autres puits de 20-21, tester chaque réplicat biologique en trois exemplaires. Par conséquent, chaque plaque 24 puits permettra pour l’enregistrement de 6-7 différents animaux ou des conditions de traitement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En évitant les bulles d’air, position doucement l’îlot prendre des inserts en mesh dans chaque puits à l’aide de pinces et de sécuriser les inserts avec une tige métallique ou avec un embout P1000 coupe (Figure 1 C). Remarque : Éviter la circulation excessive des tissus au cours de cette étape de maintenir la position de punch rétinienne au sein du centre de l’échantillon microchamber. Bulles d’air gravement faussent la lecture OCR. Bien que le microchamber a une profondeur suffisante pour accueillir la rétine de souris typique (Figure 1), parfois d’usinage-défauts dans les inserts en mesh peuvent causer les tissus deviennent trop compressée lors de l’insertion de l’écran. Si cela se produit, simplement prendre note des tissus broyés et exclure que l’échantillon de l’analyse finale.</li>
	<li>Incuber la plaque de tissu dans un 37 ° C CO2-incubateur libre pendant au moins 60 min.</li>
	<li>L’analyseur de flux extracellulaire à l’aide de Mix, attendre, mesure du programme et répétez les commandes. À titre d’exemple, une expérience typique avec tissu rétinien peut inclure ce qui suit : mélanger 2 minutes, attendre 2 minutes et mesurer 5 minutes. Répétez l’expérience avec ces trois étapes entre 5 - 8 fois (cycles) pour un enregistrement de base et après l’injection de chaque composé testé pendant la course.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton de démarrage de programme sur l’analyseur de flux extracellulaire et suivez les instructions à l’écran pour insérer la cartouche de sonde pour l’étalonnage.</li>
	<li>À la fin de l’étalonnage, suivez les instructions à l’écran pour remplacer la plaque calibrant avec la plaque contenant les échantillons rétiniennes.</li>
	<li>Autoriser le programme à exécuter, comme programmé. À la fin de la course, suivez les instructions à l’écran pour éjecter la plaque de tissu. Afficher les résultats de la course et stocker le fichier de données.</li>
	<li>Avec une aiguille de calibre 20 tordue et forceps, supprimer tous les inserts en mesh provenant des puits, abandonnant le poinçon rétiniens.</li>
	<li>Aspirer les médias du tissu avec précaution et laver le tissu deux fois avec 0,5 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirer le PBS après le lavage.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tampon de lyse dans chaque puits et la pipette up et down pour homogénéiser les tissus.</li>
	<li>Quantifier les niveaux d’entrée basés sur l’ADN double brin (dsDNA) total ou de la teneur totale en protéines. Remarque : Ce qui suit est basé sur un test ADN double brin disponibles dans le commerce.</li>
	<li>Diluer les échantillons lysés 1:1 en ajoutant 100 µL de tampon Tris-EDTA (TE) et transférer 100 µL de l’échantillon dilué dans une plaque 96 puits.<ol>
<li>Ajouter 100 µL de tampon de détection dans chaque puits. Après le mélange pendant 2-5 minutes, quantifier la fluorescence après excitation à 480 nm et d’émission à 520 nm, en comparant à une courbe d’étalonnage.</li>
		<li>Normaliser le traçage de flux extracellulaire brutes à la teneur en ADN dans le puits. Remarque : Dans les résultats présentés ici, les échantillons sont normalisées à 50 ng dsDNA - une quantité typique dans un coup de poing rétinienne de 1 mm. Par conséquent, les valeurs absolues présentées ici peut être comparés à études présentant des données « par punch rétinienne ». Normaliser les tracés d’un étalon interne, telles que la ligne de base run à une concentration de glucose de 5 mM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
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<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
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<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
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<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

OCR et ECAR sont facilement mesurable en tissu rétinien explanté, à l’aide d’un bioanalyzer en utilisant les techniques décrites. Cette méthode diffère de celles des autres groupes en plusieurs étapes cruciales. Les tissus rétiniens sont isolées à travers une large incision cornéenne sans enucleating du globe, qui avaient été initialement décrit par Winkler,15. Cette méthode d’isolement rétinienne permet un transfert rapid de le œil de la vie dans la plaque de capture de tissu (souvent dans les 5 ...

La rétine est parmi les plus énergivores tissus dans le système nerveux central1. Comme la plupart des tissus, il génère l’adénosine triphosphate (ATP) via la glycolyse dans le cytosol ou via la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L’avantage énergétique de la phosphorylation oxydative au cours de la glycolyse pour produire de l’ATP d’une molécule de glucose est clair : 36 molécules d’ATP générées par l’ancien vs 2 molécules d’ATP générée à partir de ce dernier. En conséquence, les neurones rétiniens dépendent principalement de la respiration mitochondriale pour l’approvisionnement en énergie et cela se reflète par leur forte densité des mitochondries,2. Pourtant, la rétine aussi repose largement sur machines glycolytique même lorsque l’oxygène est abondante. Ce processus de glycolyse aérobie a été initialement décrite dans les cellules cancéreuses par Otto Warburg3, qui une fois a noté que la rétine est le seul post-mitotique tissu capable de cette forme de métabolisme4. Depuis ces premières observations, plusieurs tissus post-mitotiques ont été décrites pour se livrer à des degrés divers de la glycolyse en plus de la phosphorylation oxydative à répondre à leurs demandes d’ATP.
Phototransduction, pigment visuel recyclage, biosynthèse des segments externes des photorécepteurs et l’activité synaptique sont tous les processus exigeants de l’énergie dans les photorécepteurs, la sous-classe neuronale prédominante dans la rétine. Mais la nécessité de transporter activement des ions contre leur électriques et des gradients de concentration est de loin le plus énergiquement de votre processus en neurones1. Photorécepteurs sont des neurones particulières en ce sens qu’ils sont dépolarisés en l’absence de stimulation (c'est-à-dire, dans l’obscurité), alors qu’un stimulus lumineux déclenche la fermeture du chenal et l’Hyperpolarisation ultérieure. Par conséquent, dans l’obscurité, la rétine consomme de grandes quantités d’ATP pour maintenir sa dépolarisation ou « courant d’obscurité » comme on l’appelle communément. D’un point de vue adaptatif, un défi majeur dans la fourniture de ces énormes quantités d’ATP est la nécessité pour les organismes à maintenir une clarté visuelle par le biais de l’axe optique. L’architecture rétinienne inversé vu dans créatures modernes est la solution dominante, car il maintient le réseau capillaire dense fournissant des photorécepteurs de la voie de la lumière. Mais cette merveille du génie biologique naturel met la rétine à bord d’un précipice en termes de réserve métabolique. Même les petites insultes à la rétine peuvent potentiellement perturber l’équilibre délicat de l’approvisionnement énergétique de la demande, et la dysfonction visuelle ou cécité franche peut s’ensuivre rapidement.
Étant donné l’unique avec les besoins énergétiques de la rétine neuronale, couplée à sa restriction serrée d’approvisionnement vasculaire, une mesure précise de la consommation d’ATP dans la rétine et ses changements au cours de la maladie pourrait avoir de profondes implications dans la compréhension et le traitement aveuglante d’affections comme la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Traditionnellement, ces mesures nécessitent des équipements coûteux, conçus avec la plupart des études qui sortent d’une poignée de laboratoires entièrement dédié aux mesures de l’activité métabolique2,5,6, 7,8. Les techniques comprennent des essais individuels pour les métabolites spécifiques, études par traceurs utilisant les précurseurs marqués radio, consommation d’oxygène d’enregistrement à l’aide d’électrodes de Clark et métabolomique profilage9.
Grâce aux progrès des technologies de haut débit et une disponibilité accrue des appareils commerciaux, techniques au métabolisme rétinien record sont toujours plus accessible et abordable. La méthode décrite ici permet de mesurer tant la phosphorylation oxydative et la glycolyse dans l’utilisation de la rétine explantées tissus et un flux extracellulaire disponible dans le commerce analyseur9,10,11,12. Cet analyseur enregistre séparément les taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), servant d’indicateurs indirects de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, respectivement13. Ces mesures sont effectuées par une sonde immergée dans un microchamber créé sur le tissu d’intérêt. Cette adaptation de méthodes publiées antérieurement utilise une plaque de capture initialement conçue pour le pancréas, îlots de Langerhans pour enregistrer l’activité métabolique en petites sections circulaires de rétine de souris. Des expositions pharmacologiques multiples peuvent être livrées au tissu au cours d’un enregistrement unique, car le système contient 4 ports d’injection pour chaque échantillon bien. Grâce à ce système avec des protocoles distincts optimisés pour les enregistrements ECAR et OCR, les réponses des rétines sauvage peuvent être comparés aux rétines manque tbl1xr1 (Gnat1- / -), des causes de cécité nocturne stationnaire congénitale en les humains14.

<table><tbody><tr><td>Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF24</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (comprend : microplaque de capture d’îlots, cartouche de capteur et solution d’étalonnage)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Comprend une microplaque de capture d’îlots, une cartouche de capteur et une solution d’étalonnage</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Média (milieu en poudre)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>Milieux RPMI 1640 avec L-Glutamine et sans glucose ni bicarbonate de sodium</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glucose filtré, pour la préparation des milieux</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Antimycine-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Composant du protocole de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Composant du protocole de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Composant du protocole de stress mitochondrial</td></tr><tr><td>2-désoxyglucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Composant du protocole de glycolyse</td></tr><tr><td>1 mm Biopsie cutanée poinçons avec piston</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Outil d’explantation de tissu rétinien</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Forceps Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-10</td><td>Outil d’implantation de tissu rétinien</td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 Forceps - Incliné à 45 degrés</td><td>Outils de science fine</td><td>11253-25</td><td>Outil d’implantation de tissu rétinien</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps - Outils de</td><td>science fine</td> incurvés <td>11271-30</td><td>Outil d’implantation de tissu rétinien</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Kit de dosage</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>Essai de</td></tr> <tr><td>normalisation de chargementBase Trizma (base Tris)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Composant du tampon de lyse</td></tr><tr><td>Triton X-100 (polyéthylène glycol tert-octylphényl éther)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Composant du tampon de lyse</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Composant du tampon de lyse</td></tr><tr><td>C57BL/6J souris&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>&nbsp ; Souches 000664</td><td>Animaux</td></tr><tr><td>Gnat1-/- et Gnat1+/+&nbsp ;</td><td>Vladimir Kefalov, Ph. D. ; École de médecine de l’Université de Washington</td><td>Animaux</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure du métabolisme énergétique chez explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de flux extracellulaire

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Vision de l’acuité élevée est un processus fortement consommateurs d’énergie, et la rétine a développé plusieurs adaptations uniques pour répondre précisément à ces exigences tout en conservant la transparence de l’axe visuel. Perturbations à cet équilibre délicat causent des maladies aveuglantes, telles que la rétinopathie diabétique. Par conséquent, la compréhension des changements de métabolisme énergétique de la rétine au cours de la maladie est impérative pour le développement de thérapies rationnelles pour diverses causes de perte de vison. L’avènement récent des analyseurs de flux extracellulaire disponible dans le commerce a fait l’étude du métabolisme énergétique rétinien plus accessible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un tel analyseur pour mesurer la contribution à l’approvisionnement énergétique rétinien par l’intermédiaire de ses bras deux principe - la phosphorylation oxydative et la glycolyse - en quantifiant les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) et extracellulaire taux d’acidification (ECAR) comme proxy pour ces voies. Cette technique est facilement réalisée dans le tissu rétinien explanté, facilitant l’évaluation des réponses à plusieurs agents pharmacologiques dans une expérience simple. Métaboliques signatures dans la rétine des animaux dépourvus de signalisation de photorécepteur tige sont comparés aux contrôles de type sauvage à l’aide de cette méthode. Une limitation majeure de cette technique est le manque de capacité d’établir une distinction entre l’utilisation de l’énergie lumière adaptés et adapté à l’obscurité, un facteur physiologique important dans le tissu rétinien.

En utilisant les techniques décrites (résumées dans la Figure 1), les explants rétiniennes de 8 semaines sauvage (WT) souris ont été comparés aux appariés selon l’âge et le fond de tbl1xr1 souris null (Gnat1- / -). Parce que Gnat1- / - les animaux n’ont pas les machines à fermer canaux ioniques en réponse à des stimuli lumineux sensibles au nucléotide cyclique, les photorécepteurs de la tige restent dépolarisée...

Cette technique décrit enregistrement en temps réel de la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés souris à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés telles que la façon dont le métabolisme énergétique dans le tissu rétinien diffère entre les échantillons biologiques, ou après l’exposition à des agents pharmacologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise du tissu rétinien organotypique explanté pour mesurer les taux de glycolyse et de phosphorylation oxydée et permet d’évaluer les interventions en temps réel in vitro. Pour calibrer l’instrumentation d’un test de flux extracellulaire, ajoutez d’abord un millilitre de solution d’étalonnage à chaque puits de la cartouche de capteur de puits 24, et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur libre de Co2 pendant la nuit.Chargez les additifs pour le protocole de stress mitochondrial, ou le protocole de glycolyse dans chaque port d’injecteur sur la cartouche du capteur, en ajustant pour les changements de volume dans le puits. En supposant un volume initial de puits de 450 microlitres, un essai typique comprendrait 45 microlitres d’un additif dans le premier port injecteur, 49,5 microlitres dans le second, 54,5 microlitres dans le troisième, et 60 microlitres dans le dernier. Au cours des premières expériences, chargez le milieu de base dans le port A pour évaluer la quantité d’artefacts de mouvement tissulaire qui se produit après une injection au port.Laissez la plaque du capteur chargé couver à 37 degrés Celsius dans un incubateur non co2 pendant au moins 60 minutes. Commencez l’isolement du tissu rétinien frais de souris avec une souris fraîchement euthanasiée. Utilisez une paire de forceps incurvés de taille moyenne pour saisir le globe postérieur au nerf optique, et appliquez doucement la pression vers l’avant pour proptose l’oeil.À l’aide d’une lame de rasoir propre, créer un limbus à l’incision des limbes à travers la cornée à l’aide d’un seul passage délibéré de la lame. À l’aide de forceps de style McPherson à angle fin, pincez le globe postérieur pour exprimer la lentille et les membranes hyloïdes antérieures de l’incision cornéenne. Répétez la manœuvre de pincement avec des forceps pour exprimer la rétine neurale.Ensuite, utilisez les forceps comme une cuillère pour soulever la rétine loin de l’incision cornéenne. Placez la rétine directement dans le milieu chaud dans un plat de trois centimètres, ou une plaque de cluster de culture des tissus de six puits. Ensuite, utilisez deux paires de forceps de style McPherson à angle fin pour disséquer doucement le reste vitré de la rétine.Il est préférable de le faire en saisissant le vitré à la périphérie de la tasse rétinienne, et en tirant vers le centre, avec une désinsertion finale du corps vitreux du centre dans son ensemble. Ensuite, retirez tout épithélium rétinien résiduel de pigment de la surface du récepteur photo de la rétine. Coupez une pointe de pipette P1000 à l’aide d’une lame de rasoir pour créer une ouverture d’environ quatre millimètres afin d’éviter un traumatisme indu au tissu rétinien délicat pendant les manœuvres de transfert.Ensuite, utilisez la pointe de pipette coupée pour transférer le tissu rétinien isolé dans un milieu frais. Enfin, utilisez un poinçon d’une biopsie d’un millimètre équipé d’un piston, pour couper les poinçons de la rétine autour du nerf optique. Mettre les poinçons rétiniens de côté dans un milieu propre, maintenu sur un bloc de 37 degrés Celsius, ou coussin chauffant.Une fois que le nombre désiré de poinçons ont été recueillis, utilisez la pointe mignonne de P1000 pour aspirer un poinçon individuel dans 450 microlitres de milieu, et transférez-le à une microplaque de capture de 24 puits d’oeillet sur un coussin chauffant ou un bloc thermique de 37 degrés Celsius. Utilisez des forceps fins et droits pour manipuler délicatement les poinçons au centre de la micro plaque. Gardez les coups de poing orientés dans la même direction.Par exemple, avec le côté ganglionnaire vers le haut. Pour chaque expérience mis de côté trois à quatre puits vierges avec 450 microlitres de milieu de base pour servir de contrôles négatifs. Tout en évitant les bulles d’air ou les mouvements excessifs, placez doucement les inserts de maille de capture d’oeillet dans chaque puits, et fixez les inserts avec un piston en métal ou avec une pointe de pipette P1000 coupée.Bien que la microch chambre ait une profondeur suffisante pour accueillir la rétine typique de la souris, parfois les défauts de la machine dans les inserts en maille font que les tissus deviennent trop comprimés pendant l’insertion de l’écran. Si cela se produit, il suffit de prendre note de ce tissu broyé, et d’exclure cet échantillon de l’analyse finale. Incuber la plaque tissulaire dans un incubateur sans dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes.Programmez l’analyseur de flux cellulaire supplémentaire à l’aide de commandes de mélange, de poids, de mesure et de répétition. À titre d’exemple, une expérience typique avec le tissu rétinien peut inclure ce qui suit. Mélanger deux minutes, attendre deux minutes et mesurer cinq minutes.Répétez l’expérience avec ces trois étapes entre cinq et huit fois pour l’enregistrement de la ligne de base, et après injection de chaque composé testé. Appuyez sur le bouton de démarrage du programme sur l’analyseur de flux extracellulaire, et suivez les instructions sur l’écran pour insérer la cartouche du capteur pour l’étalonnage. À la fin de l’étalonnage, suivez les instructions sur l’écran pour remplacer la plaque calibrée par la plaque contenant les échantillons rétiniens, puis laissez le programme fonctionner comme programmé.À la fin de la course, suivez les instructions sur l’écran pour éjecter la plaque de tissu. Consultez les résultats de l’exécuter et stockez le fichier de données. À l’aide d’une aiguille et d’un forceps pliés de calibre 20, retirez tous les inserts en maille des puits, laissant derrière eux le poinçon rétinien.Aspirez soigneusement le milieu du tissu, et lavez le tissu deux fois avec 0,5 millilitres de salin tamponné au phosphate froid. Après avoir aspiré le deuxième lavage PBS, ajouter 100 microlitres de tampon de lyse à chaque lavage, et pipette de haut en bas pour homogénéiser les tissus. Enfin, quantifier les niveaux d’entrée en fonction de la teneur totale en ADN double brin en diluant les échantillons lysés un à un, avec 100 microlitres de tampon Tris-EDTA, et en transférant 100 microlitres de l’échantillon dilué à une plaque de puits de 96.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de détection à chaque puits et mélangez pendant deux à cinq minutes. Enfin, quantifier la florescence après excitation à 480 nanomètres et les émissions à 520 nanomètres en comparant à une courbe standard. Normaliser le flux extracellulaire brut traçant la teneur en ADN dans le puits.À la ligne de base, en présence du glucose de cinq milli muller et en présence du pyruvate de muller de 10 milli, il n’y a aucune différence significative dans les taux d’eflux acide, mesurés par le taux extracellulaire d’acidification. Entre les tissus rétiniens des animaux de type flétrissement, ou assommer les souris qui n’ont pas la machinerie pour fermer les canaux ioniques fermés au nucléotide cyclique en réponse à des stimuli lumineux. Des modèles semblables sont vus après addition du glucose de Muller de 20 milli et de l’inhibiteur glycolytique 2DG.Ces données peuvent être mathématiquement transformées pour représenter des changements fractionnels par rapport à la ligne de base, un format qui peut permettre une meilleure comparaison entre les différentes interventions expérimentales. Le taux absolu de consommation d’oxygène à la ligne de base est également équivalent entre le contrôle et le tissu rétinien mutant. L’ajout de glucose muller de 20 milli augmente la respiration mitochondriale, mais aucun changement n’a été observé entre les groupes en termes de quantification absolue ou en termes de changement par rapport à la ligne de base.L’ajout d’un milli muller FCCP, un agent de découplage, pour démontrer les taux respiratoires mitochondraux maximaux n’augmente pas significativement ocr au-dessus du niveau vu avec le glucose élevé dans le contrôle et le tissu rétinien mutant. Cependant, les signaux des deux souris chutent considérablement après l’ajout du cocktail RAA. En conclusion, nous démontrons une technique pour quantifier des taux de phosphorylation oxydée et de glycolyse dans les explants organotypiques de la rétine de souris.Avec l’isolement efficace du tissu rétinien, la technique donne des mesures fiables et reproudcables. Les effets en temps réel des expositions, comme le découplage des agents, peuvent être évalués. En plus de cette procédure, d’autres méthodes, comme le RTPCR quantitatif et le ballonnement occidental, peuvent être exécutées sur le tissu excédentaire isolé dans l’étape de dissection pour obtenir l’information parallèle pertinente aux études du métabolisme rétinien.

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