Name: Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour isoler des cellules de cancer du sein ayant subi une inversion de l'apoptose. Cette technique permet d'étudier la transition vers des cellules souches cancéreuses.

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Ce travail a été soutenu par le fonds innovante technologie d’Innovation Technology Commission : aide financière de l’état clé de laboratoire d’agrobiotechnologie (CUHK), le fonds de recherche biomédicale Lo Kwee-Seong et la fondation de Hysan Lee. Y.X. était soutenue par la bourse postdoctorale de la CUHK.

1. préparation du cancer du sein Non-souches de cellules cancéreuses
<ol><li>La culture MCF-7 et les cellules MDA-MB-231 dans 10 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans un plat de 100 mm. Culture T47D dans 10 mL d’un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol additionné de 2 mM de L-glutamine, 10 % inactivés par la chaleur SVF et 1 % v/v pénicilline-streptomycine (PS) dans un plat de 100 mm. Cellules de culture à 37 ° C dans une étuve de culture de cellule air 5 % CO295 %. Remarque : Rouge de phénol affecte la détection par fluorescence, mais a également une influence potentielle sur la croissance des cellules cancéreuses du sein en raison de ses effets oestrogène31. Par exemple, rouge de phénol pourraient stimuler les récepteurs de progestérone et la croissance de cellules MCF-731. Il pourrait également stimuler la croissance des cellules de T47D31.</li>
	<li>Laver les cellules avec 2 mL de phosphate solution saline tamponnée (PBS) deux fois. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à MCF-7 et MDA-MB-231 ou 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA aux cellules T47D. Remarque : La concentration de la trypsine-EDTA nécessaire pour la séparation des cellules entre les types de cellules du cancer du sein différents varient alors qu’une concentration inadéquate peut affecter le modèle d’expression de certains marqueurs de surface cellulaire comme CD44 et CD2432.</li>
	<li>La culture la vaisselle pendant 5 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2. Vérifiez régulièrement le détachement des cellules au microscope afin d’empêcher les cellules provenant de la digestion par la trypsine-EDTA.</li>
	<li>Lorsque plus de 90 % des cellules détachement, ajouter 5 mL de milieu rempli de RPMI au plat et il pipette au-dessus de la surface de couche de cellule plusieurs fois.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. Remarque : Habituellement, environ 6 x 106 cellules peuvent provenir d’un plat de 100 mm quand la confluence atteint 70 %.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets à 106 cellules/100 μL de tampon de FACS (PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % d’azide de sodium) dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Diviser les cellules en plusieurs tubes. Pour les cellules MCF-7, diviser les cellules en 4 tubes : deux pour l’isotype contrôles, l’un pour CD24 unique coloration comme CD24 contrôle positif et une autre pour la double coloration.</li>
	<li>Pour les cellules T47D, diviser les cellules en 3 tubes : deux isotypes contrôles et une double coloration.</li>
	<li>Pour les cellules MDA-MB-231, diviser les cellules en 4 tubes : deux pour l’isotype contrôles, l’un pour CD44 unique coloration comme CD44 contrôle positif et une autre pour la double coloration.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à nouveau à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant et ajoutez bloc Fc dilué 01:50 dans le tampon de FACS.</li>
	<li>Incuber les échantillons sur la glace pendant 20 min dans le noir avant la centrifugation à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter fluorochrome-conjuguées des anticorps monoclonaux contre CD44 humain (PerCP-Cy5.5) et la coloration CD24 (PE) à 01:40 et 01:10 dilutions (dans un tampon FACS) dans le deux groupes. Pour les contrôles positifs, ajouter CD44 (PerCP-Cy5.5) à MDA-MB-231 et ajouter CD24 (PE) pour les cellules MCF-7 à la même concentration, respectivement. Remarque : La combinaison du CD44 et C24 a été couramment utilisée dans poitrine CSC étude26,27,28,29,30.</li>
	<li>Pour les groupes de contrôle isotype, ajouter PerCP-Cy5.5 souris IgG2b, κ à un 01:40 dilution comme le contrôle de l’isotype d’anticorps CD44 et PE souris IgG2a, κ à un 01:10 dilution comme le contrôle de l’isotype d’anticorps CD24 à 106 cellules/100 μL. Remarque : Isotype contrôles pour des anticorps d’intérêt sont recommandés comme témoins négatifs33.</li>
	<li>Incuber les échantillons (à partir de mesures 1.12 et 1.13) à 4 ° C dans l’obscurité pour 30 min. centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Laver le culot deux fois avec 500 μl de PBS et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 0,5 mL de PBS et filtrer sur une maille en nylon de 40 µm avant d’exécuter sur une trieuse fluorescence-lancée de cellules.</li>
	<li>Aux fins de blocage et indemnisation, tache des cellules MCF-7 avec des anticorps anti-CD24 PE conjugué et tacher les cellules MDA-MB-231 avec anticorps anti-CD44 PerCP-Cy5.5-conjugué comme témoins positifs. Utiliser des cellules colorées avec isotype contrôles comme des contrôles négatifs (Figure 1).</li>
	<li>Prélever des cellules avec CD44–/CD24+ marqueurs dans des tubes de fond rond en polystyrène 12 x 75 mm contenant 1 mL de milieu (exempt de rouge de phénol RPMI 1640 milieu additionné de 20 % inactivés par la chaleur FBS et 2 % v/v PS) de la collection. Centrifuger les tubes à 300 x g et RT pendant 5 min et éliminer le surnageant. Remarque : CSC-cellules en cellules cancéreuses mammaires sont définis comme CD44+/CD24– cellules26,27,28,29,30et la poitrine non-souches de cellules cancéreuses sont définis comme CD44–/CD24+ cellules18 (Figure 1).</li>
	<li>Plaque des triée non souches cellules cancéreuses du sein dans la boîte de Petri contenant le support de la nouvelle collection pour mise en culture à 37 ° C dans un incubateur de culture 5 % CO2 cellules.</li>
</ol>2. détection et Induction de l’apoptose
<ol><li>Préparer 1 mM la staurosporine12,34 dans le DMSO. Dans le groupe traité de MCF-7, ajouter 25 μL de la staurosporine 1 mM au milieu rempli des cellules MCF-7 de faire jusqu'à 10 mL de volume final (2,5 μM staurosporine) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.</li>
	<li>Enlever le milieu de culture des cellules, laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Puis ajouter les 10 mL de milieu avec 2,5 μM staurosporine à cellules MCF-7 pendant 6 h d’induire l’apoptose lorsque la densité cellulaire atteint 70 % confluence.</li>
	<li>Préparer 1 mM paclitaxel35,36 dans le DMSO. Dans le groupe traité de T47D, ajouter 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM au milieu rempli de cellules T47D pour faire à un volume final de 10 mL (5 μM paclitaxel) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.</li>
	<li>Enlever le milieu de culture des cellules et laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Puis ajouter les 10 mL de milieu à 5 μM paclitaxel aux cellules T47D pour 10 h d’induire l’apoptose lorsque la densité cellulaire atteint 70 % confluence. Remarque : Le temps d’induction et la concentration des inducteurs qui induisent l’apoptose doivent être optimisés chaque fois qu’une nouvelle ligne de cellule est utilisée pour la première fois.</li>
	<li>Pour le groupe traité au solvant de MCF-7, ajouter 25 μL de stérile de diméthylsulfoxyde (DMSO) au milieu des cellules MCF-7 pour faire à un volume de 10 mL (c.-à-d., 0,25 % v/v DMSO) dûment rempli dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.</li>
	<li>Enlever le milieu de culture des cellules MCF-7 traitées solvants, laver une fois avec 2 mL de PBS. Puis ajouter les 10 mL de milieu avec 0,25 % v/v DMSO pendant 6 h sous le contrôle de solvant pour STS.</li>
	<li>Pour le groupe traité au solvant de T47D, ajouter 5 μl de DMSO stérile au milieu rempli de cellules T47D à compléter au volume final de 10 mL (soit 0,05 % v/v DMSO) dans un tube conique de 15 mL. Pipette pour mélanger le contenu uniformément.</li>
	<li>Enlever le milieu de culture des cellules T47D traitées solvants, laver une fois avec 2 mL de PBS. Puis, ajoutez les 10 mL de milieu avec 0,05 % v/v DMSO pendant 10 h que le solvant contrôle de paclitaxel.</li>
	<li>Pour observer les changements morphologiques des cellules traitées, détachant les cellules avec 50 nM Mitotracker rouge CMXRos et 250 ng/mL Hoechst 33342 et incuber pendant encore 20 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2. Observer la morphologie des cellules apoptotic typique sous un 60 x confocal laser scanning microscope (Figure 2). Remarque : La morphologie typique de l’apoptose comprend le rétrécissement de la cellule, blebbing membrane, fragmentation des mitochondries et condensation nucléaire mais avec membrane cellulaire intacte12,13,14,15 ,18,37.</li>
</ol>3. isolement des cellules apoptotiques et procédure d’inversion de l’apoptose
<ol><li>Tacher apoptotic inducteur et solvant traités-MCF-7 ou cellules de T47D avec 3 colorant de Caspase-3/7 vert détection μM à la concentration cellulaire de 106/ml dans l’obscurité pendant 30 min à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2.</li>
	<li>Filtrer les cellules à travers une maille en nylon de 40 µm avant d’exécuter dans la trieuse de pages pour le tri.</li>
	<li>Pour le blocage des fins, d’abord porte la population majeure (R1) et exclure les débris en traçant le graphique en points avec forward scatter et diffusion latérale (Figure 3).</li>
	<li>Utiliser les cellules non traitées sans ajouter le colorant de Caspase-3/7 vert détection comme témoin négatif pour la région négative (R2) de la porte (Figure 3 a).</li>
	<li>Utiliser des cellules traitées avec la staurosporine12,18,34 pendant 24 h et colorées avec le colorant comme témoin positif pour porte la région positive (R3) (Figure 3 b).</li>
	<li>Prélever des cellules positives (R3) appartenant aux groupes traités inducteur en tubes fond rond en polystyrène 12 x 75 mm contenant 1 mL de milieu de collection (le même que le milieu de la collection à l’étape 1.18) (Figures 3C-3D). Centrifuger les tubes à 300 x g et RT pendant 5 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Recueillir les cellules négatives (R2) de groupes traités solvant dans des tubes de polystyrène fond rond 12 × 75 mm avec 1 mL de milieu de collection comme à l’étape 3.6 (Figures 3E-3F). Remarque : Une petite partie des cellules (par exemple 10 000 cellules) soient collectée et ré-exécuter dans la trieuse de pages pour vérifier le motif du marqueur de caspases active. Si plus 90 % des cellules de traitées par solvant-triés sont indiqués dans la région de caspase-négatives ou plus 90 % des cellules d’imprégnées d’inducteur triés sont affichés dans la région de caspase-positive, ces cellules recueillies sont censées être relativement pure (Figures 3C-3F). Dans le cas contraire, la région de tri et/ou de la trieuse doit être réinitialisée.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules triées dans un milieu frais de collecte et les semences dans des plaques de culture de tissu de 12 puits et de la culture à 37 ° C sous une atmosphère d’air de 95 % 5 % CO2pendant 7 jours pour l’inversion de l’apoptose.</li>
</ol>4. confirmation de l’apoptose des caspases activées cellules
<ol><li>Mélanger 10 mM HEPES, 140 mM NaCl et 2,5 mM CaCl2 pour préparer la liaison annexine tamponné (pH 7,4). Stocker le tampon à 4 ° C et éviter le tampon de s’exposer à la lumière.</li>
	<li>Préparer une solution de travail 100 µg/mL d’iodure de propidium (PI) en diluant 5 µL de la 1 mg/mL solution PI dans 45 µL de tampon d’annexine-liaison. Conserver la solution à 4 ° C et éviter la solution pour exposer à la lumière. Remarque : PI est un potentiel mutagène et doit être manipulé avec soin.</li>
	<li>Préparer les cellules traitées inducteur tout comme aux étapes 2.1 à 2.5.</li>
	<li>Percevoir les MCF-7 imprégnées d’inducteur ou les cellules T47D en pipettant également le support au-dessus de la couche cellulaire 3-5 x pour détacher les cellules. Transférer les cellules dans un tube conique 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g et RT pendant 5 min. jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules avec un milieu rempli à la concentration cellulaire de 106/ml dans un tube de microtubes de 1,5 mL et tacher les cellules avec un colorant de le vert détection Caspase 3/7 de 3 μM dans l’obscurité pendant 30 min à 37 ° C.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g et RT pour 5 min. jetez les surnageants.</li>
	<li>Laver les cellules avec 1 mL de glacee PBS et centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min. jetez les surnageants.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 100 μL de tampon d’annexine-liaison avec la μL d’ajouter 5 du conjugué annexin V et 1 µL de 100 µg/mL solution de travail pour chaque 100 μl de suspension cellulaire de PI et incuber les cellules à température ambiante pendant 15 minutes. Remarque : Annexin V et PI sont utilisées ensemble pour marquer les cellules apoptotiques écoulement cytometry38,39,40.</li>
	<li>Ajouter 400 µL de tampon d’annexine-liaison, mélanger doucement. Conserver les échantillons sur la glace avant d’exécuter sur un cytomètre en flux.</li>
</ol>5. mesure de poitrine CSC-cellules par cytométrie en flux
<ol><li>Récolter le MCF-7 inversé dans les deux groupes traités inducteur ou solvant avec 0.05 % trypsine-EDTA. Récolter les cellules de T47D dans les deux groupes traités inducteur ou solvant ou avec 0,25 % de trypsine-EDTA tout comme aux étapes 1,2 à 1,5.</li>
	<li>Colorer les cellules avec des anticorps monoclonaux conjugués fluorochrome contre CD44 humain (PerCP-Cy5.5) et CD24 (PE) comme au point 1.12. Pendant ce temps, préparer les contrôles isotype comme à l’étape 1.13.</li>
	<li>Exécuter les cellules sur un cytomètre en flux et détecter le pourcentage de cellules CD44+/CD24– marqueurs.</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une manière directe et claire pour la détection de la transition des cellules mammaires cancéreuses non souches en cellules semblables à des CSC du sein en raison de l’inversion de l’apoptose. Confirmation des propriétés de ces cellules inversés CSC pourrait assistée à l’aide j’ain vitro mammosphere formation test et in vivo xénogreffe transplantation dans des souris immunodéficientes18,24,26 </su...

Le cancer a été des principales causes de la mort, provoquant le lourd fardeau aux pays dans le monde1. Le cancer occupe un rang élevé, tant en termes d’incidence et de mortalité chez les femmes entre tous les types de cancer1. En raison de l’hétérogénéité du cancer, une combinaison de médicaments est habituellement utilisée en chimiothérapie pour atteindre cancer cell death2,3,4. Cependant, puisque la communes médicaments chimiothérapeutiques ciblent souvent ADN5,6, synthèse7,8 et/ou microtubule dynamique des protéines9, les cellules à croissance rapide sont touchés le plus tout en les cellules quiescentes comme cancer stem cell (CSC) s sont généralement moins touchées10. CSC n’est donc plus susceptibles de survivre après le traitement, qui conduit plus tard à la résistance aux médicaments et le cancer rechute10,11. Par conséquent, élimination des CSC est devenu un sujet important pour le traitement du cancer et étude de l’origine des CSC est nécessaire.
D’autres études sur le phénomène de l’inversion de l’apoptose ont été réalisées dans les dix dernières années12,13,14,15,16,17,18 , 19. avant l’émergence de ce concept, il a été largement acceptée que les cellules subiront irréversiblement l’apoptose après l’activation de la caspase. Caspases sont une famille d’enzymes de protéines qui jouent un rôle clé dans les stades initiation et l’exécution de l’apoptose, y compris la formation de complexes apoptotiques et le clivage des substrats en aval20. Activation des caspases bourreau comme caspase 3 ou caspase 7 a été considérée comme le « point de non retour » pour l’apoptose21. Toutefois, les chercheurs ont observé récemment que l’apoptose inversion produit deux études in vitro et in vivo, au cours de laquelle les cellules peut récupérer l’apoptose même après caspase activation12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. en outre, caractéristiques agressives comme une résistance plus élevée à l’original inducteur d’apoptose et techniques plus invasives sont détectés dans le cancer inversé cellules15. Par conséquent, il a été proposé que le pourcentage de cellules semblables à des CSC serait plus élevé dans la population inversée par rapport aux cellules non traitées, éventuellement contribuer aux fonctionnalités plus malignes après l’apoptose inversion18.
Auparavant, beaucoup s’est efforcé de suivre le renversement de l’apoptose in vitro et, plus important encore, in vivo, qui contribuent grandement à confirmer l’universalité de ce processus16,17,19. Cependant, une étude systémique sur les conséquences des cellules inversées manque en raison de l’isolement insatisfaisante des cellules qui ont véritablement fait l’objet d’inversion de l’apoptose. Il est nécessaire d’acquérir des cellules apoptotiques pure et les récupérer pour complément d’étude. Ainsi, nous utilisons le marqueur traditionnellement reconnu de l’activation des caspases bourreau comme marqueur du « point of no return »21 d’apoptose et utiliser la cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour discriminer les caspases activées cellules colorées avec de la teinture de la Caspase-3/7 vert détection. Le colorant est lié par covalence à une séquence d’acide aminés court, hanane, qui peut être reconnu et clivé par active caspases 3/7. Le clivage aide à libérer la teinture, qui va effectuer des transferts du cytosol vers le noyau où il se lie à l’ADN et émet une fluorescence forte. Cette procédure évite d’utiliser une population de cellules en vrac dans lequel certaines cellules ne peuvent pas avoir subi l’apoptose.
CCF ou déclenchant les tumeurs des cellules ont été identifiés dans nombreuses tumeurs solides à l’aide d’un seul ou une combinaison de plusieurs marqueurs de surface et très peu de nombre de ces cellules ne suffisent pas à former des tumeurs dans des souris immunodéficientes22,23, 24,25,26,27. Une combinaison de CD44 et CD24 a été couramment utilisée dans les études du sein CSC et CD44+/CD24– cellules ont été définis comme la poitrine CSC26,27,28,29 , 30. récemment, nous avons effectué une série d’expériences pour confirmer la relation proposée entre le renversement de l’apoptose et CCS et démontrer que les cellules cancéreuses mammaires inversé acquise capacité accrue de formation tumorale in vitro et in vivo avec un pourcentage élevé de cellules avec des marqueurs de CSC18. Bien que nous ne pourrions pas exclure la possibilité que du sein CSCs survivent mieux et ainsi obtenir enrichis après le renversement de l’apoptose, ce qui est important, lorsque nous isoler des cellules souches non cancéreuses et sujet à l’inversion de l’apoptose, CSC verront le jour dans l’origine non souches population de cellules de cancer, ce qui suggère que non-souches du cancer, les cellules peuvent contribuer à l’augmentation du pourcentage de CSC au cours de l’inversion de l’apoptose.
Cet article a pour but de démontrer le passage de cellules-souches non cancéreuses du sein à CSC-comme les cellules du sein après le renversement de l’apoptose et de détecter cette transition par cytométrie en flux. Les cellules souches non cancéreuses sont préparés au départ en isolant CD44–/CD24+ sein des cellules cancéreuses par FACS. Puis, l’apoptose est induite et confirmé par des changements morphologiques sous le microscope. Par la suite, les cellules apoptotiques positivement marqué par le colorant vert détection Caspase 3/7 sont isolées par FACS et ensuite mis en culture en l’absence d’apoptotic inducteurs d’inversion de l’apoptose. Les cellules inversés sont ensuite colorées avec des marqueurs de la CSC après 7 jours de récupération pour cytométrie. Cellules avec CD44+/CD24– marqueurs reparaissent dans la population inversée, ce qui laisse supposer que transition entre cellules souches non cancéreuses et des cellules semblables à CSC est apparue au cours de l’inversion de l’apoptose.
Inversion de l’apoptose a été observée dans le cancer de plusieurs lignées cellulaires comme les cellules primaires normales traitées avec des stimuli apoptotiques différents en vitro12,13. Ce processus a également été suivi chez la drosophile modèle in vivo16,17,19. Beaucoup d’informations concernant le mécanisme sous-jacent de rechute du cancer dans les modèles de la maladie de cancer différents et l’origine des CSC peut être obtenue par l’utilisation de la technique que décrit dans ce manuscrit.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>Collection de cultures de type américain (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Collection de cultures de type américain (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Collection de cultures de type américain (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 % trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 annexine V conjugué</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>sérum bovin albumine</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 vert fluorescent colorant</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal</td><td>bovin Invitrogen</td><td>16000044</td><td>inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td> Anticorps monoclonaux <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>contre CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Clone :ML5 Lot :5049759 RRID :AB_395822</td></tr> anticorps <tr><td>monoclonaux contre CD44 humain</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Clone :G44-26 Lot :7230770 RRID :AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE souris IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>clone :G155-178 (RUO) RRID :AB_395491</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 souris IgG2b, &kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone :27-35 RRID :AB_647257</td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 moyen</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>azoture de sodium</td> sans rouge de phénol <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>staurosporine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm plat de culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire 12 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu ; m nylon mesh</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite software bundle v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X</td></tr><tr><td>objectif FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b</td><td>Olympus-round-bottom</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polystyrène 12 & fois ; Tubes de 75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>trieur S3e</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Récidive du cancer a longtemps étudié par les oncologues tandis que les mécanismes sous-jacents demeurent obscures. Récemment, nous et autres découvrirent qu’un phénomène appelé apoptose inversion entraîne tumorigénicité accrue dans différents modèles de cellule sous différents stimuli. Des études antérieures ont surtout portés sur le suivi de ce processus in vitro et in vivo ; Toutefois, l’isolement de cellules réelle inversées doit encore à atteindre, qui limite notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ici, nous profitons d’un colorant de la Caspase-3/7 vert détection pour marquer les cellules avec des caspases activés après l’induction de l’apoptose. Cellules avec des signaux positifs sont plus triés par cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour la récupération. L’examen morphologique en microscopie confocale permet de confirmer le statut d’apoptotic avant FACS. Une augmentation de la tumorigénicité peut souvent être attribuée à l’élévation du pourcentage de cellules de souches du cancer (SCC)-comme des cellules. Aussi, compte tenu de l’hétérogénéité du cancer du sein, identifier l’origine de ces cellules CSC serait essentiel pour le traitement du cancer. Ainsi, nous préparons des cellules-souches non cancéreuses du sein avant le déclenchement de l’apoptose, isoler les cellules activées caspase et effectuez la procédure d’inversion de l’apoptose. Analyse en cytométrie en flux révèle que cellules mammaires CSC ré-apparaissent dans le groupe inversé, indiquant les cellules mammaires CSC sont transités de cellules-souches non cancéreuses du sein au cours de l’inversion de l’apoptose. En résumé, ce protocole inclut l’isolement des cellules de cancer du sein apoptotic et détection des variations en pourcentage de la CSC dans les cellules inversées par cytométrie en flux.

Afin d’observer la transition du sein non souches cellules cancéreuses à des cellules mammaires semblables à CSC, un premier tri de CD44–/CD24+ cellules cancéreuses du sein ont été nécessaires. Pour la lignée de cellules MCF-7, qui a environ 0,15 % cellules avec des marqueurs de CSC dans la population d’origine (Figure 1), cette étape a contribué à exclure la possibilité d’enrichissement de la CSC au cours de l’inversion de l’apoptose. A...

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Les isolements des populations réelles de cellules d’inversion apoptotique a été un problème précédemment, qui limite considérablement notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ce protocole nous permet de générer une population plus pure de cellules d’inversion apoptotique. Le principal avantage de cette technique est que les matériaux et l’équipement utilisés sont largement disponibles dans différentes institutions.Cette technique est facilement applicable pour isoler une population plus pure de cellules qui ont subi l’inversion de l’apoptose. Comme indiqué précédemment, les cellules normales peuvent également aller subir l’inversion d’apoptose, qu’en dehors des cellules cancéreuses du sein, différentes cellules de chimio, aussi bien que les cellules normales, peuvent être commencées et les divers stimulus apoptotiques peuvent être utilisés. Puisque la cellule d’inversion est passée par l’apoptose et le tri rapide, le taux de rétablissement est habituellement bas.Un plus grand nombre de cellules de départ est recombinant pour augmenter le rendement final. Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, et les cellules T47D, selon le protocole de texte. Après cela, laver les cellules avec PBS deux fois, puis ajouter deux millilitres de 0,05 pour cent trypsine-EDTA de 0,05 pour cent trypsine-EDTA à la MCF-7, et les cellules MDA-MB-231, aux cellules MCF-7, et MDA-MB-231, et deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent et de deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent aux cellules T47D.aux cellules T47D. Culture des cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, dans un incubateur de culture de cellules de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Pendant que les cellules couvent, vérifiez le détachement des cellules à l’aide d’un microscope pour éviter la surdigestion par trypsine-EDTA.Lorsque plus de 90 pour cent des cellules se détachent, ajouter cinq millilitres de milieu RPMI complété au plat, et pipette sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres et une centrifugeuse. Jetez le supernatant et suspendez les granulés avec tampon FACS dans des tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.Ensuite, divisez les cellules en plusieurs tubes. Centrifuger les tubes une fois de plus, et jeter le supernatant. Ensuite, ajouter le bloc Fc dilué aux échantillons.Incuber les échantillons sur la glace dans l’obscurité pendant 20 minutes, avant de les recouver à nouveau. Après cela, jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 humains, et le CD24, contre le CD44 humain, et le CD24, dans un à 40, et un à dix dilutions, respectivement, aux groupes à double coloration.Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 aux cellules MDA-MB-231, aux cellules MDA-MB-231, et des anticorps CD24 aux cellules MCF-7 et aux anticorps CD24 aux cellules MCF-7 dans un à 40, et un à 10 dilutions, respectivement. Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, dilué à un rapport d’un à 40 par rapport aux cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD44. Ensuite, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, Puis, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, dilué à un rapport d’un à 10 pour les cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD24.Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 300 g puis, centrifugez les échantillons à 300 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille deux fois dans 500 micro-litres de PBS.Ensuite, répétez la centrifugation comme décrit précédemment. Suspendre à nouveau la pastille sur 0,5 millilitres de PBS et filtrer la suspension à l’aide d’un maillage en nylon de 40 micromètres. Ensuite, exécutez la suspension à travers un trieur de cellules activé par fluorescence.Recueillir les cellules avec des marqueurs négatifs CD44, et CD24 marqueurs positifs dans les tubes à fond rond contenant un millilitre de milieu de collecte. Puis, centrifuger les tubes, et jeter le supernatant. Ensuite, plaquez les cellules cancéreuses non souches triées du sein dans un plat de culture contenant un milieu de collecte frais pour une culture plus douce.Tout d’abord, utiliser une staurosporine millimolaire dans DMSO, Pour préparer 2,5 micro-molaires staurosporine en milieu, selon le protocole du texte. Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS une fois, après cela, ajouter 10 millilitres du milieu staurosporine aux cellules MSF-7 pendant six heures, pour induire l’apoptose, lorsque les cellules sont 70 pour cent confluent.Ensuite, préparez un paclitaxel millimolaire dans DMSO. Ensuite, ajoutez 12,5 micro-litres Puis, ajoutez 12,5 micro-litres du paclitaxel de 1 millimolaire au milieu complété des cellules T47D pour faire un volume final de 10 millilitres dans un tube conique de 15 millilitres. Retirez le milieu de culture des cellules et lavez les cellules avec 2 millilitres de PBS.Ensuite, ajouter le milieu paclitaxel aux cellules pendant 10 heures pour induire l’apoptose pendant 10 heures pour induire l’apoptose lorsque les cellules atteignent 70 pour cent de confluence. Après cela, retirez le milieu du groupe MCF-7 traité au solvant et lavez-le avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen pendant six heures que le contrôle des solvants pour la staurosporine.Retirez le milieu de culture du groupe T47D traité au solvant et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen pendant 10 heures que le contrôle des solvants pour le paclitaxel. Ensuite, tacher la cellule et les incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent.Utilisez un microscope à balayage laser 60 fois confocal pour observer les changements morphologiques des cellules traitées. Tacher à la fois l’inducteur apoptotique et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. À l’aide du trieur cellulaire activé par fluorescence, recueillir les cellules positives des groupes traités par l’inducteur dans des tubes de fond ronds contenant un millilitre de milieu de collecte.Ensuite, centrifugez les tubes comme décrit précédemment, et jetez le supernatant. Recueillir les cellules négatives des groupes traités au solvant dans des tubes à fond rond avec un millilitre de milieu de collecte. Centrifuger les tubes, et jeter le supernatant.Après cela, suspendre à nouveau les cellules triées dans le milieu de collecte frais. Ensemencer les cellules dans des plaques de culture tissulaire de 12 puits, et les culture pendant sept jours pour l’inversion de l’apoptose. Récoltez le MCF-7 inversé dans les groupes induits et traités par solvant avec 0,05 pour cent trypsine-EDTA.avec 0,05 pour cent trypsin-EDTA. Puis, récolter les cellules T47D dans les deux inducteurs Puis, récolter les cellules T47D dans les deux groupes inducteurs et traités par solvant avec 0,25 pour cent trypsine-EDTA. Tacher les cellules avec des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 et CD24 humains.Tandis que les cellules tachent, préparez les contrôles d’isotype comme précédemment démontré. Enfin, exécutez les cellules sur un cytomètre d’écoulement, et détectez le pourcentage de cellules avec des marqueurs négatifs CD44 positifs et CD24. Dans ce protocole, la transition des cellules cancéreuses non souches du sein aux cellules sein csc-like a été observée.L’isolement des cellules cancéreuses non souches a d’abord été fait dans les cellules MCF-7. Des changements morphologiques typiques ont été observés après ajout d’inducteurs apoptotiques, et les cellules se sont rétablies de l’apoptose avec la morphologie semblable après retrait de drogue. Les cellules activées par caspace ont été étiquetées et triées en fonction de leur intensité fluorescense plus élevée que les cellules sans activation de caspace.Au cours du processus d’induction apoptotique, le solvant a été utilisé pour exclure la possibilité que la procédure des faits, ou le solvant lui-même, était la cause de la transition. Les cellules caspace-activées dans les groupes de traitement apoptotic-inducteur se sont trouvées pour être un nexin cinq positif et négatif de PI, suggérant qu’ils étaient des cellules apoptotiques. Les cellules apoptotiques ont été rassemblées et cultivés pour le rétablissement, comparées aux groupes solvant-traités, l’analyse cytométrique de flux a prouvé qu’il y avait des cellules apparaissant dans le quadrant positif de CD44 et cd24 négatif dans la population inversée à l’origine de cellules cancéreuses non souches de sein.Le bâillonnement est important dans l’analyse du débit et le tri cellulaire, afin qu’un contrôle suffisant soit préparé dans les laboratoires. Puisque cette procédure in vitro d’inversion d’apoptose isole les cellules cancéreuses apoptotiques pures, des expériences telles que les actifs in vivo tumorigenesis peuvent être conduites pour comprendre les conséquences de l’inverse réel des cellules. Cette technique met en lumière la cause de la rechute du cancer, par conséquent, il peut être étudié pour potentiellement prévenir la ré-occurrence chez les patients atteints de cancer.N’oubliez pas de vous protéger correctement lorsque vous effectuez des expériences de culture cellulaire conformément aux règlements de niveau biosécurité de votre établissement.

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Dans cette vidéo, nous décrivons l’isolement d’une sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS. La population latérale isolée de cellules peut être utilisée pour une analyse plus poussée en aval.

Essai de discrimination de la population du côté cancéreux : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses à l’aide d’un test d’efflux de colorant de Hoechst

Les dosages de mammosphère flottante peuvent étudier le sous-ensemble de cellules cancéreuses du sein de type souche qui survivent en suspension et présentent une tumorigenèse accrue lorsqu’elles sont implantées chez la souris.  Ce protocole fournit une mesure in vitro pratique de la capacité de formation de sphères, un indicateur de la tumorigenèse in vivo, tout en facilitant l’analyse du paysage transcriptionnel associé aux tiges.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Comprendre le rôle des cellules souches cancéreuses dans la récidive tumorale et la résistance aux thérapies est devenu un sujet de grand intérêt au cours de la dernière décennie. Cet article décrit l’isolement et la caractérisation de la sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Cette procédure démontrera comment nous avons synthétisé et caractérisé l’activité des cellules souches anti-NFκB et anticancéreuses d’un promédicament à base d’aspirine-fumarate.

Synthèse et caractérisation d&#39;un promédicament Aspirin-fumarate qui inhibe l&#39;activité de NFkB et du sein des cellules souches du cancer

Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

L’apoptose peut être caractérisée par l’analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques précoces et tardifs. La lignée cellulaire du cancer du col de l’utérus, SiHa, a été analysée pour les biomarqueurs de l’apoptose après un traitement avec l’actinomycine D à l’aide d’un cytomètre de flux de paillasse.

Analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques dans les cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire 

Ce protocole décrit la méthode de mise en place du test de formation de la mammosphère pour étudier la steminité cancéreuse induite par l’inhibiteur de l’apoptose 5 (Api5) dans les cellules épithéliales mammaires non tumorigènes. Les lysats collectés dans des mammosphères de génération primaire sont analysés pour identifier différents marqueurs de tige afin d’évaluer l’induction de propriétés similaires à celles des cellules souches.

Le test de la mammosphère révèle une tige induite par Api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes

Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour isoler des cellules de cancer du sein ayant subi une inversion de l'apoptose. Cette technique permet d'étudier la transition vers des cellules souches cancéreuses.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose (Vidéo) | JoVE Journal

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

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