DsRNA reproductible Microinjection et bioessais sur la ponte chez les moustiques et les mouches domestiques

Ce protocole décrit une méthode de microinjection que nous avons normalisé et utilisé depuis plusieurs années à livrer des quantités d’acides nucléiques spécifiques directement à l’hémolymphe des moustiques et des mouches domestiques. Ce protocole se traduit par la mortalité injection minime et permet des mesures de dose en corrélation de la fécondité.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du biopesticide, telles que la façon dont l’expression du gène d’impact de l’ARN à double brin, et la fécondité chez les diptères adultes. Le principal avantage de cette technique est que des doses quantifiables d’ARN à double brin sont livrées au moustique ou à la mouche, et les effets qui en résultent sur la létalité multigénérationnelle peuvent ensuite être évalués. Bien que cette méthode soit présentée pour le moustique, aedes aegypti, et la mouche domestique, musca domestica, elle peut également être appliquée à d’autres espèces de moustiques et de mouches.

En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, parce que la maîtrise de la procédure d’injection elle-même est un investissement de temps. Il est essentiel d’injecter à chaque insecte la taille optimale de la pointe de l’aiguille pour assurer l’accouchement tout en minimisant les blessures et la mortalité. Pour commencer, utilisez des forceps pour mettre soigneusement en scène les moustiques afin qu’ils soient finalement exposés sur une lame de microscope à environ un demi-centimètre l’un de l’autre.

Pour faciliter la manipulation des glissières, laissez un espace d’un centimètre et demi à l’extrémité gauche ou droite de la glissière. Placez ensuite la glissade des insectes mis en scène à quatre degrés Celsius dans une grande boîte de Pétri. Installez un microscope disséquant et un microinjecteur sur une table froide.

Après avoir tiré les capillaires de verre à une pointe fine, placez l’aiguille capillaire dans le microinjecteur et cassez la pointe de l’aiguille avec des forceps. Rincez ensuite l’aiguille en dessinant et en expulsant l’eau sans nucléase trois fois. Notez que la taille de l’ouverture des aiguilles en verre varie entre les moustiques et les mouches de la maison.

Ensuite, préparez une solution d’injection avec une concentration appropriée pour les moustiques. Ajouter trois microgrammes par millilitre de Rhodamine B à la solution pour faciliter la visualisation. Utilisez une pipette pour transférer trois à quatre microlitres de solution sur une surface propre, et dessinez-la dans l’aiguille en verre sans prendre d’air.

Aprimez le bouton d’injection à plusieurs reprises jusqu’à ce que le liquide commence à se passer de l’aiguille. Utilisez un marqueur de point ultra fin pour dessiner des marques de hachage à environ un millimètre l’une de l’autre, à partir du ménisque liquide jusqu’à la tige de l’aiguille. Placez la glissière des moustiques sous l’aiguille et assurez-vous que le champ de vision est assez large pour voir le ménisque de solution dans l’aiguille.

Aligner l’aiguille avec le milieu d’un tiers du sternum mésocarape. Préparez le moustique contre l’aiguille avec des forceps placés sur le côté opposé du moustique, et perforez doucement la cuticule avec la pointe de l’aiguille. Glissez doucement l’aiguille dans le moustique jusqu’à ce que la pointe ait traversé la ligne médiane.

A appuyer sur le bouton d’injection jusqu’à ce que la quantité désirée de liquide ait été injectée. Si le ménisque ne bouge pas, faites glisser lentement le moustique ou envolez-vous de l’aiguille tout en surveillant le mouvement du ménisque. Si une partie de la solution injectée sort de la cuticule lors de l’enlèvement de l’aiguille, ou si le ménisque ne bouge pas, jetez l’insecte car l’injection n’a pas réussi.

Sur la mouche de la maison, aligner l’aiguille avec le mésopleuron. Préparez la mouche contre l’aiguille avec des forceps placés sur le côté opposé de la mouche, et perforez doucement la cuticule avec la pointe de l’aiguille. Transférer les insectes injectés pour dégager les gobelets de 3,5 onces en groupes de dix à 15.

Couvrez ensuite la tasse d’un filet et laissez-les récupérer à température ambiante. Une fois que les insectes se sont rétablis, inverser la tasse de fixation sur une boule de coton trempée dans une solution de saccharose à 10 %. Tout d’abord, remplissez une membrane artificielle de 12 pouces de sang frais et chauffez-la à 60 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude.

Séchez la membrane avec une serviette en papier et mentez-la sur le bouchon de filet de la tasse de fixation. Après l’alimentation des moustiques, remplacer la boule de coton et laisser reposer les moustiques pendant 24 heures. Ensuite, construisez des tasses d’oviposition en remplissant des tasses claires en acétate biologique de 3,5 onces avec environ 30 millimètres d’eau déionisée.

Ensuite, placez un morceau de papier germination des graines au fond de la tasse. Couvrir la tasse de filet et couper une petite fente dans le bouchon de filet. 24 heures après l’alimentation, couper une petite fente dans le capuchon de la tasse de fixation et transférer les femelles qui ont réussi à se nourrir de tasses d’oviposition.

Ensuite, sceller la petite fente dans le bouchon d’oviposition avec une boule de coton saturé de saccharose de 10%. Surveillez les moustiques et suivez la mortalité quotidienne. Après avoir permis aux moustiques de s’ovipositer pendant cinq à sept jours, comptez les œufs au microscope disséquant.

Le Dr Christopher Geden, entomologiste de recherche à l’USDA ARS, démontrera la procédure. Trois jours après l’injection, anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone. Ensuite, transférer les mouches dans une cage propre avec de l’eau et préparé régime à la mouche.

Enregistrez les données sur la mortalité et éliminez quotidiennement les mouches mortes. Ensuite, mélangez 75% de son de blé avec 25% d’aliments pour animaux vivants granulés par poids pour préparer le milieu d’élevage larvaire. Ajouter de l’eau au mélange jusqu’à ce que 62% d’humidité soit atteinte.

Ajouter le son de blé humidifié mélange d’aliments vivants pour animaux à un carré de tissu noir, et le rouler dans une boule. Utilisez un élastique pour maintenir le tissu en place et presser doucement jusqu’à ce que le milieu liquide s’infiltille. Placez la balle dans une tasse de 60 millilitres et placez-la dans la cage à mouches pendant cinq heures.

Après cela, rincer les œufs de la boule, en veillant à ce que les œufs sont retirés sous les plis du tissu. Secouez les œufs pour perturber les grappes et transférez-les dans un tube de centrifugeuse gradué de 20 millilitres. Laissez les œufs se déposer et notez le volume d’œufs bien installés dans le tube.

Ajouter ensuite suffisamment d’eau pour porter le volume à 20 fois le volume des œufs réglés. Ensuite, utilisez une barre magnétique pour mélanger l’eau et la suspension aux œufs. Enfin, utilisez une pointe de pipette modifiée pour distribuer 0,5 millilitres de suspension sur un morceau de tissu noir pré-humidifié dans une série de lignes.

Dans ce protocole, les moustiques femelles ont été micro-injectés pour évaluer l’expression des gènes. L’injection d’ARN double brin aux femelles a montré une réduction significative de l’expression relative à travers de multiples cycles d’oviposition. La taille moyenne des couvées chez les moustiques au cours du premier cycle gonotrophique a été considérablement réduite pour les groupes traités dsRPS6 et dsRPL26.

Un effet de dose évident a été observé dans les tailles d’embrayage lors de l’injection de dsRPS6 d’un microgramme à 50 nanogrammes chez les moustiques femelles. Les mouches de la maison ont également été injectées avec cinq microgrammes de constructions d’ARN à double brin. À l’semblable aux observations des moustiques, on a noté une réduction significative de l’expression spécifique de la transcription et de la taille de l’embrayage.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de jeter les insectes qui n’ont pas été injectés avec succès. À l’aide de cette procédure, toute construction d’ARN à double brin ou tout autre biorationnel peut être livré aux moustiques ou aux mouches. N’oubliez pas que travailler avec des aiguilles en verre peut être dangereux, et ils doivent toujours être éliminés dans des conteneurs de déchets sharps appropriés.