Name: Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez la conception de vecteurs oncolytiques à base de virus de la rougeole exprimant des engageurs bispecifiques de cellules T pour l'immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode permet une immunomodulation ciblée ex vivo.

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Ces méthodes ont été établies dans le groupe virothérapie dirigé par Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts au Centre National pour les maladies tumorales à Heidelberg. Nous sommes reconnaissants envers lui et tous les membres de l’équipe du laboratoire, en particulier le Dr Tobias Speck, le Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, les Birgit Hoyler et que les Jessica Albert. Ce travail a été soutenu par l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 à C.E. Engeland) et l’allemand National Science Foundation (DFG, accorder EN 1119/2-1 à Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel reçoit une allocation de la Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

C.E. Engeland est répertorié comme co-inventeur d’un brevet en ce qui concerne les virus à ARN pour Cancer Immunovirotherapy appartenant à l’Université de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel n’a rien à divulguer.

Oncolytique immunothérapie (i.e., OVT en combinaison avec l’immunomodulation) est très prometteur pour le traitement du cancer, exigeant davantage développement et optimisation de virus oncolytiques codant des protéines immunomodulatrices. Ce protocole décrit les méthodes pour générer et valider ces vecteurs pour contrôle ultérieur dans des modèles précliniques appropriés et potentielle future traduction clinique en nouveaux traitements contre le cancer.
Nombreuses plates-formes de vi...

Virus oncolytiques (OVs) sont développés comme des thérapies de lutte contre le cancer qui spécifiquement répliquer au sein et tuer les cellules de la tumeur tout en conservant les tissus sains intacts. Il est devenu commun de comprendre cette virothérapie oncolytiques (OVT), dans la plupart des cas, ne repose pas uniquement sur la lyse tumorale complète en réplication efficace et la diffusion du virus, mais exige des mécanismes supplémentaires d’action pour la réussite du traitement, y compris vasculaire et stromales ciblage et, surtout, la stimulation immunitaire1,2,3,4. Tandis que plusieurs des premières études OV utilisé virus non modifiées, les recherches actuelles a profité d’une biologique améliorée compréhension, virus biobanques qui contiennent potentiellement roman OVs et les possibilités offertes par génie génétique afin de créer des avancées OV plates-formes5,6,7.
Vu le succès récent de l’immunothérapie, immunomodulateurs transgènes sont particulièrement intéressantes concernant le génie génétique OVs. Expression ciblée de ces produits de gène par les cellules tumorales infectées par OV réduit la toxicité par rapport à l’administration systémique. Ciblage est obtenue en utilisant des virus avec oncoselectivity inhérent ou en modifiant le tropisme viral8. Immunomodulation locale améliore les mécanismes anti-tumorale multi-facettes de OVT. En outre, cette stratégie est instrumentale dans l’interrogation de l’interaction entre les virus, les cellules tumorales et le système immunitaire. À cette fin, ce protocole prévoit un flux de travail applicable et réglable afin de concevoir, clone, sauvetage, propager et valider des vecteurs de paramyxovirus (plus précisément les virus de la rougeole) oncolytiques codant ces transgènes.
Modulation de la réponse immunitaire peut être réalisée par une grande variété de produits de transgene ciblant les différentes étapes du cancer-immunité cycle9, y compris renforcer la reconnaissance de l’antigène tumoral [par exemple, les antigènes associés aux tumeurs (AVA) ou des inducteurs de complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules] plus soutenir la maturation des cellules dendritiques pour la présentation des antigènes efficace (cytokines) ; recrutement et activation des cellules immunitaires désirés comme cytotoxiques et des cellules de helper T [chimiokines, bispécifiques recruteurs de lymphocytes T (TSEI)] ; cibler les cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs, cellules myéloïdes dérivés suppressives, macrophages associées à la tumeur et cancer associés aux fibroblastes (TSEI, des anticorps, cytokines) ; et prévenir l’inhibition des cellules effectrices et épuisement (inhibiteurs de point de contrôle). Ainsi, il existe une pléthore d’agents biologiques. Évaluation de ces immunomodulateurs virus-encodé en ce qui concerne l’efficacité thérapeutique et les synergies possibles ainsi que la compréhension des mécanismes respectifs est nécessaire d’améliorer le traitement du cancer.
Virus à ARN simple brin sens négatif de la famille des Paramyxoviridae sont caractérisées par plusieurs caractéristiques propices à leur utilisation en tant que vecteurs oncolytiques. Il s’agit d’une oncotropism naturelle, grande capacité de génomique pour transgènes (plus de 5 Ko)10,11, efficace de diffusion dont la formation de syncytiums et forte immunogénicité12. Par conséquent, les plates-formes OV canine distemper virus13oreillons virus14, Newcastle disease virus15, virus Sendai16,17, Simien 518et de paramyxovirus Tupaia19 ont été développés. Plus en évidence, vivre de vaccin contre le virus rougeoleux atténué souches (MV) ont progressé dans le développement préclinique et clinique20,21. Ces souches de virus ont été utilisés pendant des décennies pour la vaccination systématique avec une excellente sécurité record22. En outre, il n’y a aucun risque pour la mutagénèse insertionnelle en raison de la réplication strictement cytosolique du paramyxovirus. Un système polyvalent de génétique inverse issu des ADNc anti-génomique qui permet l’insertion de transgènes dans unités de transcription supplémentaires (ATUs) est disponible de11,23,24. Vecteurs de MV symporteur de l’iodure de sodium (MV-NIS) d’encodage pour l’imagerie et de radiothérapie ou de l’antigène carcinoembryonnaire soluble (MV-ACE) comme marqueur de substitution pour l’expression des gènes viraux sont actuellement évalués dans des essais cliniques (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 et NCT00408590). Administration sécuritaire a été confirmée et efficacité antitumorale ont été signalés dans les précédentes études25,26,27,28,29, 30 (évaluée par Msaouel et Al.31), ouvrant la voie à des virus de la rougeole oncolytiques supplémentaires qui ont été développées et testées à l’intérêt. MV encodage immunomodulatrices molécules ciblant les diverses étapes du cycle du cancer-immunité auraient dû être divulgués de ralentir la croissance tumorale et/ou prolonger la survie chez les souris, avec la preuve de leur efficacité immunitaire et à long terme mémoire immunitaire protectrice en syngénique modèles de souris. Les transgènes vecteur codé comprennent stimulant factor (GM-CSF)32,33, H. pylori Activation des neutrophiles protéine34, point de contrôle immunitaire inhibiteurs35, des colonies de granulocytes et macrophages interleukine-12 (IL-12)36, Ava37et TSEI38, qui réticuler un antigène de surface de tumeur avec CD3 et ainsi induire une activité antitumorale par les cellules T polyclonales, quel que soit T cell receptor spécificité et co-stimulation ( La figure 1). Les résultats précliniques prometteurs obtient pour ces constructions de nouveaux efforts translationnelle demande.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), un type j’ai le virus herpès simplex encodage GM-CSF, est le seul oncolytiques thérapeutiques approuvés par l’United States Food Drug Administration (FDA) et de l’Agence européenne des médicaments (EMA). L’étude de phase III menant aux homologations en fin 2015 n'a pas seulement montré une efficacité au site d’injection intra-tumorale, mais aussi des effets abscopal (c.-à-d., les remises des lésions non injectés) dans le mélanome avancé,39. T-VEC est entré depuis lors des essais supplémentaires pour application dans d’autres entités de la tumeur (par exemple cancer de la peau non-mélanome, , NCT03458117, cancer du pancréas, NCT03086642) ainsi que l’évaluation des thérapies de combinaison, surtout avec le point de contrôle immunitaire inhibiteurs (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 et Ribas et Al.40).
Cela montre non seulement le potentiel de l’immunothérapie oncolytiques, mais aussi la nécessité de poursuivre les recherches afin d’identifier les combinaisons supérieures de OVT et l’immunomodulation. Une conception rationnelle des vecteurs supplémentaires et leur développement pour les essais précliniques est essentielle pour cette entreprise. Cela fera avancer aussi la compréhension des mécanismes sous-jacents et a des implications pour la progression vers le traitement du cancer plus personnalisée. À cette fin, cette publication présente une méthodologie pour la modification et le développement du paramyxovirus pour immunothérapie ciblée contre le cancer et, plus particulièrement du virus de la rougeole oncolytiques encodage anticorps prise avec des lymphocytes T (Figure 2).

<table><tbody><tr><td>Rapid DNA Dephos & Kit de ligature</td><td>Roche Life Science, Mannheim, Allemagne</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR Cloning Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN</td><td>, Hilden, Allemagne</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Competent E. coli</td><td>New England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, Allemagne</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB moyen d’après Lennox</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Allemagne</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction HindIII-HF</td><td>New England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, Allemagne</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Allemagne</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Biosera, Boussens, France</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, Mannheim, Allemagne</td><td>E2311</td><td>peut être remplacé par le réactif de transfection de choix</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Cellules Vero</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td><td></td><td>disponible sur demande</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, Braunschweig, Allemagne</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (milieu sans sérum)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Cellule colorimétrique Le kit de viabilité III (XTT)</td><td>PromoKine, Heidelberg, Allemagne</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>comprend le réactif XTT</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de DulbeccoGibco</td> <td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de centrifugation QIAquick Ni-NTA</td><td>QIAGEN, Hilden, Allemagne</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&nbsp ; kDa</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Merck Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG à partir de sérum humain</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-092-257</td><td>RRID :</td></tr><tr><td>AB_871939 Souris IgG1, contrôle des isotypes kappa, conjugué à la phycoérythrine, clone MOPC-21 anticorps</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne</td><td>555749</td><td>RRID : AB_396091</td></tr><tr><td>Anticorps anti-HA-biotine, clone 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>12158167001</td><td>RRID : AB_390915</td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pennsylvanie, États-Unis</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Essai de cytotoxicité non radioactive</td><td>Promega, Mannheim, Allemagne</td><td>G1780</td><td>comprend une solution de lyse 10x, une solution de substrat (mélange de substrat et tampon de dosage) et une solution d’arrêt</td></tr><tr><td>Élévateur de cellules</td><td>Corning, Reynosa, Mexique</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de 10 cm</td><td>Corning, Oneonta, NY, États-Unis</td><td>430167 Boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>15 cm</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits, Fond en U</td><td>TPP, Trasadingen, Suisse</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits, fond plat</td><td>Neolab, Heidelberg, Allemagne</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Neolab, Heidelberg, Allemagne</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 12 puits</td><td>Neolab, Heidelberg, Allemagne</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>nerbe plus, Winsen/Luhe, Allemagne</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire T175</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & micro ; m filters</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

paramyxovirus pour tumeur ciblées immunomodulation : conception et évaluation ex vivo

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Immunothérapie des cancers réussie a le potentiel pour obtenir un contrôle tumoral à long terme. Malgré des succès cliniques récentes, il reste un besoin urgent de traitements sûrs et efficaces adaptés aux profils immunitaire de chaque tumeur. Virus oncolytiques permettent l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que l’expression des gènes de tumeur restreints. Ce protocole décrit l’analyse de génération et ex vivo des immunomodulateurs oncolytiques vecteurs. En se concentrant sur les virus de la rougeole vaccin encodage bispécifiques lymphocytes T recruteurs à titre d’exemple, la méthodologie générale peut être adaptée à d’autres espèces de virus et de transgènes. Le flux de travail présenté comprend la conception, clonage, sauvetage et la propagation des virus recombinants. Dosages pour analyser la cinétique de la réplication et l’activité lytique du vecteur, ainsi que des fonctionnalités de l’isolé immunomodulateur ex vivo sont inclus, ce qui facilite la génération de nouveaux agents de développement dans les modèles précliniques et finalement traduction clinique.

La figure 1 illustre le mécanisme d’action du virus de la rougeole oncolytiques encodage bispécifiques recruteurs de lymphocytes T. Un organigramme illustrant le flux de travail de ce protocole est présenté à la Figure 2. Figure 3 illustre un exemple d’un génome de virus de la rougeole oncolytiques modifiés. Cela fournit une représentation visuelle des changements spécifiques appliq...

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Cette méthode peut aider à relever les principaux défis dans le domaine de l’immunothérapie du cancer en facilitant le développement de vecteurs oncolytiques pour une immunomodulation ciblée. Le principal avantage du système génétique inverse appliqué est sa polyvalence; par conséquent, les vecteurs peuvent être adaptés pour répondre à diverses questions de recherche et cibler les tumeurs avec diverses signatures immunitaires. Les étapes de propagation du virus, en particulier la détermination du point de temps optimal pour la récolte du virus sont difficiles à apprendre d’un protocole texte, car la formation de syncytie doit être évaluée visuellement au fil du temps.Pour commencer la conception et cloner des vecteurs immunomodulateurs recombinants tels que décrits dans le manuscrit. Ce protocole décrit des étapes spécifiques pour la mise au point d’un vecteur oncolytique du vaccin antirougeoleux, codant une cellule T bispécifique engagée. Pour sauver le virus de la rougeole de l’ADNC, 24 heures avant la plaque de transfection, les cellules productrices du virus de la rougeole se sont uniformément accumulées sur une plaque murale de 6.Graine 200 000 cellules en 2 millilitres DMEM c

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Expansion ex vivo des cellules tumorales T-réactive par le moyen de 1/Ionomycin Bryostatine et la chaîne gamma commune cytokines Formulation

Nanoparticules virales végétales (VNPs) sont prometteurs plates-formes pour des applications dans le domaine biomédical. Ici, nous décrivons les procédures pour les installations VNP propagation, la purification, la caractérisation et la bioconjugaison. Enfin, nous montrons l'application de VNPs prise d'origine tumorale et d'imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris et l'imagerie de fluorescence.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

Source : Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxovirus pour l'immunomodulation ciblée des tumeurs : conception et évaluation ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).Ce vidéo montre un test cellulaire permettant d'évaluer l'activité immunomodulatrice spécifique à la cible d'un engageur bispécifique de lymphocytes T (BTE) codé par un virus. Le BTE relie les cellules tumorales exprimant un récepteur cible aux lymphocytes T, déclenchant la lyse tumorale et la libération d'enzymes. Une détection colorimétrique,...

Évaluation de l'activité immunomodulatrice d'un engageur de cellules T bispécifique codé par un virus

Cette vidéo présente un test de vaccination contre les tumeurs basé sur des cellules. Une souris, injectée par voie intradermique avec des cellules de mélanome B16-F10 pour la formation de tumeurs, est vaccinée avec des cellules B16-F10 sécrétant la cytokine Flt3L près de la tumeur développée. Le Flt3L sécrété par le vaccin favorise la maturation et la prolifération des cellules dendritiques qui présentent ensuite des antigènes tumoraux aux lymphocytes T des ganglions lymphatiques, déclenchant...

Implantation tumorale et injection d’un vaccin antitumoral dans un modèle murin

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Ce protocole décrit la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques et la digestion rapide des tumeurs pancréatiques murines fraîchement isolées. Après la digestion, les populations viables de cellules immunitaires peuvent être employées pour l'analyse plus en aval, y compris la stimulation ex vivo des cellules de T pour la détection intracellulaire de cytokine par cytométrie d'écoulement.

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Le protocole présente un modèle d’immunothérapie du cancer utilisant la vaccination tumorale cellulaire avec le mélanome B16-F10 exprimant Flt3L. Ce protocole démontre les procédures, y compris la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la croissance tumorale, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse par cytométrie en flux.

Modèle expérimental d’immunothérapie du mélanome utilisant la vaccination tumorale avec une cytokine hématopoïétique

Ce protocole décrit une méthode pour image résident-infiltration tumorale T CD8 cellules marquées avec des anticorps fluorescent couplés au sein de tranches de tumeur du poumon humain. Cette technique permet des analyses en temps réel de la migration des cellules T CD8 par microscopie confocale.

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

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