Name: Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Découvrez une méthode de localisation précise du locus coeruleus dans le cerveau de souris par immunohistochimie. Ce protocole permet d'analyser l'expression protéique et l'homéostasie des métaux pour étudier les troubles neurologiques.

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Nous remercions Abigael Muchenditsi pour l’entretien de la colonie de souris. Utilisation de l’Advanced Photon Source Argonne National Laboratory a été appuyée par le U.S. Department of Energy, Office of Science, Office d’énergie Sciences fondamentales, sous le numéro de contrat : AC02-DE-06CH11357. Nous remercions Olga Antipova et Dr Stefan Vogt pour assistance à l’utilisateur et l’aide à l’Advanced Photon Source. Ce travail a été financé par le National Institute of Health grant 2R01GM101502 de SL.

Études des animaux a été approuvé par Johns Hopkins University animalier et le numéro de protocole d’utilisation (ACUC) M017M385.
1. cerveau tranchage
<ol><li>Pour immobiliser, anesthésier les souris par l’application d’isoflurane 3 %.<ol>
<li>Imbibez un tampon d’ouate avec gouttes d’isoflurane et le placer dans un tube de microcentrifuge de 15 mL. Placer le nez de l’animal dans le tube et lui permettre d’inhaler l’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en l’absence de réponse à orteil-pincée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez l’animal sur le dos et immobiliser en épinglant les extrémités vers le bas avec une épingle de T tout en ayant accès à son abdomen.</li>
	<li>Couper l’animal avec des ciseaux chirurgicaux en faisant un snip de la peau abdominale et couper à travers la peau dans la région du thorax. Cerner la peau à l’aide de goupilles de T. Ensuite rompre la membrane péritonéale jusqu'à la cage thoracique. Exposer au cœur de fissuration de la cavité thoracique et le diaphragme de coupe.</li>
	<li>Couper l’oreillette droite pour permettre au sang de circuler hors de l’animal. Insérer une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 25 dans le ventricule gauche et perfuse avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). NOTE : Cela permet à la solution de couler à travers la circulation systémique et sortie par l’intermédiaire de l’oreillette droite.</li>
	<li>Retirer la seringue de 10 mL et insérer une aiguille de calibre 25, attachée à la seringue de 60 mL. Perfuse par le ventricule gauche avec 50 mL de paraformaldéhyde à 4 % froid glace (PFA).<ol>
<li>Préparer la glace froide 4 % PFA solution par dilution 10 % solution PFA en H2O et le refroidissement de la solution finale de PFA de 4 % à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoler la tête de la souris et enlever le cerveau du crâne.<ol>
<li>Couper la peau du cou et couper vers le regard d’exposer le crâne. Fendre le crâne de la nuque vers le nez et ensuite sur un globe oculaire à l’autre. Peler le crâne dehors et d’accise tout le cerveau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber le cerveau chez 4 % PFA pendant 24 h à 4 ° C.</li>
	<li>Transvaser le cerveau avec une pince dans un tube conique de 50 mL, rempli de 25 mL de solution de saccharose 30 %. Gardez-le à 4 ° C pendant 48 à 72 heures, jusqu'à ce que le cerveau coule au fond du tube.</li>
	<li>Couper le cerveau avec une trancheuse de cerveau de souris adultes coronale de matrice dans le mésencéphale (~ 3 mm postérieure de bregma). Garder la partie du cerveau contenant du tronc cérébral. Remarque : Cela se traduira dans deux sections de cerveau – contenant plus du cortex (partie antérieure de la coupe) et celui contenant le tronc cérébral/cervelet (partie postérieure de la coupe). Utilisez la section du tronc cérébral pour les étapes suivantes.</li>
	<li>Intégrer la section du tronc cérébral avec la surface de coupe placée sur le fond d’un moule encastrement, entouré par la température de coupe optimale composée (OCT) ; déplacer le cerveau intégré à un congélateur à-80 ° C et congeler pendant au moins 12 h – jusqu'à une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Coupe au cryostat : place l’enrobage moule contenant le cerveau en OCT dans le cryostat ; Il incuber dans le cryostat pendant plusieurs heures régler la température du bloc cerveau à celui du cryostat.</li>
	<li>Décollez le moule encastrement pour exposer le bloc OCT contenant le cerveau.</li>
	<li>Utiliser des lames de rasoir pour enlever l’excès d’OCT de la surface du bloc sans toucher le cerveau.</li>
	<li>Montez le bloc OCT sur le mandrin du cryostat, exposer la surface coupée du cerveau vers l’avant.</li>
	<li>Ajuster la surface coupée du cerveau afin qu’il est orienté parallèlement à des lames de rasoir le cryostat.</li>
	<li>Taillez le cerveau dès la médulla, coupe 100 µm sections rostralement.</li>
	<li>Garniture rostralement jusqu'à ce que le cervelet et le tronc cérébral coupé comme une tranche continue. Commencer à percevoir des tranches à 50 µm d’épaisseur. Remarque : Comme un galons rostralement du bulbe rachidien, le tronc cérébral et du cervelet coupera en deux sections distinctes. Dans les sections rostrales, le tronc cérébral et du cervelet fusionnera finalement au niveau du 4ème ventricule. Une fois les bords latéraux du 4ème ventricule sont bien formés, puis le cervelet et le tronc cérébral vont sortir comme une tranche continue.<ol>
<li>Recueillir les tranche de cerveau OCT-encerclé avec une pince et placez-le dans un puits d’une plaque de 24 puits rempli de PBS (Figure 2 a). Le LC sera plus importante lorsque le cervelet et le colliculus inférieur se rencontrer à ~-5.52 mm postérieure de bregma (Figure 1 b). Remarque : La partie la plus antérieure de LC disparaît une fois que le cervelet a été entièrement sectionné et entoure n’est plus le colliculus inférieur à ~-5.34 mm postérieure de bregma (Figure 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. immunohistochimie pour la Dopamine β-Hydroxylase ou de la Tyrosine Hydroxylase (Figure 2)
<ol><li>Jour 1<ol>
<li>Laver les tranches sélectionnés trois fois pendant 5 min dans du PBS.</li>
		<li>Permeabilize pendant 24 h à 0,5 % de solution saline tamponnée au phosphate avec un détergent (PBSD) à 4 ° C.<ol>
<li>Diluer 125 µL de détergent dans 25 mL de PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 2<ol>
<li>Laver les tranches trois fois pendant 5 min dans 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps primaire, les anti-DHP ou les anti-TH pendant 18 heures à une dilution de 1/500 à 0,5 % PBSD à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3<ol>
<li>Laver les tranches trois fois pendant 10 min dans 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Ajouter l’anticorps secondaire souhaitée (488 âne anti-lapin pour fluorescence verte) à une dilution de 1/1000 chez 0,5 % PBSD pendant 16 h.</li>
		<li>Enrouler la plaque 24 puits en aluminium et place à 4 ° C.</li>
		<li>Laver les tranches trois fois pendant 5 min dans 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Laver pendant 5 min dans du PBS.</li>
		<li>Transfert en tranches avec une brosse de crayon dans un récipient d’eau.</li>
		<li>Monter les tranches flottant dans l’eau sur les diapositives chargées.</li>
		<li>Lamelle couvre-objet sections avec supports de montage fixe (sans DAPI).</li>
		<li>Sécher les sections cerveau monté pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Tranches de cerveau d’image à un microscope confocal ou fluorescent avec paramètres pour détecter le signal de longueur d’onde de fluorophore anticorps secondaire approprié.</li>
		<li>Régler le microscope pour le plan focal de la tranche de cerveau et prendre une seule image à un grossissement de 10 X.</li>
		<li>Pour localiser une région LC possible dans la tranche de cerveau, utiliser le ventriculeth 4 d’orientation ; le cervelet est situé au-dessus du ventricule, pons et du tronc cérébral sont trouvent au-dessous de30.</li>
		<li>Pour localiser le code du travail, se concentrer sur les bords latéraux du 4ème ventricule ; la LC est originaire des bords de la 4ème ventricule et des points pour la protubérance / région du tronc cérébral (Figure 2 b, 2C).</li>
		<li>Suite à l’imagerie et la localisation de la LC dans certaines tranches de cerveau, stocker les diapositives contenant des tranches de cerveau à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. détection du code du travail dans des tranches de cerveau
<ol><li>Pour localiser la section du cerveau contenant le LC, tranchez le cerveau de souris comme décrit ci-dessus et collecter des sections dans du PBS remplie 24 cupules, comme illustré à la Figure 2 a.<ol>
<li>Placer une partie de cerveau / puits afin de permettre la localisation correcte du code du travail.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir un total de 48 tranches de cerveau qui sera immunocolorées par le cerveau. Remarque : Tous les puits des deux plats illustrés à la Figure 2 a contient des tranches de cerveau d’un animal.</li>
	<li>Réagissent chaque tranche de la troisième à la cinquième pour DHP, ou TH. Effectuer de préférence, immunohistochimie de ces tranches de cerveau qui sont adjacents à ceux qui sont analysés plus (par microscopie de fluorescence de rayons x, XFM). Remarque : Cette procédure permet la localisation exacte du code du travail dans les tranches de dosage final (Figure 2 a; étiquetés avec des nombres entre les puits).</li>
	<li>Ajuster le nombre de tranches de cerveau qui sont immunocolorées selon l’application, par exemple, si elles exigent l’emplacement exact du centre et du bord de la LC, ou juste une approximation.</li>
	<li>La suite de l’immunohistochimie, détecter des tranches de cerveau contenant LC via un modèle caractéristique d’expression sur les deux côtés du 4ème ventricule (Figure 2 b, 2C). Grossissement du signal DHP dans le LC des tranches de cerveau consécutives est illustré à la Figure 2d, 2e; l’image agrandie du code du travail qui est taché pour TH est illustré en Figure 2f.
</li>
	<li>Utilisez les sections adjacentes à ces LC contenant pour poursuivre ses études - dans ce cas pour XFM pour quantifier les concentrations de métaux (Figure 3).</li>
	<li>Pour exécuter XFM, recueillir des tranches de cerveau coronale mince 10-30 µm (selon la configuration) sur mince film polymère avec laquelle ils peuvent être montés sur des supports de l’échantillon et imagés au synchrotron.</li>
	<li>Coupes de cerveau de magasin qui sont préparés sur mince film polymère pour XFM à température ambiante et exécuter XFM.</li>
</ol>4. métal imagerie dans la LC via XFM
<ol><li>Tranchez le cerveau de souris exemple tel que décrit ci-dessus, déterminer les LC et mesurer les concentrations de métaux par l’intermédiaire de XFM de ces tranches de cerveau contenant la LC.</li>
	<li>Image élémentaires distributions sur beamline 2-ID-E à l’Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, Argonne IL).</li>
	<li>Enregistrer les données « à la volée » comme décrit plus haut31.</li>
	<li>Déterminer les concentrations élémentaires dans des tranches de cerveau contenant la LC en utilisant le programme cartes32,33.</li>
</ol>

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Orienter correctement le spécimen est une étape cruciale dans le présent protocole. Parce que nous utilisons des caractéristiques anatomiques de la surface dorsale du cerveau pour localiser LC (frontière entre le cervelet et le colliculus inférieur), il est important que les sections aligner correctement. Cela nécessite des soins pour fixer correctement le cerveau dans la matrice de trancheuse de cerveau de souris. Nous recommandons de couper ~ 500 μm tissu plus antérieur et postérieur à LC pour éviter le manque du noyau...

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The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Le locus coeruleus (LC) est une région importante dans le tronc cérébral et un important site de production de noradrénaline (na)1. Le LC envoie des projections dans tout le cerveau2 vers le cortex, l’hippocampe et le cervelet3 et régule les processus physiologiques majeurs, y compris le rythme circadien4,5, attention et mémoire6, insister sur7, les processus cognitifs8et émotion9,10. Dysfonctionnement de LC a été impliqué dans les troubles neurologiques et neuropsychiatriques11, y compris Parkinson maladie12,13,14, de la maladie d’Alzheimer14, dépression15 ,16,17, trouble bipolaire18,19et anxiété20,21,22,23, 24. compte tenu de ces rôles, l’analyse de LC est essentiel à l’étude de sa fonction ou la dysfonction.
Souris sont largement utilisés pour l’étude des processus physiologiques et physiopathologiques. En raison de leur petite taille, la souris LC a un diamètre moyen de ~ 300 μm, menant à mal à trouver la structure. Au cours de la coupe de cerveau, la LC peut facilement manquer dans les sections sagittales ou coronales. Les études disponibles décrivant l’identification de LC chez les animaux n’offrent pas un protocole étape par étape que non-spécialiste peut suivre1,25. Ainsi, pour donner des orientations pour la localisation de la LC, les auteurs décrivent un protocole que nous avons développées pour localiser cette région dans le cerveau de souris pour plusieurs applications (Figure 1, Figure 2, , Figure 3). Le protocole s’applique soigneusement contrôlées cerveau sectionnement et immunohistochemical détection de DHP26,27, ou alternativement TH24, les deux enzymes hautement enrichis dans le LC28. Une fois que LC est situé par immunohistochimie, tranches de cerveau adjacent peuvent être utilisés pour poursuivre ses études, y compris des analyses morphologiques et métaboliques, ainsi que des études d’imagerie metal via x-Ray fluorescence microscopy (XFM)29. Nous décrivons XFM à titre d’exemple dans ce protocole (Figure 3).

<table><tbody><tr><td>Matrice de découpeuse de cerveau de souris adulte</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 488 (source - âne)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre chargé</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Lames de coupe cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Mini, 9,5cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-dopamine &bêta ;-hydroxylase (DBH) - production interne (source - lapin)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-dopamine &bêta-hydroxylase (DBH) - disponible dans le commerce (source - lapin)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50ml</td><td>USA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forane (isofluorane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset Support de montage</td><td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multi-puits, 24 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (OCT)</td><td>VWR/ tissue tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)/ formol 10 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moules d’enrobage jetables</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td><td></td>crayon</tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Amazon</td><td>ASIN : B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>Spatules</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T pins</td><td>Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>Le cerveau de la souris en coordonnées stéréotaxiques, Paxinos et Franklin, 3e édition</td><td>Amazon</td><td>ISBN : 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (pour préparer PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH) (source - lapin)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Film mince ultralène pour préparation</td><td>d’échantillon XRF SPEX</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent grand champ</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

localisation du locus coeruleus dans le cerveau de souris

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Le locus coeruleus (LC) est un centre majeur de norépinéphrine produisant des neurones qui modulent un certain nombre de fonctions physiologiques. Des anomalies structurelles ou fonctionnelles de LC impact de plusieurs régions du cerveau, y compris le cortex, hippocampe et le cervelet et peuvent contribuer à la dépression, le trouble bipolaire, l’anxiété, ainsi que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Ces troubles sont souvent associés à déséquilibre métal, mais le rôle des métaux dans LC n'est que partiellement compris. Des études morphologiques et fonctionnelles de LC sont nécessaires pour mieux comprendre les pathologies humaines et la contribution des métaux. Les souris sont un modèle expérimental largement utilisé, mais la souris LC est petite (~0.3 mm de diamètre) et difficiles à identifier pour un non-spécialiste. Nous décrivons ici un protocole étape par étape l’immunohistochimie pour localiser la LC dans le cerveau de souris. Dopamine-β-hydroxylase (DBH) et, subsidiairement, tyrosine hydroxylase (TH), les deux enzymes fortement exprimées dans le LC, sont utilisés comme marqueurs immunohistochimiques dans des tranches de cerveau. Les sections adjacentes aux parties contenant les LC peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure, y compris histologie pour études morphologiques, tests métaboliques, ainsi que l’imagerie metal par microscopie de fluorescence de rayons x (XFM).

Changements dans l’homéostasie du métal (par exemple, Cu, Fe, Zn et Mn) sont souvent observés dans les troubles neurologiques, y compris les changements dans la LC34,35. Ainsi, la détermination des concentrations de métaux dans le cerveau est nécessaire pour la compréhension des mécanismes de la maladie. Les sections de cerveau générées à l’aide du protocole décrit peuvent être utilisées pour quantifier les concentrations de Cu et...

Le locus coeruleus est un petit amas de neurones impliqués dans divers processus physiologiques. Nous décrivons ici un protocole visant à préparer les sections de cerveau de souris pour l’étude des protéines et des métaux dans ce noyau.

Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Le dysfonctionnement du locus coeruleus a été impliqué dans les désordres neurologiques et neuropsychiatriques, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, la dépression, le désordre bipolaire, et l’inquiétude. Compte tenu de ces rôles, l’analyse du locus coeruleus est cruciale pour étudier sa fonction et son dysfonctionnement. Pendant la section du cerveau de souris, le locus coeruleus peut être facilement manqué dans les sections coronale ou sagittale en raison de sa petite taille.Ainsi, pour offrir des conseils pour la localisation du locus coeruleus, nous décrivons un protocole que nous avons développé pour localiser cette région dans le cerveau de la souris pour plusieurs applications. Commencez par placer le cerveau fraîchement isolé d’une souris anesthésiée, puis perfusée dans 4% PFA dans un tube de 50 millilitres. Incuber le cerveau pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.Utilisez des forceps pour transférer le cerveau dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 25 millilitres de solution de saccharose à 30 %. Incubez-le à quatre degrés Celsius pendant 48 à 72 heures jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce au fond du tube. Pour intégrer la section du tronc cérébral, placez sa surface coupée au fond d’un moule d’intégration et ajoutez un composé optimal de température de coupe pour entourer le tronc cérébral.Congeler le cerveau intégré dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant au moins 12 heures jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Placez le moule avec le cerveau dans le cryostat et incubez-le pendant plusieurs heures pour ajuster sa température à celle du cryostat. Pour exposer le bloc OCT contenant le cerveau, utilisez une lame de rasoir pour couper les quatre bords du moule tout le chemin vers le bas, puis peler le moule d’intégration de celui-ci.Utilisez des lames de rasoir pour éliminer l’excès d’OCT de la surface du bloc, en vous assurant de ne pas toucher le cerveau. Montez ensuite le bloc OCT sur le mandrin du cryostat, exposant la surface coupée du cerveau vers l’avant. Pour ajuster le cerveau, orientez la surface coupée parallèlement aux lames de rasoir du cryostat.Bien orienter le spécimen est une étape cruciale dans ce protocole. Parce que nous utilisons des caractéristiques anatomiques de la surface dorsale du cerveau pour localiser LC, comme la frontière entre le cervelet et colliculus inférieur, il est important que les sections soient alignées correctement. Cela nécessite des soins pour bien mettre le cerveau dans la matrice de trancheuse du cerveau de la souris.Couper le cerveau à partir de la médulle, en coupant 100 micromètres sections rostrally. Une fois que le cervelet et le tronc cérébral commencent à couper comme une tranche continue au niveau du quatrième ventricule, commencer à recueillir des tranches à 50 micromètres d’épaisseur. Utilisez des forceps pour recueillir chaque tranche de cerveau et la placer dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de PBS.Le locus coeruleus sera le plus visible dans une tranche où le cervelet et le colliculus inférieur se rencontrent à environ 5,52 millimètres postérieur de bregma. Le premier jour, lavez les tranches de cerveau dans la plaque de 24 puits trois fois pendant cinq minutes chacune dans PBS. Ajouter ensuite 0,5 % de PBS avec du détergent et les perméabiliser à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, laver les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune avec 0,5 % de PBSD. Ajoutez ensuite l’anticorps primaire à une dilution de 1 à 500 en 0,5%PBSD et incubez à quatre degrés Celsius pendant 18 heures. Le troisième jour, laver les tranches trois fois pendant 10 minutes chacune avec 0,5 % de PBSD, puis ajouter l’anticorps secondaire à une dilution de 1 à 1 000 en 0,5 % de PBSD.Envelopper la plaque de papier d’aluminium et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, laver les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune avec 0,5 % de PBSD, puis pendant cinq minutes en PBS. Couvrez les sections à l’aide d’un support de montage dur sans DAPI.Couvrir d’un couvercle en verre et sécher pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez un microscope confocal avec des paramètres pour détecter le signal de la longueur d’onde de fluorescence appropriée à l’image des tranches de cerveau. Après avoir ajusté le microscope au plan focal de la tranche du cerveau, utilisez 10 fois le grossissement pour prendre une seule image.Utilisez le quatrième ventricule situé sous le cervelet et au-dessus des pons et du tronc cérébral pour localiser une éventuelle région de LC dans la tranche du cerveau. Concentrez-vous sur les bords latéraux du quatrième ventricule et le LC sera situé à partir des bords du quatrième ventricule et pointant vers la région du tronc cérébral pons. La distribution intracellulaire de la bêta-hydroxylase de dopamine, une protéine exprimée dans le LC, a été évaluée utilisant ce protocole afin d’étudier la morphologie de LC et la densité neuronale.Une autre protéine exprimée dans le LC, hydroxylase de tyrosine, a également montré un signal fluorescent vert fort dans les tranches de cerveau contenant le LC.Les changements dans l’homéostasie en métal sont souvent observés dans les désordres neurologiques, y compris des changements dans le LC.In cet exemple, quand une tranche de cerveau découpée par le LC a été mesurée pour le phosphate, le potassium, le zinc, et le cuivre, seulement le cuivre a montré une augmentation spécifique du signal. Nous recommandons de couper environ 500 microns de tissu plus antérieur et postérieur à LC pour éviter de manquer le noyau, et de couper plus de sections que nécessaire, surtout si la première fois effectuer ce protocole. Une étude minutieuse des images de l’atlas cérébral avant la coloration est très utile.Une fois que LC est situé par immunohistochimie, les tranches adjacentes de cerveau peuvent être employées pour d’autres études, y compris l’analyse morphologique et métabolique, aussi bien que des études d’imagerie de métal par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence de rayon X. Les sections cérébrales générées à l’aide du protocole décrit peuvent être utilisées pour quantifier les niveaux de cuivre et d’autres métaux dans le LC et les comparer aux niveaux dans les régions en dehors du LC, ce qui est nécessaire pour comprendre le mécanisme de la maladie. D’autres applications possibles de ce protocole incluent la détection de l’abondance et de la distribution intracellulaire de la bêta-hydroxylase de dopamine, de l’hydroxylase de tyrosine, et d’autres protéines exprimées dans le LC individuellement, ou dans les analyses de co-coloration, des études de la morphologie de LC et de la densité neuronale.

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Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l'enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Source : Xavier, A. L. R., et al. Implantation de canule dans la citerne des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’une canule dans la citerne géante d’une souris anesthésiée. La technique consiste à guider une canule montée sur l’aiguille à travers la dure-mère dans la citerne triangulaire inversée magna et à la fixer pour une administration ciblée dans le liquide céphalo-rachidien.

Implantation d’une canule dans la citerne magna dans un modèle murin

Cette vidéo démontre l’enregistrement in vivo du potentiel de champ local (LFP) à partir de zones M2 bilatérales du cerveau de la souris. Une souris anesthésiée est fixée et préparée pour la procédure. Pour enregistrer les LFP, insérez des microélectrodes dans les coordonnées cibles des zones bilatérales M2, qui sont responsables de mouvements moteurs complexes.

Enregistrement du potentiel de champ local des deux hémisphères du cerveau de la souris

Ce protocole décrit l’utilisation de l’immunohistochimie pour identifier les régions du locus coeruleus dans des coupes de cerveau de souris. En ciblant la dopamine β-hydroxylase avec des anticorps marqués au fluorophore vert, les neurones producteurs de noradrénaline sont visualisés sous forme de fluorescence verte au microscope.

Immunohistochimie pour l’identification de la région du locus coeruleus dans des coupes de cerveau de souris

Cette vidéo démontre la coloration immunohistochimique des fibres cholinergiques dans le noyau basal de la région de Meynert de coupes de cerveau de souris. Les sections sont bloquées et traitées avec de l’acétyltransférase primaire contre la choline, suivie d’anticorps secondaires biotinylés. Des complexes avidine-biotine-peroxydase sont ajoutés, qui se lient aux anticorps secondaires, puis au substrat chromogène. Les coupes sont ensuite déshydratées et montées avant d’être visualisées au...

Coloration immunohistochimique des fibres nerveuses dans le noyau basal de Meyner du cerveau de souris

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Nous présentons l'enregistrement électrophysiologique in vivo du potentiel local de champ (LFP) dans le cortex moteur secondaire bilatéral (M2) des souris, qui peut être appliqué pour évaluer la latéralisation d'hémisphère. L'étude a révélé des niveaux modifiés de synchronisation entre le M2 gauche et droit chez les souris APP/PS1 par rapport aux témoins WT.

Évaluation de la latéralisation de l'hémisphère avec enregistrement potentiel de terrain local bilatéral dans le cortex moteur secondaire des souris

Pour vérifier si les effets trigéminaux sur la performance cognitive impliquent l'activité locus coeruleus, deux protocoles sont présentés qui visent à évaluer les corrélations possibles entre les performances et les changements de taille des pupilles liés à la tâche induits par la mastication. Ces protocoles peuvent être appliqués aux conditions dans lesquelles la contribution locus coeruleus est suspectée.

Évaluation des changements liés aux élèves dans l'excitation médiée par Locus Coeruleus suscitée par la stimulation trigéninale

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

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La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris implique généralement un accès par les os du crâne et est guidée par des repères du crâne. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative pour cibler le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la cisterna magna qui repose sur la visualisation directe des repères du tronc cérébral.

Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Découvrez une méthode de localisation précise du locus coeruleus dans le cerveau de souris par immunohistochimie. Ce protocole permet d'analyser l'expression protéique et l'homéostasie des métaux pour étudier les troubles neurologiques.

Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris

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