Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

C’est le premier article qui traite des problèmes techniques dans le séquençage de petits ARN dérivés de vésicules extracellulaires à partir de cellules. Les échantillons NGS nécessitent une préparation rigoureuse et un contrôle de la qualité rigoureux. En raison de la nature des VE, le processus qc des échantillons de VE s’écarte de la norme.

L’avantage de ce protocole est le QC étapes ci-dedans pour les utilisateurs pour la première fois. Junyi Su, assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, plaquez les cellules souches mésenchymales humaines à 2000 cellules par centimètre carré dans les médias msc frais dans cinq flacons T175.

Puis faire croître les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5% et remplacer le milieu tous les deux à trois jours, jusqu’à ce que cinq flacons de cellules confluentes à 90% sont obtenus. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 20 millilitres de PBS par flacon. Ajouter 20 millilitres de supports de collecte EV dans chaque flacon.

Et les incuber à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5% pendant 48 heures. Recueillir les médias et les centrifuger pendant 10 minutes à 300 g et quatre degrés Celsius. Ensuite, recueillir le supernatant, et centrifuger les médias pendant 20 minutes à 2000 g et quatre degrés Celsius.

Recueillir le supernatant à nouveau, et centrifuger les médias pendant 30 minutes à 15, 500 g et quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant pour la dernière fois. Ensuite, transférez les médias dans des tubes d’ultracentrifugeuse.

Un rotor à angle fixe 60Ti est utilisé ici, et la pastille sera ancrée sur le côté du tube. Marquez le côté du couvercle où la pastille est attendue, et dessinez un cercle sur le côté du tube où la pastille est attendue. Et pelleter les exARN pendant 90 minutes à 100 000 g et 4 degrés Celsius.

Après la centrifugation finale, retirer le supernatant. Utilisez de petits morceaux de papier absorbant pour sécher l’intérieur du tube sans toucher le fond du tube. Et puis inverser le tube sur un papier absorbant.

Pour résuspendre la pastille, ajouter 200 microlitres de PBS dans chaque tube, et vortex le tube pendant 30 secondes. Pipette de haut en bas 20 fois. Évaluez ensuite les vésicules extracellulaires et autres biomolécules à l’aide d’une analyse de suivi des nanoparticules.

Et stockez la pastille à moins-80 degrés Celsius jusqu’à d’autres expériences. Après le dégel des échantillons, utilisez une trousse d’isolation de l’ARN pour extraire l’ARN selon le protocole du fabricant. Elute l’ARN de la colonne fournie dans le kit d’isolation arn dans 100 microlitres d’eau sans RNAse.

Pour concentrer l’ARN à travers les précipitations d’éthanol, ajouter un microlitre de glycogène, 10 microlitres de pH-5,5 acétate de sodium bi molaire, et 250 microlitres d’éthanol pré-refroidi à 99 % en 100 microlitres de l’ARN purifié. Puis incuber les échantillons à moins-20 degrés Celsius pendant la nuit pour précipiter l’ARN. Pour granuler l’ARN, centrifugeuse pendant 20 minutes à 16 000 g et 4 degrés Celsius.

Ensuite, retirez le supernatant et lavez la pastille d’ARN avec un millilitre de 75 % d’éthanol. Centrifugeuse à nouveau pendant cinq minutes à 16 000 g et quatre degrés Celsius pour granuler l’ARN. Retirer l’éthanol et laisser le couvercle du tube d’ARN ouvert pendant cinq à dix minutes pour sécher à l’air la pastille d’ARN.

Resuspendez la pastille d’ARN dans sept microlitres d’eau sans RNAse, et utilisez une machine d’électrophoresis capillaire à base de copeaux pour détecter la qualité et la concentration de l’ARN. Pour commencer la construction de la bibliothèque, pipette cinq microlitres de l’ARN dans un tube PCR pré-refroidi de 0,2 millilitre. Ensuite, diluer 3'adaptateurs dans l’eau sans RNAse à un rapport de volume d’un à 10.

Ajouter 0,5 microlitres de l’adaptateur dilué dans le tube d’ARN, et pipette le mélange de haut en bas huit fois. Centrifugeuse brièvement pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Incuber le mélange d’adaptateur d’ARN à 70 degrés Celsius pendant deux minutes dans un cycleur thermique préchauffé.

Et puis placez l’échantillon sur le bloc réfrigéré. Ensuite, ajoutez un microlitre du tampon de ligature, 0,5 microlitres d’inhibiteur de RNAse, et 0,5 microlitres de la ligase d’ARN T4 dans le mélange d’adaptateur d’ARN. Pipette de haut en bas huit fois, et centrifugeuse brièvement.

Puis incuber le tube à 28 degrés Celsius pendant une heure dans le cycleur thermique préchauffé. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitres de la solution d’arrêt dans le tube d’échantillon, le tube restant dans le cycleur thermique. Pipette monter et descendre huit fois, et continuer à couver à 28 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Diluer les adaptateurs 5'dans de l’eau sans RNAse à un rapport volume d’un à 10. Ajouter 0,5 microlitres de l’adaptateur dilué dans un tube PCR séparé de 0,2 millilitre. Chauffer l’adaptateur 5'à 70 degrés Celsius pendant deux minutes.

Et puis placez l’échantillon sur le bloc réfrigéré. Ajouter 0,5 microlitres de 10 nanomol ATP et 0,5 microlitres de la ligase À ARN T4 au tube de 5 adaptateurs. Pipette monte et descend huit fois.

Et centrifugeuse brièvement pour recueillir tous les liquides dans le fond. Ensuite, ajoutez 1,5 microlitres du mélange 5'adaptateur dans l’échantillon d’ARN. Pipette huit fois très doucement, et incuber l’échantillon à 28 degrés Celsius pendant une heure.

Pour obtenir l’ADNC, diluez l’amorce de transcriptase inverse dans l’eau sans RNAse à un rapport de volume d’un à 10. Ajouter 0,5 microlitres de l’amorce diluée dans l’échantillon d’ARN, pipette huit fois très doucement, et centrifugeuse brièvement. Puis incuber l’ARN et le mélange d’amorce à 70 degrés Celsius pendant deux minutes dans le cycleur thermique préchauffé.

Et puis placez l’échantillon sur un bloc réfrigéré. Ensuite, ajoutez un microlitre de 5X First Strand Buffer, 0,5 microlitre de mélange DNTP de 12,5 milli molaires, 0,5 microlitre de TNT de 100 millimlaires, 0,5 microlitre d’inhibiteur du RNAse et 0,5 microlitres de transcriptase inverse dans le tube de l’échantillon. Pipette huit fois très doucement.

Et centrifugeuse brièvement. Incuber l’échantillon à 50 degrés Celsius pendant une heure dans le cycleur thermique préchauffé. Ensuite, ajoutez 4,25 microlitres d’eau ultrapure, 12,5 microlitres du mélange PCR, un microlitre de l’amorce de l’index et un microlitre de l’amorce universelle dans l’échantillon de l’ADNC.

Pipette de haut en bas huit fois, et centrifugeuse brièvement. Enfin, placez l’échantillon dans un cycleur thermique et installez le cycliste selon le manuscrit. Pour purifier la bibliothèque d’ARN, utilisez un fractionneur automatisé de taille d’ADN pour élucider les bandes entre 140 et 160 paires de base.

Exécutez la bibliothèque extraite sur une trousse de purification PCR à base de colonnes et élisez la bibliothèque en 10 microlitres d’eau sans RNAse. Pour vérifier la taille de la bibliothèque, chargez un microlitre de la bibliothèque purifiée sur une puce d’ADN et suivez le protocole du fabricant. Pour quantifier la concentration de la bibliothèque, diluez d’abord un microlitre de la bibliothèque purifiée en pH-8,0 Tris-Hcl de 10 millimolaires avec 0,05 % de polysorbate 20 à un rapport volume de 1 à 1 000.

Exécutez ensuite QPCR en utilisant les normes ADN de la trousse de quantification des bibliothèques commerciales. Enfin, mettre en commun des quantités égales des bibliothèques en fonction des exigences de la machine de séquençage, et séquencer sur un système de séquençage à haut débit. L’électrophéogramme des ARN extracellulaires comprenait un large éventail d’ARN.

En revanche, l’ARN cellulaire a montré des pics très distincts, correspondant à 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA, et 28SrRNA. La qualité des deux bibliothèques qui en a résulté était élevée et comparable. La répartition de la longueur des deux bibliothèques a montré un pic unique à 22 nucléotides, avec des corrélats avec des microARN.

En revanche, les bibliothèques des ARN extracellulaires étaient plus hétérogènes, et contenaient deux autres pics qui sont corrélés avec les ARN, les moitiés et les fragments, ou piARN. 65 % des lectures provenant de l’ARN cellulaire ont été cartographiées à des microARN humaines, et chacune des autres petites ARN ne représentait qu’une petite partie des lectures cartographiées. En revanche, seulement 8 % des ARN extracellulaires correspondaient aux microARN humains.

Les petits ARN les plus abondants auxquels les lectures cartographiées étaient des ARN, et les lectures inégalées correspondaient plus tard à des séquences bactériennes. Une comparaison avec le génome bovin a suggéré que FBS n’était pas une source de contamination. Par conséquent, les ARN extracellulaires présentent un profil atypique par rapport à l’ARN cellulaire normal.

La préparation de la bibliothèque est un élément crucial de ce protocole. Le mélange doit être fait très doucement pour éviter la formation de bulles. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier le profil des exARN provenant d’autres types de cellules, ce qui aide à étudier la fonction des exARN.