Name: Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez la transfection de macrophages par nanoparticules d'oxyde de fer recouvertes de polyéthylèneimine pour la livraison d'ARN interférents. Cette méthode permet un silenciage génique efficace in vitro et in vivo.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81772308) et le National clé de recherche et programme de développement de Chine (n° 2017YFA0205502).

Toutes les méthodes impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à l’animal soin et d’utilisent des lignes directrices de l’Université du Sud-est, en Chine.
1. préparation du PEI-SPIONs
<ol><li>
Préparation de l’acide oléique-modified SPIONs
	<ol>
<li>Dissoudre FeCl3•6H2O et FeSO4•7H2O dans l’eau sous la protection du N2.<ol>
<li>Ajouter 28 FeCl3•6H2O et 20 g de FeSO4•7H2O dans 80 mL d’eau désionisée dans un bécher. N2 introduire de l’eau dans une gaine de verre et remuer jusqu'à ce que la matière solide a dissous.</li>
			<li>Faire chauffer le mélange réactionnel à 72 ° C à un taux d’agitation de 800 tr/min, suivie par l’ajout de 40 mL d’ammoniaque eau (28 %). Remuez pendant 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajouter goutte 9 mL d’acide oléique dans la solution susmentionnée et remuez-le à 72 ° C pendant 3 h.</li>
		<li>Laisser refroidir la solution obtenue à la température ambiante (RT). Précipiter la solution par séparation magnétique.</li>
		<li>Laver le précipité contenant SPIONs 3 x avec alcool éthylique absolu et, ensuite, disperse le précipité dans 100 mL de N-hexane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de dimercaptosuccinique modifiés acide SPIONs
	<ol>
<li>Ajouter 800 mg d’acide oléique (OA)-modification SPIONs dispersées dans 200 mL de N-hexane, et 400 mg d’acide dimercaptosuccinique (DMSA) dispersées dans 200 mL d’acétone, dans une fiole de trois-cou dans un bain-marie à 60 ° C. Remarque : Pour déterminer la concentration de SPION OA modifiés obtenue à partir de l’étape précédente, prenez un petit volume (p. ex. 1 mL) de la dispersion de SPION, se volatiliser le N-hexane et peser la poudre qui en résulte.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de triéthylamine goutte à goutte dans la solution ci-dessus avec reflux et en remuant à 1 000 tr/min.</li>
		<li>Après 5 h en remuant et reflux, obtenir un précipité noir par séparation magnétique.</li>
		<li>Disperser les SPIONs hydrophiles dans l’eau désionisée homogène en ajustant le pH de la solution à l’aide d’hydroxyde de tétraméthylammonium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de PEI-SPIONs
	<ol>
<li>Solution colloïdale SPION DMSA modifié, ajouter quelques gouttes dans la solution de PEI (10 kDa) dans un ballon jaugé de 500 mL trois-cou sous agitation mécanique à 1 000 tr/min pendant 2 h (WFe: WPEI = 1:3). Remarque : La charge et la taille de PEI-SPIONs varient selon le ratio de WFe WPEI. Le WFe: rapport 1:3 WPEI peut être un bon point de départ pour la synthèse de PEI-SPIONs adaptés pour la livraison de siARN.</li>
		<li>Ajouter la solution résultante dans un tube d’ultrafiltration ayant un seuil de poids moléculaire de 100 kDa et d’une teneur de 15 mL ; Ensuite, la centrifugeuse à 5 400 x g pendant 10 min jusqu'à ce que le reste de la solution est de 1 mL. Ajouter de l’eau déminéralisée à la solution pour rendre le volume 15 mL à nouveau et répéter le processus ci-dessus 10 x pour obtenir le produit final. Ensuite, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm et stocker le produit final à 4 ° C.</li>
		<li>Déterminer la concentration de Fe de PEI-SPIONs par la méthode colorimétrique utilisant phénanthroline17. Diluer les PEI-SPIONs avec de l’eau désionisée stérile à une concentration de 1 mg Fe/mL et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Diluer 10 μL de la solution de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) à 1 mL avec de l’eau déionisée ; Testez ensuite sa taille hydrodynamique et le potentiel zêta par un dispositif de dispersion de la lumière dynamique. Remarque : Préparer des PEI-SPIONs dans la gamme d’environ 30 à 50 nm. Dans cette gamme de taille, l’effet de la taille du NP sur liaison siARN et la capture cellulaire ne semble pas être importante. PEI-SPIONs portant un potentiel zêta moyenne plus + 37 mV peut être toxique dans la gamme de doses pour la transfection, et un essai de cytotoxicité devrait être effectué pour assurer la sécurité. La charge superficielle et hydrodynamique taille des nanoparticules peuvent être commandés dans une gamme désirée en réglant le contenu de PEI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation et Gel d’agarose de PEI-SPION/siARN NPs
<ol><li>SiARN diluée avec de l’eau exempte de RNase pour donner une concentration finale de 20 μM (0,26 μg/μL).</li>
	<li>Préparer cinq tubes de microcentrifuge exempte de RNase marqués 0, 1, 2, 4 et 8. Les étiquettes représentent Fe : siARN différents rapports de poids. Pipette 3 μl de solution de siARN à tous les tubes (~0.8 μg de siRNA/tube).</li>
	<li>Ajouter 0, 0,8, 1.6, 3.2 et 6.4 μg de Fe sous forme de PEI-SPIONs aux tubes marqués 0, 1, 2, 4 et 8, respectivement. Garder le volume de l’échantillon total de chaque tube de moins de 20 μL. La composition de pipetage doucement verticalement.</li>
	<li>Incuber les mélanges à ta pendant 30 min pour permettre la formation d’un complexe PEI-SPION/siARN. Durant cette période, faire une agarose à 3 % gel d’agarose de haute pureté. Remarque : Autres PEI-SPION/siARN complexes avec les autres ratios de Fe : siARN (p. ex., 5 ou 6) peuvent être préparés et testés.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de 6 x tampon ADN-chargement par échantillon 5 μL et mélanger avec précaution. Chargez tous les échantillons et exécutez électrophorèse à 5 V/cm, jusqu'à ce que le bleu de bromophénol migre dans la mesure où les deux-tiers de la longueur du gel. Souillez le gel avec le bromure d’éthidium (EB) pendant 15-20 min. Remarque : Électrophorèse fraîchement préparés et solution EB devraient servir.</li>
	<li>Visualiser les bandes de siARN sous une exposition aux UV système d’imagerie. Vérifier les ratios Fe : siARN à laquelle siARN forme des complexes avec PEI-SPIONs et, par conséquent, les bandes représentant les siARN libre sont retardés ou non détectable.</li>
</ol>3. la transfection des Macrophages RAW264.7 In Vitro
<ol><li>Cellules de RAW264.7 de macrophage-comme la culture souris dans un plat de 10 cm à l’aide de DMEM complètent moyen contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) par 100 U/mL de pénicilline par 100 μg/mL de streptomycine à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.</li>
	<li>Un jour avant la transfection, aspirer moyen des cellules et les rincer avec une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine dans le plat de 10 cm. Trypsinize cellules RAW264.7 pour environ 5-10 min à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.</li>
	<li>Lorsque la majorité des cellules ont détaché (après 5-10 min), ajouter 5 mL de milieu complet DMEM au plat pour inactiver la trypsine. Pipette de haut en bas pour disperser des agrégats cellulaires dans des cellules individuelles.</li>
	<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à RT. enlever le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules avec 5 mL d’un milieu DMEM complet frais et compter les cellules non vides.</li>
	<li>Plaque 9 x 104 cellules par puits dans une plaque 6 puits avec 2 mL de milieu DMEM complet et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant environ 24 h. Remarque : Si vous utilisez une plaque de dimensions différentes, ajuster la densité de cellules plaqué au prorata de la superficie relative afin que les cellules atteignent la confluence de 80 % au moment de la transfection.</li>
	<li>Lorsque la confluence de la cellule est de 80 %, retirer le support des cellules et remplacez-la par 1 mL de milieu complet DMEM / puits. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que le PEI-SPION/siARN complexes ont été préparés et sont prêts à l’emploi (environ 30 min).</li>
	<li>Préparer des PEI-SPION/siARN complexes : calculer le montant de PEI-SPION/siARN complexes nécessaires pour une expérience de transfection. Dans un tube de microcentrifuge de RNase-libre 1,5 mL, mélanger une quantité appropriée de PEI-SPIONs avec siARN dans un rapport donné Fe : siARN. Par exemple, pour préparer le NPs de PEI-SPION/siARN contenant 100 µg de Fe à un ratio de Fe : siRNA de 4, ajouter 100 µL (1 mg Fe/mL), de PEI-SPIONs à 96 μL de siARN (0,26 μg/μL), puis en le mélangeant doucement avec une micropipette. Incuber 30 min à température ambiante. Remarque : Préparer un volume de PEI-SPION/siARN complexe qui est de 10 % supérieure à la masse totale et définitive pour tenir compte de toute perte accidentelle. Faire des complexes de PEI-SPION/siARN Fe : siARN faibles ratios, sous lequel des molécules de siARN sont complètement chargées dans le PEI-SPIONs et, par conséquent, de petites quantités de PEI-SPIONs peuvent être utilisées pour réduire au minimum la cytotoxicité potentielle. Expériences pilotes (analyse d’un retard de gel) pour l’optimisation du ratio Fe : siARN sont nécessaires.</li>
	<li>Retirez la plaque de 6 puits de l’incubateur (étape 3,7). Ajouter un volume requis du complexe de PEI-SPION/siARN goutte à chaque puits et agiter la plaque avec prudence afin d’assurer une répartition uniforme. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que l’évaluation de la cellulaire absorption ou gène knockdown efficacité (d 1-3). Remarque : Les macrophages transfection avec PEI-SPION/siARN à une concentration de ~ 15 μg Fe/mL peuvent maximiser l’efficacité de transfection tout en minimisant la cytotoxicité potentielle.</li>
</ol>4. systémique administration d’ARNsi aux Macrophages chez les Rats avec l’arthrite expérimentale
<ol><li>Obtenir des rats Wistar mâles exempts d’agents pathogènes spécifiques qui sont âgés de 7 semaines. Habituer les rats pour 7D avant utilisation et leur fournir de l’eau et de nourriture suffisante. Induire l’arthrite adjuvant (AA) chez les rats comme décrit précédemment18.</li>
	<li>Préparer des PEI-SPION/siARN complexes comme indiqué au point 3.8.</li>
	<li>Injecter les PEI-SPION/siARN NPs (0,3 mg de siRNA/kg) dans l’AA rats via la veine caudale. Évaluer l’absorption cellulaire via, par exemple, cytométrie en flux, tissu biodistribution via, par exemple, une fluorescence en temps réel système, d’imagerie ou d’effets thérapeutiques basé sur, par exemple, les cliniques, histologiques et radiographique les analyses au moment désiré points18. Remarque : Pour les études de biodistribution cellulaire et tissulaire, traiter les rats avec une seule injection de la SNPP désirée ; pour les études thérapeutiques, injecter les rats avec les NPs est testé 1 x par semaine pendant trois semaines consécutives.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les macrophages sont réfractaires à transfecter par des approches nonviral couramment utilisées, telles que l’électroporation, liposomes cationiques et espèces de lipides. Ici, nous avons décrit une méthode fiable et efficace pour transfecter macrophages avec siARN. En utilisant le présent protocole, plus 90 % des macrophages RAW 264.7 cellules (Figure 2 b) et le rat macrophages péritonéaux18 peut être transfectées avec les siARN sans dégradation notable de la viabili...

Les macrophages sont un type de cellules immunitaires innées, distribué dans tous les tissus de l’organisme, mais dans des quantités différentes. En produisant une variété de cytokines et d’autres médiateurs, ils jouent un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre l’invasion des pathogènes microbiens, à la réparation des tissus après une blessure et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire1. En raison de leur importance, les macrophages ont continuellement fait l’objet de recherches intensives. Cependant, malgré sa prévalence dans la régulation des gènes et des études de fonction, siARN-mediated gene silencing est moins susceptible de réussir dans les macrophages, parce que ces cellules — en particulier, les macrophages primaires — sont souvent difficiles à transfecter. Ceci peut être attribué à un degré relativement élevé de toxicité associé à des approches plus bien établies de transfection dans lequel la membrane cellulaire est chimiquement (par exemple, avec des polymères et des lipides) ou physique (p. ex., par électroporation et canons de gène) perturbé pour laisser les siARN molécules traversent la membrane, réduisant ainsi considérablement viabilité2,3 des macrophages. En outre, les macrophages sont des phagocytes dédiés riches en enzymes de dégradation. Ces enzymes peuvent endommager l’intégrité des siARN, affaiblissement de l’efficacité de son silencieux même si gène-spécifique siARN a été remis dans la cellule3,4. Par conséquent, un système d’administration des siARN efficaces axés sur les macrophages a besoin pour protéger l’intégrité et la stabilité des siARN au cours de la livraison4.
Il est de plus en plus évident que les macrophages dysfonctionnels sont impliqués dans l’apparition et la progression de certains troubles cliniques courants comme les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Pour cette raison, en modulant la fonction des macrophages avec, par exemple, siRNA, a été en train de devenir une méthodologie attrayante pour le traitement de ces troubles5,6,7. Si beaucoup de progrès ont été accompli, un enjeu majeur de la stratégie de traitement fondées sur des siARN est la spécificité cellulaire pauvre de siARN systématiquement administré et l’absorption de siARN insuffisante par les macrophages, qui par conséquent conduire à des effets secondaires indésirables. Par rapport aux thérapies de libre d’acide nucléique qui manquent généralement de sélectivité cellulaire optimale et conduisent souvent à des effets indésirables, chargé de drogue nanoparticles (NPs), en raison de leur propension spontanée d’être capturé par le système réticulo-endothélial, hors cible peut être conçue pour le ciblage passive à macrophages en vivo, permettant une meilleure efficacité thérapeutique avec des effets secondaires minimes8. Courants NPs explorés pour l’administration de molécules d’ARN incluent nanocarriers inorganiques et liposomes divers polymères9. Parmi eux, polyéthylèneimine (PEI), un type de polymères cationiques lier et condensation des acides nucléiques dans NPs stabilisées, montre l’ARN plus haut livraison capacité9,10. PEI protège des acides nucléiques de la dégradation enzymatique et non-enzymatique, médiatise leur transfert à travers la membrane cellulaire et favorise leur libération intracellulaire. Bien qu’initialement présenté comme un réactif de livraison de l’ADN, PEI a été démontré par la suite pour être une plate-forme attrayante pour in vivo ARNsi, soit localement ou de manière systématique9,10.
Nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer (SPIONs) ont montré de grandes promesses en biomédecine, en raison de leurs propriétés magnétiques, de biocompatibilité, de taille comparable aux objets biologiquement importants, surface-surface-à-volume élevé et facilement adaptable surface pour ètre pièce jointe11. Par exemple, en raison de leur utilité potentielle comme agent de contraste et une absorption rapide par les macrophages, SPIONs ont émergé comme un outil clinique préféré à l’image de macrophages tissulaires12. Alors que SPIONs ont également été largement étudiées sous la forme d’acide nucléique livraison véhicules11,13,14,15, à notre connaissance, la littérature contienne peu de rapports de SPIONs comme un support pour ARNsi axés sur les macrophages. Pour la livraison de gène de SPIONs, leur surface est généralement recouvert d’une couche de polymères cationiques hydrophiles sur lequel des acides nucléiques chargés négativement peut être électrostatiquement attirés et attachés. Nous présentons ici une méthode de synthèse de SPIONs dont la surface est modifiée avec faible poids moléculaire (10 kDa), PEI ramifié (PEI-SPIONs). Ces nanoplatforms magnétiques travaillent alors à se condenser siRNA, formant des complexes de PEI-SPION/siARN qui permettent le transport de siARN dans la cellule. Nous avons raison cette phagocytose spontanée de SPIONs par les cellules du système réticulo-endothélial16, associée à la forte capacité de liaison et condensation des acides nucléiques par PEI, rend PEI-SPIONs adapté pour le transport efficace des siARN dans macrophages. Les données présentées ici confirment la faisabilité de PEI-SPION/siARN-mediated gene silencing dans les macrophages en culture ainsi qu’in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Warm en 37&d° ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine (1,5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage MTS à base de tétrazolium</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Pour l’analyse de cytotoxicité</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire RAW 264.7</td><td>Banque de cellules de l’Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire (6 puits)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire (10 cm)</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Tubes sans RNase (1,5 ml)</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (15 ml)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Rats Wistar</td><td>Centre animalier expérimental de Shanghai Academy of Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacille Calmette&ndash ; Gu&eacute ; Poudre lyophilisée de rin</td><td>National Institutes for Food and Drug Control, Chine</td><td></td><td>pour l’induction de l’arthrite adjuvante chez le rat</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (Shanghai, Chine)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (Guangzhou, Chine)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylèneimine (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>Eau ammoniacale</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&bull ; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull ; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Acide dimercaptosuccinique</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>tube d’ultrafiltration</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>solution d’hydroxyde de tétraméthylammonium</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>Analyseur de taille de particules et de potentiel zêta</td><td>Malvern, Angleterre</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoparticules de polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits arn interférents à macrophages in vitro et in vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

En raison de leur rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires, les macrophages ont constamment fait l’objet de recherches intensives et représentent une cible thérapeutique prometteuse dans plusieurs maladies, telles que les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Silençage génique véhiculée par Arni est une approche utile de choix de sonde et de manipuler la fonction des macrophages ; Toutefois, la transfection des macrophages avec siARN est souvent considéré comme pour être techniquement difficile et, à l’heure actuelle, il existe quelques méthodes dédiés au transfert de siARN aux macrophages. Nous présentons ici un protocole d’utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique polyéthylèneimine-enduit (PEI-SPIONs) comme un véhicule pour l’administration ciblée d’ARNsi aux macrophages. PEI-SPIONs sont capables de liaison et de condensation complètement siARN lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dessus. In vitro, ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement siRNA dans les macrophages primaires, ainsi que dans la lignée cellulaire de type macrophages RAW 264.7, sans compromettre la viabilité des cellules à la dose optimale pour la transfection, et, en fin de compte, ils induisent induite par le siARN cible silençage génique. Outre utilisé pour in vitro transfection de siARN, PEI-SPIONs sont un outil prometteur pour la livraison des siARN à macrophages in vivo. Compte tenu de ses caractéristiques combinées de propriété magnétique et capacité de gène-baffle, systématiquement administré PEI-SPION/siARN particules devraient non seulement pour moduler la fonction de macrophage, mais aussi pour activer les macrophages à être photographié et suivies. En substance, PEI-SPIONs représentent une plate-forme nonviral simple, sûre et efficace pour la livraison de siARN aux macrophages in vitro et in vivo.

La taille et zeta potentiel de PEI-SPIONs préparé avec ce protocole étaient de l’ordre de 29 à 48 nm (indice de polydispersité : 0,12 - 0,23) et 30 à 48 mV, respectivement. Ils étaient stables dans l’eau à 4 ° C pendant plus de 12 mois sans agrégation évidente. Afin d’évaluer leur siARN capacité de liaison, PEI-SPIONs étaient mêlés siARN à divers rapports de poids Fe : siARN. La figure 1 montre que lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dess...

Les auteurs décrivent une méthode d’utilisation polyéthylèneimine (PEI)-enduit superparamagnetic iron oxide nanoparticules pour la transfection des macrophages avec siARN. Ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement des siARN d’expression du gène cible in vitro et in vivo et silence macrophages.

Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Cette mesure peut aider à répondre aux questions clés. Dans le domaine de l’humanologie. Cette réponse dans la fonction des macrophages dans la fin physiologique des conditions pathologiques.Le principal avantage de cette technique est que la polyéthylène est enduite peut efficacement in vitro sans compromettre la cellule. Sous des doses optimales. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie et le diagnostic de beaucoup de désordres inflammatoires chroniques et cancers.Où les macrophages jouent un rôle essentiel dans la pathogénie. La démonstration de la procédure sera Na Jia. Un étudiant diplômé de mon labo.Et Kaixuan Wang, un étudiant diplômé du laboratoire du Dr Xiaohua. Pour préparer l’acide allylique modifié nanoparticules d’oxyde de fer super paramagnetic ou SPION d’abord ajouter 28 grammes d’hexahydrate de chlorure pharas. Et 20 grammes de pharas autoate heptahydrate à un bécher contenant 80 millilitres d’eau déionisée.Et utiliser un conduit de verre pour introduire de l’azote dans la solution. Remuer jusqu’à ce que la matière solide soit dissoute. Chauffer le mélange de réaction à 72 degrés Celsius en remuant à 800 rotations par minute.Et ajouter 40 millilitres d’eau ammoniaque à 28% au bécher. Après cinq minutes ajouter neuf millilitres d’acide allylique goutte sage. Et maintenir le mélange à 72 degrés Celsius pendant trois heures avec agitation continue.À la fin de l’incubation refroidir la solution résultante à la température ambiante. Et précipiter le mélange par séparation magnétique selon les protocoles standard. Lavez ensuite le SPION contenant du précipité trois fois avec de l’alcool éthylique absolu.Et asperse le précipité en 100 millilitres de n-hexane. Pour préparer l’acide acrylique dimercapto modifié SPION ajouter 800 milligrammes de l’acide allylic modifié SPION. Dispersés en 200 millilitres de n-hexane et 400 milligrammes d’acide acrylique dimercapto dispersés en 200 millilitres d’acétone dans un flacon à trois cous dans un bain d’eau à 60 degrés Celsius.Ajouter ensuite 200 microlitres de triethylamine goutte sage à la fiole avec agitation à 1000 rotations par minute et reflux. Un précipité noir peut être obtenu par séparation magnétique après cinq heures. Ensuite, utilisez l’hydroxyde de tétraméthylammonium pour ajuster le pH de la solution pour la dispersion homogène des SPION hydrophiles dans l’eau déionisée.La polyéthylènemine dégénérée enduite SPION’s ajouter l’acide acrylique dimercapto modifié spion solution colloïdale tomber sage dans une solution de polyéthylènemine de 10 kilodalton. Dans un flacon à trois cous de 500 millilitres sous agitation mécanique à 1000 rotations par minute pendant deux heures. À la fin de l’incubation ajouter la solution résultante à un tube de filtration ultra avec un poids moléculaire coupé de 100 kilodaltons et une teneur de 15 millilitres.Centrafuse l’échantillon jusqu’à ce que la solution restante atteigne un volume d’un millilitre. Ajouter de l’eau déionisée à la solution pour ramener le volume à 15 millilitres. Et centrafuse et réhydrater la solution dix fois de plus comme vient de le démontrer.Filtrez ensuite la solution à travers un filtre de 22 microns pour le stockage à quatre degrés Celsius. Pour préparer les nanoparticules de siRNA, ajoutez d’abord trois microlitres de solutions de siRNA de 20 micromolaires fraîchement préparées à cinq tubes microcentroafufusés libres d’ARN étiquetés. Et ajouter 0, 8, 1,6, 3,2 et 6,4 microgrammes de polyéthylènemine SPION à des tubes étiquetés zéro, un, deux, quatre et huit respectivement.Après le mélange avec le pipetting doux, incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux complexes de siRNA de spion de polyéthylènemine de se former. Et préparer un gel agarose de trois pour cent avec i pureté agarose. À la fin de l’incubation, ajouter un microlitre de tampon de chargement d’ADN de 6 X par cinq microlitres d’échantillon à chaque tube et mélanger soigneusement.Ensuite, chargez tous les échantillons sur le gel. Et faire fonctionner l’électrophorèse à cinq volts par centimètre. Jusqu’à ce que le colorant bleu bromophénol migre deux tiers de la longueur sur le gel.Un jour avant la transfection laver un microphage de souris comme RAW264.7 culture cellulaire avec PBS. Et traiter les cellules avec un millilitre de 25% trypsine pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Lorsque la majorité des cellules se sont détachées.Inactivez la trypsine avec cinq millilitres de DMEN complet. Puis pippete la solution à plusieurs reprises pour disperser les grappes cellulaires. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conackel stérile de 15 millilitres pour centrifugation.Puis suspendre à nouveau les cellules en cinq millilitres de DMEN complet frais pour le comptage. Diluer les cellules à 4,5 fois dix à la quatrième cellule par millilitre de concentration complète de DMEN. Et ajouter deux millilitres de milieu à chaque puits d’une plaque de six puits pour une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire.Le lendemain, préparez le rapport approprié de nanoparticules de polyéthylènemine SPION siRNA dans un tube de microcentrifugeuse de flux d’ARN de 1,5 millilitre avec mélange doux comme nous venons de le démontrer. Et ajouter le volume approprié de polyéthylènemine SPION siRNA complexe de nanoparticules à chaque puits qui a été remplacé par un millilitre de milieu frais. Préparer polyéthylènemine SPION si complexes.dans ce cas, beaucoup plus de mois de polyéthylènemine SPION peuvent être utilisés minimisant ainsi leur toxicité potentielle. Puis faites tourbillonner soigneusement la plaque pour obtenir une distribution uniforme des nanoparticules à travers le fond du puits. Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que la mise à jour cellulaire subséquente ou l’analyse de l’insuffisance de renversement de gène.Polyéthylènemine SPION avec un potentiel zeta de 30,5 et 37 millivolts ne présentent pas une toxicité cyto apparente à des concentrations jusqu’à 30 microgrammes de fer par millilitre. Ce qui est environ deux fois la location que la concentration normalement utilisée pour la transfection cellulaire. Le potentiel zeta de Polyethyleneimine SPION de 48 millivolts est cependant toxique.Même à la dose la plus basse examinée. Tel qu’analysé par cytométrie d’écoulement, plus de 90% des cellules peuvent être transfectées avec des complexes de siRNA polyéthylènemine SPION étiquetés fluorescentement à 15 microgrammes de fer par millilitre. L’évaluation des effets des concentrations de siRNA spion de polyéthylènemine sur l’internalisation cellulaire en écrasant la coloration bleue indique la coloration minimalement détectable à 7,5 microgrammes de fer par millilitre.Mais des taches clairement visibles à 15 microgrammes de fer par millilitre qui n’augmentent pas à des concentrations plus élevées de fer probablement en raison de la saturation d’absorption de siRNA de polyéthylèneeimine SPION. Les macrophages péritonéaux transfectés avec le SPION de polyéthylènemine hébergeant le siRNA spécifique montrent une diminution significative des niveaux d’ARNm de targe comparés au siRNA non spécifique. Suggérant que siRNA peut échapper aux vésicules endocytiques dans le cytoplasme pour atteindre les machines d’interférence d’ARN.Plus loin, après l’injection intraveineuse d’une seule dose de polyéthylène SPION siRNA complexes de nanoparticules flocentimetrical analyse de CD11b cellules positives et CD3 révèle une absorption plus efficace des nanoparticules par CD11b exprimant macrophages que par cd3 cellules positives à tout moment dans tous les organes examinés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer la polyéthylènemine SPION avec un potentiel moyen de données ne pas plus de 37 millivolts et de préparer les complexes polyéthylènemine SPION siRNA sur les faibles ratios fer à siRNA. Cette technique compare la nécessité pour les chercheurs d’explorer le potentiel thérapeutique de cibler le macrophage dans les moteurs animaux de maladies humaines telles que le cancer.

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Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal

Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

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